Name: absorbent microbiopsy sampling and rna extraction for minimally invasive, simultaneous blood and skin analysis
Uploaded: 2019-02-21T12:30:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis at JoVE.com

हम एनएचआरसी फैलोशिप APP1109749 और APP1111216, क्वींसलैंड के विश्वविद्यालय के सौ साल के छात्रवृत्ति और अंतरराष्ट्रीय स्नातकोत्तर अनुसंधान छात्रवृत्ति को स्वीकार करना चाहते हैं ।

<ol>
	<li>Wang, C. Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+minimally+invasive+skin+sampling+techniques?+A+bright+scientific+future.">Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).</li><li>Kirstein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+invasive+microbiopsies:+a+novel+sampling+method+for+identifying+asymptomatic,+potentially+infectious+carriers+of+Leishmania+donovani.">Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani.</a> International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).</li><li>Lin, L. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+microbiopsy+for+HPV+DNA+detection+in+cutaneous+warts.">Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts.</a> Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).</li><li>Sobarun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiopsy+Biomarker+Profiling+in+a+Superficial+Melanoma+Resembling+a+Pigmented+Basal+Cell+Carcinoma.">Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma.</a> JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).</li><li>Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. 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GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating &amp;#34;Unknown&amp;#34; Concentrations using a Standard Curve Available from: <a target="_blank" href="https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/">https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/</a> (2018)</li><li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).</li><li>Goni, R., Garc&#237;a, P., Foissac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GraphPad Statistics Guide. , (1995).</li><li>Goldstein, N. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Methodology+for+Sequential+Extraction+of+RNA+and+Protein+from+Small+Human+Skin+Biopsies.">Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).</li></ol>

हित का कोई टकराव घोषित नहीं किया.

इन परिणामों का प्रदर्शन है कि शोषक microbiopsy सरल और न्यूनतम इनवेसिव आणविक लक्षण वर्णन के लिए त्वचा और रक्त मिश्रण के नमूने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार डिवाइस आवेदन अन्य आवेदन प्रोटोकॉल (चित्रा 3) के साथ बरामद आरएनए राशि में अंतर से दिखाया गया के रूप में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । नमूना निकाले जाने के बाद, rna निष्कर्षण के लिए अनुवर्ती नमूना संसाधन चरण अत्यधिक स्थापित प्रोटोकॉल15,16के समान है । आरएनए निष्कर्षण में प्रारंभिक कदम है कि शोषक microbiopsy के लिए संशोधित कर रहे हैं के अलावा, एक और महत्वपूर्ण परिवर्तन rnase मुक्त पानी का उपयोग करने के लिए बहाव अनुप्रयोगों के लिए परिणामों में सुधार है. इसके अलावा, यह उल्लेख है कि इस अध्ययन में प्रयुक्त संदर्भ जीन RPLP0है लायक है । RPLP0, जिसका समारोह में अच्छी तरह से विभिंन सेल और ऊतक प्रकार के लिए जाना जाता है17, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर और पूर्ववर्ती घावों18में उपयोग के लिए एक उपयुक्त संदर्भ जीन के रूप में सूचित किया गया है ।
डिवाइस की मुख्य सीमाओं में से एक डिवाइस है, जो समय लेने वाली है और संभावित रूप से rna जैसे संवेदनशील नमूनों के लिए नमूना नुकसान की संभावना बढ़ जाती है से microbiopsy के हटाने है । फिर भी, इस मुद्दे को पूर्व ठंडा करने से दूर किया जा सकता है सभी बाँझ प्रसंस्करण उपकरण, जैसे 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, सूखी बर्फ पर.
शोषक microbiopsy का उपयोग सरल है और गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. पारंपरिक बायोप्सी आवश्यक नहीं है के रूप में microbiopsy जैसे आरटी-qpcr के रूप में स्थापित आणविक निदान तकनीकों के साथ आणविक लक्षणन परमिट. आगे यों तो और शोषक microbiopsy के नमूने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, पिछले साहित्य है कि मानव त्वचा ऊतक से शामिल आरएनए निष्कर्षण की जांच की थी । एक ठेठ ३.० या ४.० मिमी त्वचा पंच बायोप्सी से, तीन अध्ययनों से निकाली गई आरएनए मात्रा से लेकर ५० तक की त्वचा ऊतक के प्रति मिलीग्राम २०० एनजी की सूचना दी है19,20,21. आरएनए के १.४३ एनजी के साथ तुलना करना है कि औसत पर शोषक microbiopsy से बरामद किया गया था (चित्रा 3), नमूना त्वचा ऊतकों का वजन 0.29-115 μg एक ही आरएनए-से-ऊतक अनुपात के आधार पर त्वचा पंच बायोप्सी अध्ययन से सीमा की उंमीद है ।
यह प्रोटोकॉल संभावित नुकसान के बिना नहीं है, हालांकि कुछ समस्याओं को आसानी से दूर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आरएनए निष्कर्षण डेटा ने 10-एस होल्डिंग समय (चित्रा 3) के साथ भी काफी भिन्नता का सुझाव दिया । समस्या को हल करने के लिए, एक संभावित समाधान अनुप्रयोग प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़िंग शामिल है । इस तरह की त्वचा के लिए लागू बल और समय धारण के रूप में मानकों का परीक्षण किया जाना चाहिए और नमूना निष्कर्षण में भिन्नता को कम करने के लिए अनुकूलित. अन्य संभावित मुद्दा नमूना अखंडता और वसूली को प्रभावित हो सकता है, जो डिवाइस से microbiopsy के हटाने है. हालांकि आरएनए निष्कर्षण के लिए microbiopsy हटाने एक प्रभावी दृष्टिकोण है, पूरी प्रक्रिया थकाऊ है, और नमूना प्रक्रिया में संदूषण के संपर्क में हो सकता है । इसलिए, नमूना प्रक्रिया प्रोटोकॉल का संशोधन अत्यधिक नमूना अखंडता को सुनिश्चित करने और नमूना हानि को रोकने के लिए वांछित है ।
एक बार उपरोक्त दो मुद्दों को संबोधित कर रहे हैं, यह डिवाइस नैदानिक अनुसंधान के लिए एक मानक उपकरण बन जाएगा कि उम्मीद है. यह ध्यान रखें कि डिवाइस दोनों त्वचा और रक्त नमूना एक साथ कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए. अंत में, इस प्रोटोकॉल संयुक्त त्वचा और रक्त नमूनाकरण और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए बाद में नमूना प्रसंस्करण के लिए एक आसान और न्यूनतम इनवेसिव उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy प्रदर्शन के विवरण का वर्णन.

त्वचा बायोप्सी त्वचा के नमूने और हिस्टोथोलॉजिकल मूल्यांकन के माध्यम से त्वचा रोगों के बाद के निदान के लिए त्वक् विज्ञान में सबसे आवश्यक तकनीकों में से एक है । बायोप्सी तकनीक परीक्षा1के लिए रोगी की त्वचा पर संदिग्ध घाव को दूर करने के लिए एक ब्लेड या पंच बायोप्सी का उपयोग कर एक चिकित्सा पेशेवर शामिल है । हालांकि तकनीक प्रभावी है, यह उच्च आक्रामक है और अंत बिंदु के रूप में नैदानिक अनुसंधान सीमा आमतौर पर आणविक जीव विज्ञान तकनीकों2,3शामिल है । त्वचा रोगों के आणविक विश्लेषण में अत्यधिक विशिष्ट जैविक जानकारी प्रदान करने की क्षमता होती है जो कि हिस्टोपोथोलॉजिकल विश्लेषण नहीं कर सकता है, इस प्रकार दवा खोज और रोग निदान4,5को सुविधाजनक बनाने में । इसके अलावा, सबसे आणविक तकनीकों में नमूना मांग अपेक्षाकृत छोटी है और पशुओं के उपयोग में कमी करने के लिए नेतृत्व और replicates की एक बड़ी संख्या की अनुमति हो सकती है । इसलिए, एक वैकल्पिक तकनीक के लिए एक स्पष्ट आवश्यकता है जो नैदानिक अनुसंधान में आणविक विश्लेषण को सक्षम बनाती है और प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करती है ।
क्षेत्र में ऐसी जरूरत को संबोधित करने के लिए, हमारे समूह ने एक उपन्यास microneedle आधारित नैदानिक मंच, शोषक microbiopsy, कि एक सरल और न्यूनतम आक्रामक तरीके से6में रक्त के साथ मिश्रित त्वचा की एक छोटी राशि के संग्रह में सक्षम बनाता है विकसित की है । इस प्रकाशन का उद्देश्य नैदानिक अनुसंधान में आरएनए निष्कर्षण के माध्यम से आणविक विश्लेषण की सुविधा के लिए एक नमूना उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy का वर्णन है.
पहले, हम microbiopsy के पहले संस्करण का वर्णन किया है, त्वचा microbiopsy, जो एक microneedle एक तीन परत स्टील प्लेट डिजाइन से बना के होते हैं त्वचा के ऊतकों के छोटे टुकड़े को निकालने के लिए7. इस उपकरण की नवीनता microneedle से कई संपर्क अंक से आता है कि कुशल ऊतक निष्कर्षण3परमिट । इसके विपरीत, एक परिपत्र त्वचा पंच बायोप्सी केवल एक संपर्क बिंदु प्रदान करता है और बस कुछ मामलों में किसी भी नमूने पर कब्जा करने के बिना त्वचा आंसू । त्वचा microbiopsy के आधार पर, हम हाल ही में शोषक microbiopsy जो दोनों रक्त और त्वचा नमूना क्षमताओं है विकसित की है । उपकरण को हाल ही में महामारी विज्ञान अध्ययन6में संसाधन-गरीब क्षेत्रों में उपयोग के लिए व्यवहार्य दिखाया गया है ।
अपनी सरल डिजाइन के कारण, शोषक microbiopsy कुछ ही सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, स्थानीय संवेदनाहारी की जरूरत नहीं है, और आवेदन साइट scarring कारण नहीं है । वर्तमान प्रोटोकॉल प्रासंगिक नमूना प्रशिक्षण आणविक विश्लेषण के लिए लक्षित त्वचा डेटा प्राप्त करने के लिए बिना शोधकर्ताओं या चिकित्सा पेशेवरों को सक्षम बनाता है । हम microsampling उपकरणों भविष्य में त्वचा अनुसंधान में दिनचर्या बनने की उम्मीद.
हालांकि microbiopsy अन्य त्वचा रोग अध्ययनों में बताया गया है कि आणविक नैदानिक तकनीकों शामिल6,8,9,10, इस तरह के रूप में मानव पैपिलोमा वायरस डीएनए का पता लगाने, इस प्रोटोकॉल पहले नमूना निष्कर्षण और शोषक microbiopsy के लिए प्रसंस्करण तकनीकों का विवरण प्रदर्शित करने के लिए है. इसके अलावा, यह पहली रिपोर्ट है जो माइक्रोबायोप्सी नमूनों में त्वचा और रक्त कोशिकाओं के सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा का वर्णन कर रही है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent microbiopsy fabrication and sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Microbiopsy</td>
			<td>Trajan Scientific and Medical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.trajanscimed.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, Grade 1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td>Including all buffer soltuions described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Improving RNA quality in RNA elution step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1226S74</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-65053</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR reaction and data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-94005</td>
			<td>Including reagents described in qPCR reaction steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4343370</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4485694</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (v6.04)</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A; Windows version</td>
			<td>Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CCT CCT CCC AGT TCT CCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACA CCA CCT TGC CAT CG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3E F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3E R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TTC TGC CTG TGT TCC CTT G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorbent microbiopsy sampling and rna extraction for minimally invasive, simultaneous blood and skin analysis

पारंपरिक त्वचा बायोप्सी नैदानिक अनुसंधान है कि cosmetically संवेदनशील क्षेत्रों या बाल चिकित्सा अनुप्रयोगों को अपनी असावधानी के कारण शामिल है सीमाओं । यहाँ, हम एक शोषक microneedle आधारित डिवाइस का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, microbiopsy अवशोषण, त्वचा और रक्त मिश्रण के न्यूनतम इनवेसिव नमूने के लिए. हमारा लक्ष्य नैदानिक अनुसंधान में तेजी से प्रगति की सुविधा, त्वचा रोग के लिए बायोमार्कर की स्थापना और नैदानिक अनुसंधान प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करने में मदद करना है । पारंपरिक त्वचा बायोप्सी तकनीकों के विपरीत, शोषक microbiopsy सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और इसकी सरल डिजाइन के कारण गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इस रिपोर्ट में, हम एक स्वयंसेवक पर, लोड हो रहा है और आवेदन सहित शोषक microbiopsy के उपयोग का वर्णन. फिर, हम कैसे अवशोषित नमूना से आरएनए को अलग करने के लिए दिखा । अंत में, हम दोनों रक्त (CD3E और CD19) और त्वचा (KRT14 और tyr) के mrna अभिव्यक्ति स्तरों यों तो करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-qpcr) का उपयोग प्रदर्शित करता है । तरीकों का वर्णन है कि हम बंद शेल्फ किट और अभिकर्मकों का उपयोग । यह प्रोटोकॉल एक ही शोषक microbiopsy मैट्रिक्स के भीतर त्वचा और रक्त के एक साथ नमूने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है. हम मानव नीतिशास्त्र समितियों पाया है, चिकित्सकों और स्वयंसेवकों त्वचा संबंधी अनुसंधान के लिए इस दृष्टिकोण का समर्थन करने के लिए.

हम पहले से सूचित किया है कि त्वचा microbiopsy के microneedle लगभग ५०० μm गहरी7त्वचा प्रवेश । त्वचा microbiopsy के microneedle डिजाइन अत्यधिक शोषक microbiopsy पर एक के समान है (चित्रा 2a). जबकि अवशोषण microbiopsy रक्त अवशोषण के लिए बीच में एक शोषक परत के शामिल, त्वचा microbiopsy त्वचा के ऊतकों के यांत्रिक कैप्चरिंग के लिए एक चैनल निहित. शोषक परत का उपयोग भी microneedle आयाम में एक मामूली अंतर के लिए नेतृत्व (शोषक: १.५० x ०.५० एक्स ०.२१ मिमी बनाम त्वचा: १.५० एक्स ०.५० एक्स ०.१५ मिमी).
चित्रा 2b आवेदन साइटों से पता चलता है 5 अवशोषण के बाद मिनट और त्वचा microbiopsies पुरुष स्वयंसेवक के बाईं हथेली का हाथ पर लागू किया गया. दो microneedle डिजाइन के बीच समानता के कारण, दोनों उपकरणों से आवेदन साइटों को मामूली एरिथेमी के साथ तुलनीय थे । दोनों आवेदन साइटों कोई निशान के पीछे छोड़ दिया साथ ४८ एच के बाद ध्यान देने योग्य नहीं थे । यह न्यूनतम इनवेसिव डिवाइस स्क्रीन कई आवेदन साइटों की मदद करने के लिए या एक नियमित आधार पर प्रदर्शन करने की क्षमता है कि परिकल्पना का समर्थन करता है.
चित्रा 2c एक पुरुष स्वयंसेवक के हथेली का हाथ करने के लिए लागू किया जा रहा के बाद शोषक microbiopsy की शोषक परत के एक प्रतिनिधि तस्वीर से पता चलता है. के रूप में चित्रा में दिखाया गया है, त्वचा के कुछ छोटे टुकड़े microneedle की नोक के पास कब्जा कर लिया, और कुछ खून फिल्टर कागज में अवशोषित कर लिया गया था । यह इंगित करता है कि डिवाइस त्वचा प्रवेश और दोनों त्वचा और रक्त एक साथ एक ही शोषक microbiopsy मैट्रिक्स के भीतर पर कब्जा कर लिया । चित्रा 2d एक के बाद नमूना त्वचा microbiopsy, microbiopsy की पिछली पीढ़ी की तुलना के लिए, से पता चलता है । त्वचा microbiopsy के चैनल त्वचा का एक छोटा सा टुकड़ा पर कब्जा कर लिया, लेकिन microneedle पर रक्त की मात्रा शोषक microbiopsy के लिए छोटे रिश्तेदार था. ४८ एच के भीतर दोनों आवेदन साइटें नजर नहीं आ रही थीं. प्रयोग में, शोषक microbiopsy एक 10-एस होल्डिंग समय के बाद आवेदन के साथ लागू किया गया था, जबकि त्वचा microbiopsy तुरंत डिजाइन में अंतर के कारण लागू करने के बाद जारी किया गया था.
के रूप में चित्रा 3aमें दिखाया गया है, शोषक microbiopsy के दो समूहों इस प्रयोग में शामिल थे आवेदन प्रोटोकॉल के आधार पर: ' तत्काल रिलीज ' और ' 10 एस होल्डिंग ' । ' तत्काल रिलीज ' समूह के लिए, डिवाइस अनुप्रयोग साइट से तुरंत आवेदन के बाद हटाया जा रहा डिवाइस के साथ, एक ही मूल त्वचा microbiopsy प्रोटोकॉल का उपयोग कर लागू किया गया था. ' 10 एस होल्डिंग ' समूह के लिए, डिवाइस के लिए आवेदन के बाद जगह में आयोजित किया गया था 10 एस नमूना संग्रह में सुधार करने के लिए. शोषक microbiopsy के दो समूहों के लिए आवेदन दृष्टिकोण नमूना राशि को प्रभावित कर सकता है कि कैसे प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किए गए थे. 10-एस होल्डिंग समय को प्रदर्शित करने के लिए एक चिकित्सकीय उचित समय के रूप में चुना गया था कि आवेदन समय वसूली योग्य नमूने की मात्रा को प्रभावित करता है ।
आरएनए की राशि से बरामद दो शोषक microbiopsy समूहों के लिए ०.३३ ± ०.३९ एनजी थे ' तत्काल रिलीज ' और १.४३ ± ०.८८ ' के लिए 10-एस होल्डिंग ' (चित्रा 3a, n = 20), अतिरिक्त होल्डिंग समय के साथ एक 4 गुना वृद्धि का सुझाव । यह इंगित करता है कि 10-s होल्डिंग समय के साथ शोषक डिवाइस लागू करने के परिणामस्वरूप अधिक आरएनए निकाली गई । अंतर शोषक परत में वृद्धि हुई रक्त नमूने की उपस्थिति के कारण हो सकता है (चित्रा 3c). दरअसल, ' तत्काल रिलीज ' समूह (चित्रा 3b) ' 10-एस होल्डिंग ' समूह (चित्रा 3 सी) की तुलना में शोषक परत के साथ एक समान मात्रा में रक्त एकत्र करने में विफल रहा । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सबसे तुरंत जारी माइक्रोबायोप्सी एक्स के करीब थे-अक्ष, सुझाव है कि वे नकारात्मक घटनाओं थे या आरएनए की एक बहुत कम राशि प्रदर्शित । इसलिए, परिणाम परिकल्पना है कि होल्डिंग समय डिवाइस के प्रदर्शन पर एक प्रभाव के रूप में यह रक्त शोषक परत द्वारा अवशोषित होने के लिए समय लग सकता है सत्यापित किया ।
चूंकि डिवाइस को रक्त और त्वचा के नमूनाकरण के लिए डिजाइन किया गया था, क्यूपीसीआर की तुलना के लिए दोनों उपकरणों के लिए त्वचा और रक्त बायोमार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रयोग की जाती थी । हम tyrosinase का इस्तेमाल किया, tyr, melanocytes के लिए एक बायोमार्कर के रूप में और व्यवहार्य एपिडर्मिस में केराटिनोसाइट्स के लिए एक बायोमार्कर के रूप में KRT14 . त्वचा microbiopsy नमूने तुलना के लिए प्रयोग में शामिल थे । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, हालांकि त्वचा और शोषक microbiopsies अलग डिजाइन में अंतर के कारण लागू किया गया, दोनों त्वचा के लिए अभिव्यक्ति का स्तर बायोमार्कर tyr और KRT14 दोनों उपकरणों के लिए तुलनीय थे के रूप में द्वारा संकेत दिया डेटा. श्वेत रक्त कोशिका बायोमार्कर (CD3E, टी कोशिकाओं और CD19, बी कोशिकाओं) त्वचा microbiopsy नमूनों की तुलना में शोषक microbiopsy नमूनों में अधिक प्रचलित होने के लिए पाए गए. इस परिणाम से पता चलता है कि शोषक microbiopsy रक्त संग्रह में बेहतर प्रदर्शन किया, लेकिन अभी भी त्वचा microbiopsy (एन = 5) की तुलना में त्वचा पर कब्जा करने के लिए क्षमता बनाए रखा.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig1.jpg"> चित्रा 1. शोषक माइक्रोबायोप्सी का निर्माण । (क) तीन परत microneedle । (ख) उपकरण के सभी भागों । (ग) इकट्ठे शोषक microbiopsy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig2.jpg"> चित्रा 2. शोषक microbiopsy पुरुष स्वयंसेवक के बाईं हथेली का हाथ पर एक निशान छोड़ने के बिना एक साथ त्वचा और रक्त के नमूनों पर कब्जा करने में सक्षम था. (क) शोषक और त्वचा microbiopsies के microneedles के बीच एक तुलना. (ख) आवेदन के बाद अवशोषण और त्वचा microbiopsies 5 मिनट से छोड़ दिया अनुप्रयोग साइटों. (सी, डी) आवेदन के बाद अवशोषण और त्वचा microbiopsies के microneedles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig3.jpg"> चित्रा 3. 10-s के लिए आवेदन किया जब शोषक microbiopsy अधिक रक्त और आरएनए नमूना पर कब्जा कर लिया. (क) 10-एस के बाद आवेदन होल्डिंग समय डिवाइस तुरंत (n = 20) को रिहा करने से rna की एक उच्च राशि के परिणामस्वरूप । त्रुटि पट्टियां S.D. माध्य से (* * * *p< 0.0001) का प्रतिनिधित्व करते हैं । (बी, सी) ' तत्काल रिलीज ' और ' 10-एस होल्डिंग ' दृष्टिकोण के साथ आवेदन के बाद शोषक microbiopsies के प्रतिनिधि तस्वीरें. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig4.jpg"> चित्रा 4. त्वचा और शोषक microbiopsies (एन = 5) के बीच mrna अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना । जीन व्यंजक को संदर्भ जीन RPLP0के साथ सामान्यीकृत किया गया था. त्रुटि पट्टियां S.D. माध्य से (*p< 0.05) का प्रतिनिधित्व करते हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।</a>

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Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

न्यूनतम इनवेसिव, एक साथ रक्त और त्वचा विश्लेषण के लिए अवशोषण microbiopsy नमूना और आरएनए निष्कर्षण

इस अनुच्छेद में, हम प्रदर्शन कैसे शोषक microbiopsy तकनीक का प्रदर्शन किया है और कैसे नमूना त्वचा और एक न्यूनतम इनवेसिव तरीके से खून की सरल और एक साथ नमूने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

इस विधि से त्वचा रोगों के लिए जैव मार्कर की स्थापना की सुविधा मिल सकती है और नैदानिक अनुसंधान प्रतिभागियों के लिए जोखिम को भी कम किया जा सकता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह है कि इसके लिए गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है और यह किसी भी निशान को नहीं छोड़ता है। माइक्रोबायोप्सी से पांच मिनट पहले, पांच मिनट के लिए सूखी बर्फ पर एक खाली दो मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब रखें।डिस्पोजेबल दस्ताने पहने हुए, एक शराब पोंछ के साथ इस विषय पर आवेदन साइट को साफ करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ हाथों और उपकरणों का छिड़काव करें। माइक्रोनीडल को छूने के बिना निष्फल गामा विकिरण पैकेज से माइक्रो बायोप्सी निकालें और एक क्लिक सुनने और जगह में प्लंजर ताले तक प्लंजर खींचें। त्वचा के लिए लगभग लंबवत कोण पर लोड किए गए डिवाइस को नमूना लेने के लिए निशाना लगाएं, यह ध्यान रखें कि नमूना क्षेत्र एक निश्चित स्थिति में है और डिवाइस को कम से कम एक किलोग्राम बल के भीतर त्वचा पर लागू करें।फिर ट्रिगर दबाएं और डिवाइस को कम से कम दस सेकंड तक रखें। यदि डिवाइस दस सेकंड से पहले जारी किया जाता है, तो रक्त अवशोषण में भिन्नता की एक उच्च संभावना है और बाद में विश्लेषण भी है। जब नमूना अवशोषित हो गया है, धीरे मामले से प्लंजर और शोषक माइक्रोनीडल खींच और बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए माइक्रोनीडल के दो छेद पर खींचने के लिए यह प्लंजर से हटा दें ।सूखी बर्फ पर ट्यूब के लिए निष्कर्षण बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और सूखी बर्फ सुई पक्ष नीचे पर ट्यूब में बरकरार माइक्रोनीडल जगह है। ध्यान रखें कि हटाने की प्रक्रिया के दौरान माइक्रोनीडल की नोक को कुछ भी छूने न दें। भंवर तीन से पांच सेकंड के लिए ट्यूब microneedle टिप से कुछ नमूना सामग्री इकट्ठा करने के लिए और एक गर्मी ब्लॉक या पानी के स्नान में ट्यूब ४२ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।इनक्यूबेशन के अंत में, माइक्रोफ्यूज ट्यूब के शीर्ष किनारे के साथ माइक्रोनीडल स्तर के पीछे के छोर को रखने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें और ट्यूब के ढक्कन को बंद करें ताकि माइक्रोनीडल का शीर्ष टोपी और ट्यूब के बीच जगह में आयोजित किया जाए। डिवाइस की शोषक परत से नमूना सामग्री एकत्र करने के लिए ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और टिप को बफर समाधान में वापस डुबोए बिना माइक्रोनीडल को ध्यान से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। नमूना फिर से अपकेंद्रित्र करें और ध्यान से एक नई माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में सुपरनेट को स्थानांतरित करें।इसके बाद कमरे के तापमान पर पांच मिनट की इनक्यूबेशन के लिए शुद्धिकरण कॉलम फिल्टर झिल्ली पर कंडीशनिंग बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और अपकेंद्री द्वारा बफर को पतला करें। कोमल मिश्रण के साथ निकाले गए आरएनए नमूने में 70% इथेनॉल के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण को पूर्वशंडित शुद्धिकरण कॉलम में स्थानांतरित करें। प्रवाह के माध्यम से हटाने के लिए तुरंत ट्यूब को दो बार अपकेंद्री करें, इसके बाद वॉश बफर एक के १०० माइक्रोलीटर में एक धोने के बाद ।डीएनए पाचन के लिए, हौसले से तैयार DNAs के ४० माइक्रोलीटर जोड़ें इनक्यूबेशन कमरे के तापमान पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के लिए शुद्धि स्तंभ झिल्ली पर सीधे मिश्रण और धोने बफर एक के ४० माइक्रोलीटर के साथ एक धोने के बाद । अपकेंद्रित्र के अंत में, वॉश बफर टू के 100 माइक्रोलीटर के साथ कॉलम धोएं और किसी भी अवशिष्ट वॉश बफर के लिए शुद्धिकरण कॉलम की जांच करें। शुद्धिकरण कॉलम को आरएनए निष्कर्षण किट में प्रदान की गई 0.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कॉलम में आरएनए स्प्री पानी के 11 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए शुद्धिकरण कॉलम की झिल्ली पर सीधे पिपेट की नोक रखें।कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन दो मिनट के बाद, कॉलम को एक बार कॉलम में वितरित करने के लिए कॉलम को अपकेंद्रित्र करें, और आरएनए को elute करने के लिए एक बार। फिर यदि सीडीएनए संश्लेषण तुरंत नहीं किया जाता है तो कुल आरएनए नमूना शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। शोषक माइक्रोबायोप्सी माइक्रोनीडल में त्वचा और रक्त के एक साथ नमूने के लिए बीच में एक शोषक परत के साथ स्टील प्लेट की दो परतें होती हैं।एक शोषक माइक्रोबायोप्सी का उपयोग केवल मामूली एरिथेमा को प्रेरित करता है, जो 48 घंटों के बाद ध्यान देने योग्य नहीं है। पंचर होने के बाद, त्वचा के कुछ छोटे टुकड़े माइक्रोनीडल की नोक के पास कैप्चर किए जाते हैं और रक्त फिल्टर पेपर में अवशोषित हो जाता है। जब शोषक माइक्रोनीडल पंचर के तुरंत बाद हटा दिया जाता है, तो नमूना मात्रा और निकाले गए एमआरएनए की बाद की मात्रा पंचर के बाद दस सेकंड तक पकड़ने के बाद प्राप्त की तुलना में काफी कम होती है।मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण द्वारा शोषक माइक्रोबायोप्सी और इसके पूर्ववर्ती त्वचा माइक्रोबायोप्सी के उपयोग के बाद त्वचा मार्कर अभिव्यक्ति के समान स्तर का पता लगाया जाता है। लेकिन सफेद रक्त कोशिका जैव मार्कर अभिव्यक्ति का एक काफी उच्च स्तर शोषक माइक्रोबायोप्सी नमूने के बाद पता चला है, सुझाव है कि शोषक माइक्रोबायोप्सी माइक्रोनीडल रक्त संग्रह के लिए बेहतर प्रदर्शन करता है, जबकि त्वचा के नमूने के लिए एक ही क्षमता को बनाए रखने के रूप में त्वचा माइक्रोबायोप्सी के साथ कब्जा । तो तकनीक लागू करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि हम जो सुझाव देते हैं उसके अनुसार डिवाइस को लागू करना विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।इसलिए इस प्रक्रिया का पालन करते हुए, वास्तविक समय पीसीआर जैसे अन्य तरीकों का पालन अपेक्षाकृत जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है। हालांकि हम अभी भी डिवाइस विकसित कर रहे हैं, हमें विश्वास है कि तकनीक नमूना प्रदर्शन के लिए नैदानिक शोध के लिए मार्ग प्रशस्त किया है, त्वचा विज्ञान कॉस्मेटिक या बाल चिकित्सा आवेदन के लिए, क्योंकि यह सिर्फ इतना आसान है और यह ंयूनतम आक्रामक है ।

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

समर्थक भड़काऊ cytokine आईएल - 1β के सटीक और सरल मापन एक पूरे रक्त उत्तेजना परख का उपयोग

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

रक्त नमूनाकरण, औषधि प्रशासन और जानते हुए रक्तचाप और हृदय की दर माप के लिए और्विक धमनी और शिरापरक कैथीटेराइजेशन

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

Photothrombotic Ischemia: माउस स्ट्रोक अध्ययन के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रसायनिक cortical घाव मॉडल

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Murine Orthotopic मूत्राशय Xenografts की न्यूनतम इनवेसिव स्थापना

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

वसा ऊतकों डिपो में प्रत्यारोपण के लिए इनकैप्सुलेशन Thermogenic Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

चूहे में न्यूनतम इनवेसिव ट्रांसवर्स महाधमनी कसना

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Endoscopic Septoplasty with Limited Two-line Resection: Minimally Invasive Surgery for Septal Deviation

सीमित दो लाइन लकीर के साथ इंडोस्कोपिक Septoplasty: Septal विचलन के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी

Endoscopic septoplasty is a surgical procedure in otolaryngology that is commonly performed to treat nasal airway obstruction caused by nasal septal ...

Electromagnetic Navigation Transthoracic Nodule Localization for Minimally Invasive Thoracic Surgery

विद्युत चुम्बकीय नेविगेशन ट्रांसथोरेसिक नोड्यूल स्थानीयकरण न्यूनतम इनवेसिव थोरेसिक सर्जरी के लिए

The increased use of chest computed tomography (CT) has led to an increased detection of pulmonary nodules requiring diagnostic evaluation and/or ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

चूहों में एक साथ जी॰ रिकॉर्डिंग और इनवेसिव रक्तचाप माप

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

पुनर्निर्माण माइक्रोसर्जरी में इस्केमिया-रिपेरेपमेंट इंजरी के अध्ययन के लिए एक प्री-क्लीनिकल चूहा मॉडल

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...