Name: absorbent microbiopsy sampling and rna extraction for minimally invasive, simultaneous blood and skin analysis
Uploaded: 2019-02-21T12:30:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis at JoVE.com

Nós gostaríamos de reconhecer NHMRC bolsas APP1109749 e APP1111216, Universidade de Queensland centenário bolsa e bolsa de pesquisa pós-graduação internacional.

O estudo foi aprovado pelo Metro Sul humano Comitê de ética de pesquisa e a Universidade de Queensland humano pesquisa Comitê de ética (HREC-13-QPAH-551 e UQ2013001551) e Universidade de South Austrália humana Comitê de ética (200607).
1. absorvente Microbiopsy fabricação
<ol><li>Corte a laser microneedle partes de 50 µm folha de aço inoxidável de grau médico e camada absorvente (papel de filtro), respectivamente (Figura 1). Nota: Outras partes, incluindo o êmbolo e o caso, do dispositivo são fabricadas com as técnicas de prototipagem rápida, como a impressão 3D.</li>
	<li>Aproveite todas as peças, exceto a camada absorvente, em 70% etanol (EtOH) por 5 min e ar secá-las por 30 min depois.</li>
	<li>Monte o microneedle da três-camada, com a camada absorvente no meio (Figura 1a).</li>
	<li>Inserir o microneedle montado na fenda do êmbolo.</li>
	<li>Colocar a mola e insira o êmbolo na caixa (Figura 1C). Evite o microneedle tocar em nada no processo de montagem para garantir a qualidade da agulha.</li>
	<li>Sele o microbiopsy absorvente montado em um pacote para a esterilização de radiação-γ antes de usar.</li>
</ol>2. a amostragem com o absorvente Microbiopsy
<ol><li>Usar luvas descartáveis e mãos de pulverizador e ferramentas, tais como fórceps, com 70% EtOH.</li>
	<li>Higienizar o local de aplicação com uma compressa com álcool.</li>
	<li>Remova o microbiopsy do pacote esterilizado γ-radiação sem tocar o microneedle no processo.</li>
	<li>Carrega o aparelho puxando o êmbolo para comprimir a mola até que haja um 'clique' som e os bloqueios de êmbolo no lugar.</li>
	<li>Aponte o dispositivo na pele a amostra, garantindo que a área de amostragem está em uma posição fixa.</li>
	<li>Certifique-se de que o dispositivo é aproximadamente perpendicular à pele e, em seguida, aplicar ≥ 1 kg de força para o dispositivo sobre a pele. Nota: Aplicando força para baixo na pele é necessário para assegurar uma penetração suficiente do microneedle.</li>
	<li>Pressione o gatilho e segure o dispositivo no lugar por um período mínimo de 10 s para a amostra de sangue ser absorvido. Nota: Se o dispositivo for liberado antes de 10 s, há menos amostra capturada.</li>
</ol>3. extração do RNA
Nota: Os procedimentos de extração de RNA foram modificados de protocolo dos fabricantes para isolamento ideal do RNA da amostra de microbiopsied. Todos os reagentes e coluna usada na extração do RNA estão incluídos no kit, salvo indicação em contrário.
<ol><li>Puxe o êmbolo e microneedle absorvente do caso pelas mãos suavemente. Certifique-se de que a ponta do microneedle não entra em contacto com alguma coisa durante a remoção.</li>
	<li>Remova o absorvente microneedle o êmbolo. Segure os dois furos no microneedle com um par de Pinças esterilizadas e retirá-lo.</li>
	<li>Coloque o microneedle intacto em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL (não do kit de isolamento de RNA; ver Tabela de materiais) preenchido com 50 µ l de tampão de extração, com o lado da agulha virado para baixo, para baixo. Para minimizar a perda de amostra, deixe o tubo de gelo seco por 5 min antes de processar a amostra.</li>
	<li>Vórtice brevemente (3-5 s) para remover alguns dos materiais incluídos na amostra da ponta.</li>
	<li>Incubar o microneedle no tubo em uma cadeira de balanço para o minuto 30 a 42 ° C. Nota: A solução-tampão será absorvida na camada absorvente imediatamente.</li>
	<li>Coloque a parte superior do nível microneedle (lado oposto da agulha) na parte superior do tubo de microcentrífuga 2 mL, usando Pinças esterilizadas.</li>
	<li>Feche a tampa do tubo, tal que o topo do microneedle é mantido no lugar entre o PAC e o tubo.</li>
	<li>Girar o tubo em 16.000 x g ou à velocidade máxima de 30 s para remover os materiais incluídos na amostra da camada absorvente do dispositivo.</li>
	<li>Remova o microneedle cuidadosamente com a pinça sem volta mergulhando a solução-tampão. Mantenha o tubo e descartar o microneedle.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 2 min. Pipetar o sobrenadante contendo o RNA extraído cuidadosamente em um tubo de microcentrifugadora novo.</li>
	<li>Adicionar 250 µ l de tampão de condicionamento para a membrana de filtro de coluna de purificação e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue a coluna no tubo de coleta em 16.000 x g ou a velocidade máxima durante 1 min.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de 70% EtOH para a amostra coletada do passo 3.9. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo.</li>
	<li>Transfira a mistura (~ 100 µ l) na coluna de purificação instintiva.</li>
	<li>Centrífuga para 2 min em 100g x imediatamente, seguida por uma centrifugação a 16.000 x g, durante 30 s para remover o escoamento.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão de lavagem 1 (W1) na coluna de purificação e centrifugar por 1 min a 8.000 x g.</li>
	<li>Prepare a solução de DNase adicionando 5 µ l de DNase eu solução estoque a 35 µ l de Buffer RDD numa microcentrifuga separada do tubo para cada amostra. Misturar por inversão suavemente. Nota: O tratamento de DNase é para ser realizado na coluna de purificação, em vez de na placa do PCR depois, por causa da quantidade da amostra.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de mistura de incubação DNase diretamente na membrana de coluna de purificação. Incube a temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de W1 para a membrana de coluna de purificação. Centrifugar a 8.000 x g por 15 s.</li>
	<li>Pipete 100 µ l de tampão de lavagem 2 (W2) para a coluna de purificação após o tratamento de DNase e centrifugar por 1 min a 8.000 x g.</li>
	<li>Adicionar outro 100 µ l de W2 na coluna de purificação e centrifugar por 2 min em 16.000 x. g. verificação da coluna de purificação para qualquer tampão de lavagem residual. Re-centrifugar a 16.000 x g por 1 min, se permanece qualquer tampão de lavagem.</li>
	<li>Transferi a coluna de purificação para um novo tubo de microcentrifuga de 0,5 mL, fornecido no kit.</li>
	<li>Pipete 11 µ l de RNase-água livre (não fornecido no kit de isolamento do RNA), em vez de tampão de eluição (EB), directamente sobre a membrana da coluna de purificação. Toca suavemente a ponta da pipeta na superfície da membrana durante o fornecimento da água livre de RNase para garantir a máxima absorção de água livre de RNase para a membrana. Incube a temperatura ambiente por 2 min.</li>
	<li>Centrifugue a coluna por 1 min a 1.000 x g para distribuir a água livre de RNase na coluna e, em seguida, centrifugar para 16.000 x g em 1 min para Eluir o RNA. Nota: Quantificação de RNA não é recomendada devido a pequena quantidade da amostra.</li>
	<li>Parar o ponto #1: armazenar a amostra de RNA total a-80 ° C, se a síntese do cDNA não é executada imediatamente. Nota: Evite congelar se não for necessário dada a baixa concentração de amostra de RNA.</li>
</ol>4. síntese de cDNA
<ol><li>Descongele a amostra congelada no gelo (da etapa 3,25).</li>
	<li>Sintetiza o cDNA de RNA total com kit de síntese do cDNA de acordo com o procedimento abaixo.</li>
	<li>Preparar a mistura de reação: 11 µ l de RNA total, 4 µ l de 5 x TransAmp Buffer, 1 µ l de transcriptase reversa, 4 µ l de água DNase/RNase-livre. Misture suavemente pipetando.</li>
	<li>Executar a transcrição reversa em um aparelho termociclador: 25 ° C por 10 min, 42 ° C por 15 min, seguido por uma etapa de inactivação final transcriptase reversa a 85 ° C por 5 min.</li>
	<li>Parar o ponto #2: armazenar a amostra transcrita reversa a-80 ° C até o uso.</li>
</ol>5. reação de qPCR e análise de dados
Nota: Os primers para qPCR reações foram projetados para span intrão os limites para evitar a amplificação de DNA genômico, usando Primer de NCBI BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). O gene de referência utilizado neste estudo é RPLP0 (consulte a seção de discussão para obter mais informações).
<ol><li>Descongele a amostra congelada no gelo (da etapa 4.5).</li>
	<li>Execute qPCR com o kit de mistura mestre qPCR de acordo com o procedimento abaixo.</li>
	<li>Preparem-se mestre mistura contendo os followings por reação: 5 µ l da mistura de reação de x qPCR 2, 0,4 µ l de cartilha para a frente de 10 µM, 0,4 µ l de primer reverso de 10 µM, 2,2 µ l de água livre de DNase. Misture suavemente pipetando. Configure as amostras em triplica.</li>
	<li>Pipete 8 µ l do mix mestre em cada poço de uma 384-bem PCR placa primeiro e depois 2 µ l do cDNA de cada amostra (de um total de 10 µ l por alvéolo). Nota: Nenhum modelo de controle (NTC) e nenhum controle de transcriptase reversa (-RT) estão incluídos como controles negativos.</li>
	<li>A placa com a película adesiva do selo e centrifugar brevemente.</li>
	<li>Executar a reação de amplificação em um termociclador em tempo real: 95 ° C por 2 min (ativação da polimerase), seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 5 s (desnaturação), 60 ° C durante 10 s (recozimento) e 72 ° C, durante 10 s (extensão).</li>
	<li>Calcule a concentração de RNA de amostras por interpolação de uma curva padrão preparada a partir de modelos com concentrações conhecidas.<ol>
<li>Crie uma Nova experiência no software.</li>
		<li>Clique em definir e definir padrões de cima para configurar diluição serial para placas.</li>
		<li>Selecionar e organizar os poços de padrões e amostras. Clique em aplicar.</li>
		<li>Clique em analisar na aba resultado para avaliar a curva de calibração. Confirmar a inclinação, o valor de R2 , erro e eficiência de amplificação atendem aos critérios experimentais.</li>
		<li>Controlar as quantidades das amostras desconhecidas visualmente na curva padrão com base em seus valores de Ct. Nota: A construção da curva padrão, incluindo a escolha do factor de diluição é realizada de acordo com protocolos publicados11,12,13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute análise de expressão do gene do mRNA usando o método ΔCt (Ct é normalizada a um gene refence).<ol>
<li>Subtrai o valor de Ct do gene alvo do valor de Ct do gene de referência para obter o valor de ΔCt.</li>
		<li>Replica de média e os valores ΔCt da técnica.</li>
		<li>Plotar e analisar a expressão de gene com estatísticas software11,14 (ver Tabela de materiais). Nota: Como alternativa, a análise de expressão do gene é realizada de acordo com protocolos publicados13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, C. Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+minimally+invasive+skin+sampling+techniques?+A+bright+scientific+future.">Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).</li><li>Kirstein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+invasive+microbiopsies:+a+novel+sampling+method+for+identifying+asymptomatic,+potentially+infectious+carriers+of+Leishmania+donovani.">Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani.</a> International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).</li><li>Lin, L. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Methodology+for+Sequential+Extraction+of+RNA+and+Protein+from+Small+Human+Skin+Biopsies.">Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Estes resultados demonstram que o absorvente microbiopsy pode ser usado como uma ferramenta para amostragem simples e minimamente invasiva da pele e sangue mistura para caracterização molecular. Aplicativo de dispositivo em conformidade com o protocolo é essencial para a obtenção de resultados fiáveis como mostrado pela diferença na quantidade de RNA recuperada com os protocolos de aplicação diferentes (Figura 3). Uma vez que a amostra é extraída, a amostra subsequente processamento passo para extração do RNA é altamente similar a protocolos estabelecidos15,16. Além disso, desde os passos iniciais na extração de RNA que são modificados para o absorvente microbiopsy, outra mudança chave é a utilização de água livre de RNase para melhorar os resultados para aplicações a jusante. Além disso, vale mencionar que o gene de referência utilizado neste estudo é RPLP0. RPLP0, cuja função é conhecida por diferentes células e tecidos tipos17, tem sido relatado como um gene de referência adequado para uso em cânceres de pele não-melanoma e lesões pré-cancerosas18.
Uma das principais limitações do dispositivo é a remoção do microbiopsy do dispositivo, que é demorado e potencialmente aumenta a chance de perda de amostra, especialmente para amostras sensíveis como o RNA. No entanto, o problema pode ser superado por pré-resfriamento todas as ferramentas de processamento estéril, tais como os tubos de microcentrifuga de 2ml, em gelo seco.
O uso de microbiopsy o absorvente é simples e não requer treinamento intensivo. Biópsia convencional não é necessária, como microbiopsy permite a caracterização molecular com técnicas de diagnóstico molecular estabelecido, como RT-qPCR. Para ainda mais quantificar e demonstrar a capacidade de amostragem de absorvente microbiopsy, foi investigada a literatura anterior que envolveu a extração do RNA do tecido da pele humana. De uma típico 3.0 ou 4.0 mm da pele soco biópsia, três estudos relataram as quantidades de RNA extraídas variou de 50 a 200 ng por mg de pele tecido19,20,21. Comparando com a 1,43 ng do RNA que foi recuperado o absorvente microbiopsy em média (Figura 3), o peso dos tecidos da pele amostrados é esperado a gama de 0,29-115 µ g baseia-se a mesma proporção de RNA-de-tecido de estudos de biópsia da pele soco.
Este protocolo não é sem armadilhas potenciais, embora alguns dos problemas podem ser facilmente superados. Por exemplo, os dados de extração de RNA sugeriam uma considerável variação mesmo com o tempo de armazenagem de 10-s (Figura 3). Para resolver o problema, uma solução potencial envolve otimizando o protocolo de aplicação. Parâmetros como a força aplicada sobre a pele e tempo de armazenagem deve ser testado e otimizado para reduzir as variações na extração da amostra. O outro problema potencial é a remoção de microbiopsy do dispositivo, que possa afetar a integridade da amostra e a recuperação. Apesar de remover o microbiopsy para extração do RNA é uma abordagem eficaz, todo o procedimento é tedioso, e a amostra pode ser exposta a contaminação no processo. Portanto, a modificação do protocolo de processamento de amostra é altamente desejada a fim de garantir a integridade da amostra e evitar a perda de amostra.
Uma vez que as duas questões acima são abordadas, espera-se que o dispositivo se torne uma ferramenta padrão para pesquisa clínica. É importante notar que o dispositivo capta a pele e o sangue amostra simultaneamente, e isto deve ser tida em conta quando se analisa dados da expressão do gene. Em conclusão, este protocolo descreve os detalhes do absorvente microbiopsy se apresentar como uma ferramenta fácil e minimamente invasiva para pele combinada e recolha de amostras de sangue e a amostra subsequente processamento para perfil de expressão de gene relativo.

Biópsia de pele é uma das técnicas mais essenciais em Dermatologia para amostragem de pele e posterior diagnóstico de doenças de pele, através da avaliação histopatológica. A técnica de biópsia envolve um profissional médico, usando uma lâmina ou um punção biópsia para remover a lesão suspeita na pele do paciente para exame1. Embora a técnica seja eficaz, é altamente invasivo e limita a pesquisa clínica, como o ponto de extremidade geralmente envolve técnicas de biologia molecular2,3. Análise molecular de doenças de pele tem o potencial de fornecer informações biológicas altamente específicas que não a análise histopatológica, facilitando assim a droga descoberta e doença diagnóstico4,5. Além disso, a demanda de amostra em técnicas moleculares mais é comparativamente pequena e pode levar a uma redução no uso de animais e permitir um maior número de repetições. Portanto, há uma clara necessidade de uma técnica alternativa que permite a análise molecular em pesquisa clínica e diminui o risco para os participantes.
Para atender a essa necessidade no campo, nosso grupo desenvolveu uma plataforma de diagnóstica baseados em microneedle romance, microbiopsy absorvente, que possibilita a coleta de uma pequena quantidade de pele misturada com sangue de uma forma simples e minimamente invasiva6. O propósito desta publicação é descrever o absorvente microbiopsy como uma ferramenta de amostragem para facilitar a análise molecular através da extração do RNA em pesquisa clínica.
Anteriormente, descrevemos a primeira versão do microbiopsy, pele microbiopsy, que consiste de um microneedle feito de um design de três camadas de chapa de aço para extrair pequenos pedaços de tecidos de pele7. A novidade deste dispositivo vem de múltiplos pontos de contacto de microneedle que permite a extração de tecido eficiente3. Em contraste, uma biópsia do perfurador de pele circular fornece apenas um ponto de contacto e simplesmente rasga a pele sem captura qualquer amostra em alguns casos. Com base no microbiopsy a pele, recentemente desenvolvemos o microbiopsy absorvente que tem tanto sangue e pele capacidades de amostragem. O dispositivo tem demonstrado ser viável para uso em áreas de poucos recursos em um recente estudo epidemiológico6.
Devido ao seu design simples, o microbiopsy absorvente pode ser realizada em poucos segundos e não requer treinamento extensivo. Além disso, anestésico local não é necessária, e o local de aplicação não provoca cicatrizes. O presente protocolo permite a pesquisadores ou profissionais médicos sem amostragem pertinente de treinamento para obter dados de pele direcionados para análise molecular. Esperamos microsampling dispositivos para se tornar rotina na investigação de pele no futuro.
Embora o microbiopsy tem sido relatada em outros estudos de doença de pele que envolveu técnicas de diagnóstico molecular6,8,9,10, como o vírus do papiloma humano deteção do ADN, este protocolo é o primeiro a demonstrar os detalhes das técnicas de extração e processamento de amostra para o microbiopsy absorvente. Além disso, este é o primeiro relatório descrevendo o perfil de expressão de gene relativo da pele e células do sangue em amostras de microbiopsy.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent microbiopsy fabrication and sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Microbiopsy</td>
			<td>Trajan Scientific and Medical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.trajanscimed.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper, Grade 1</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>KIT0214</td>
			<td>Including all buffer soltuions described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Improving RNA quality in RNA elution step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1226S74</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z605212</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-65053</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR reaction and data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-94005</td>
			<td>Including reagents described in qPCR reaction steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4343370</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scinentific</td>
			<td>4485694</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (v6.04)</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A; Windows version</td>
			<td>Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CCT CCT CCC AGT TCT CCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACA CCA CCT TGC CAT CG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3E F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3E R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 F</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TTC TGC CTG TGT TCC CTT G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N/A</td>
			<td>GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorbent microbiopsy sampling and rna extraction for minimally invasive, simultaneous blood and skin analysis

Biópsia de pele convencional limita a pesquisa clínica que envolve áreas cosmeticamente sensíveis ou pediátricas aplicações devido a sua capacidade de invasão. Aqui, descrevemos o protocolo de utilização de um dispositivo baseado em microneedle absorvente, absorvente, microbiopsy, para amostragem minimamente invasiva da mistura de pele e sangue. Nosso objetivo é ajudar a facilitar o rápido progresso na pesquisa clínica, o estabelecimento de biomarcadores para doenças de pele e reduzindo o risco para os participantes da pesquisa clínica. Em contraste com as técnicas de biópsia de pele convencional, o absorvente microbiopsy pode ser executada em poucos segundos e não requer treinamento intensivo devido ao seu design simples. Neste relatório, nós descrevemos o uso de absorvente microbiopsy, incluindo carregamento e aplicação, em um voluntário. Em seguida, mostramos como isolar o RNA da amostra absorvida. Finalmente, vamos mostrar o uso de quantitativo transcrição reversa PCR (RT-qPCR) para quantificar os níveis de expressão de RNAm de sangue (CD3E e CD19) e pele (KRT14 e TYR). Os métodos que descrevemos utilizam fora da prateleira kits e reagentes. Este protocolo oferece uma abordagem minimamente invasiva para a amostragem simultânea de pele e sangue, dentro da mesma matriz microbiopsy absorvente. Encontramos comités de ética humana, clínicos e voluntários para apoiar esta abordagem de pesquisa dermatológica.

Informamos anteriormente que o microneedle da microbiopsy a pele penetra a pele aproximadamente 500 µm profunda7. O projeto de microneedle da pele microbiopsy é altamente similar ao que microbiopsy absorvente (Figura 2a). Enquanto o absorvente microbiopsy consistia de uma camada absorvente no meio para absorção de sangue, a pele microbiopsy continha um canal para capturar mecânica dos tecidos da pele. O uso da camada absorvente também levou a uma ligeira diferença na dimensão de microneedle (absorvente: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm vs pele: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).
Figura 2b mostra os locais de aplicação 5 min depois absorvente e microbiopsies de pele foram aplicadas no braço esquerdo volar do voluntário masculino. Devido à semelhança entre os dois projetos de microneedle, os locais de aplicação de ambos os dispositivos eram comparáveis, com eritema menor. Ambos os sites de aplicativo não eram perceptíveis após 48 h com nenhuma cicatriz à esquerda atrás. Isto suporta a hipótese de que este dispositivo minimamente invasivo tem o potencial para ajudar a vários sites de aplicativo de tela ou para ser executada em uma base regular.
C da Figura 2 mostra uma imagem representativa da camada absorvente do microbiopsy absorvente após ser aplicado para o volar do braço de um homem voluntário. Como mostrado na figura, alguns pequenos pedaços de pele foram capturados perto da ponta do microneedle, e um pouco de sangue foi absorvido o papel de filtro. Isso indica que o dispositivo penetrou na pele e capturado tanto pele e sangue simultaneamente dentro da mesma matriz de microbiopsy absorvente. Figura 2d mostra uma pós-amostragem pele microbiopsy, a geração anterior de microbiopsy, para comparação. O canal de microbiopsy a pele capturou um pequeno pedaço de pele, mas a quantidade de sangue sobre o microneedle era pequena em comparação com o absorvente microbiopsy. Ambos os sites de aplicativo não eram perceptíveis dentro de 48 h. No experimento, o absorvente microbiopsy foi aplicado com um tempo de armazenagem de 10-s pós aplicação, enquanto a pele microbiopsy foi lançado imediatamente após a aplicação devido à diferença no projeto.
Como mostrado na Figura 3a, dois grupos de absorvente microbiopsy estavam envolvidos neste experimento baseado no protocolo de aplicação: 'Libertação imediata' e exploração de 10-s'. Para o grupo de 'Libertação', o dispositivo foi aplicado usando o protocolo de microbiopsy de pele original mesmo, com o dispositivo que está sendo removido do local do aplicativo imediatamente após a aplicação. Para a realização de 10-s' grupo, o dispositivo foi mantido no lugar após o pedido de 10 s para melhorar a coleta de amostra. Os dois grupos de absorvente microbiopsy foram criados para demonstrar como a abordagem de aplicativo pode afetar a quantidade de amostra. O tempo de armazenagem de 10-s foi escolhido como um tempo clinicamente razoável para demonstrar que o tempo de aplicação afeta a quantidade de amostra recuperável.
A quantidade de RNA se recuperou os dois grupos de absorvente microbiopsy foram 0,33 ± 0,39 ng 'Libertação imediata' e 1,43 ± 0,88 ng para exploração de 10-s' (Figura 3a, n = 20), sugerindo um aumento de 4-fold com o tempo extra. Isto indica que aplicar o dispositivo absorvente com o tempo de armazenagem de 10-s resultou em mais RNA extraído. A diferença pode ser devido à presença de amostra sanguínea aumentada na camada absorvente (Figura 3C). Com efeito, o grupo de 'Libertação' (Figura 3b) conseguiu coletar uma quantidade semelhante de sangue com a camada absorvente em comparação com a realização de 10-s' grupo (Figura 3C). Também deve ser notado que mais imediatamente lançados microbiopsies estavam perto do eixo x, sugerindo que eles eram eventos negativos ou exibido uma quantidade muito baixa de RNA. Portanto, o resultado validado a hipótese de que o tempo de armazenagem teria um impacto sobre o desempenho do dispositivo, como isso pode levar tempo para o sangue ser absorvido pela camada absorvente.
Desde que o dispositivo foi projetado para sangue e amostras de pele, qPCR foi usado para detectar a expressão de pele e sangue biomarcadores para ambos os dispositivos para comparação. Usamos a tirosinase, TYR, como um biomarcador para os melanócitos e KRT14 como um biomarcador para queratinócitos na epiderme viável. Pele microbiopsy amostras foram incluídas no experimento para comparação. Como mostrado na Figura 4, embora a pele e o absorvente microbiopsies foram aplicadas de forma diferente devido à diferença no design, a expressão níveis para ambos pele biomarcadores TYR e KRT14 foram comparáveis para ambos os dispositivos conforme indicado pelo dados. Biomarcadores de células brancas do sangue (CD3E, células T e CD19, células B) foram encontrados para ser mais prevalente em amostras de microbiopsy absorvente do que nas amostras de pele microbiopsy. Este resultado sugere que o absorvente microbiopsy um melhor desempenho na coleta de sangue, mas ainda mantém a capacidade de captura de pele em comparação com o microbiopsy de pele (n = 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig1.jpg"> Figura 1. Fabricação de absorvente microbiopsy. (a) o microneedle da três-camada. (b) todas as partes do dispositivo. (c) o microbiopsy absorvente montado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig2.jpg"> Figura 2. O absorvente microbiopsy foi capaz de capturar amostras de pele e sangue simultaneamente sem deixar uma cicatriz no braço esquerdo volar do voluntário masculino. uma comparação entre as microagulhas de absorvente e pele microbiopsies. (b) a aplicação sites esquerda por absorvente e pele microbiopsies 5 min após a aplicação. (c, d) Microagulhas de microbiopsies absorvente e da pele após a aplicação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig3.jpg"> Figura 3. O absorvente microbiopsy capturado mais sangue e amostra de RNA quando aplicado para 10-s. (a) o tempo de armazenagem pós-aplicação de 10-s resultou em uma maior quantidade de RNA que liberando o dispositivo imediatamente (n = 20). Barras de erro representam S.D. da média (* * *p< 0,0001). (b, c) Fotos representativas do microbiopsies absorvente após aplicação com 'Liberação imediata' e exploração de 10-s' abordagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig4.jpg"> Figura 4. A comparação dos níveis de expressão do mRNA entre a pele e o absorvente microbiopsies (n = 5). a expressão de gene tinha sido normalizada com gene de referência RPLP0. Barras de erro representam S.D. da média (*p< 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Amostragem Microbiopsy absorvente e extração do RNA para sangue minimamente invasiva, simultânea e análise de pele

Neste artigo, vamos demonstrar como a técnica de microbiopsy absorvente é executada e como a amostra pode ser usada para a extração de RNA para amostragem simples e simultânea de pele e sangue, de forma minimamente invasiva.

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

Esse método pode facilitar o estabelecimento de biomarcadores para doenças de pele e também reduzir o risco para os participantes da pesquisa clínica. As principais vantagens dessa técnica são que ela não requer treinamento intensivo e não deixa cicatrizes. Cinco minutos antes da microbiopsia, coloque um tubo vazio de dois mililitros em gelo seco por cinco minutos.Usando luvas descartáveis, pulverize as mãos e ferramentas com 70% de etanol antes de higienizar o local de aplicação sobre o assunto com um lenço de álcool. Remova a micro biópsia do pacote de radiação gama esterilizada sem tocar no microacle e puxe o êmbolo até que um clique seja ouvido e o êmbolo se triva no lugar. Aponte o dispositivo carregado em um ângulo aproximadamente perpendicular à pele a ser amostrado, tendo em conta que a área de amostragem esteja em posição fixa e aplique o dispositivo na pele dentro de pelo menos um quilo de força.Em seguida, pressione o gatilho e mantenha o dispositivo no lugar por pelo menos dez segundos. Se o dispositivo for liberado antes de dez segundos, há uma maior chance de variação na absorção de sangue e também na análise subsequente. Quando a amostra tiver sido absorvida, puxe suavemente o êmbolo e o microacle absorvente da caixa e use fórceps estéreis para puxar os dois orifícios do microacle para removê-lo do êmbolo.Adicione 50 microliters de tampão de extração ao tubo em gelo seco e coloque o microagulha intacto no tubo no lado seco da agulha de gelo para baixo. Tenha cuidado para não deixar a ponta do microaclese tocar em nada durante o processo de remoção. Vórtice do tubo por três a cinco segundos para coletar algum material amostrado da ponta do microacleto e incubar o tubo em um bloco de calor ou banho de água por 30 minutos a 42 graus celsius.No final da incubação, use fórceps estéreis para colocar a extremidade traseira do nível do microaclese com a borda superior do tubo de microfuge e fechar a tampa do tubo de tal forma que a parte superior do microacle é mantida no lugar entre a tampa e o tubo. Centrifugar o tubo para coletar o material amostrado da camada absorvente do dispositivo e usar os fórceps para remover cuidadosamente o microacle sem mergulhar a ponta de volta na solução tampão. Centrifugar a amostra novamente e transferir cuidadosamente o supernante para um novo tubo de micro centrífuga.Em seguida, adicione 250 microliters de tampão de condicionamento em uma membrana de filtro de coluna de purificação para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e dilua o buffer por centrifugação. Adicione 50 microliters de 70% de etanol à amostra de RNA extraída com mistura suave e transfira a mistura para a coluna de purificação pré-condicionada. Imediatamente centrifufique o tubo duas vezes para remover o fluxo- through, seguido por uma lavagem em cem microliters de tampão de lavagem um.Para digestão de DNA, adicione 40 microliters de incubação de DNAs recém-preparada mistura diretamente na membrana da coluna de purificação para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, seguida por uma lavagem com 40 microliters de tampão de lavagem um. No final da centrifugação, lave a coluna com 100 microliters de tampão de lavagem dois e verifique a coluna de purificação para qualquer tampão de lavagem residual. Transfira a coluna de purificação em um tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitro fornecido no kit de extração de RNA e coloque a ponta da pipeta diretamente na membrana da coluna de purificação para adicionar 11 microliters de água RNA sPRE à coluna.Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, centrifufique a coluna uma vez para distribuir a água RNA sPRE em toda a coluna, e uma vez para elutar o RNA. Em seguida, armazene a amostra total de RNA a menos 80 graus celsius se a síntese de CDNA não for realizada imediatamente. A microaclesia absorvente consiste em duas camadas de chapa de aço com uma camada absorvente entre elas para amostragem simultânea da pele e sangue.O uso de uma microbiopsia absorvente induz apenas eritema menor, que não é perceptível após 48 horas. Após a punção, alguns pequenos pedaços de pele são capturados perto da ponta do microapós e o sangue é absorvido no papel filtro. Quando o microacle absorvente é removido imediatamente após a punção, o volume amostral e a quantidade subsequente de mRNA extraído é significativamente menor do que o obtido após a retenção por dez segundos após a punção.Níveis semelhantes de expressão de marcador de pele são detectados após o uso de microbiopsia absorvente e sua microbiopsia de pele antecessora por análise quantitativa de PCR. Mas um nível significativamente maior de expressão de biomarcadores de glóbulos brancos é detectado após amostragem de microbiopsia absorvente, sugerindo que o microabiopso absorvente tem melhor desempenho para coleta de sangue, mantendo a mesma capacidade de captura de amostras de pele como com a microbiopsia da pele. Assim, ao aplicar a técnica, é crucial lembrar que aplicar o dispositivo de acordo com o que sugerimos é essencial para obter resultados confiáveis.Assim, seguindo este procedimento, outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser seguidos para perfis relativamente gênicas de expressão genética. Embora ainda estejamos desenvolvendo o dispositivo, estamos confiantes de que a técnica abriu caminho para pesquisas clínicas para a realização de amostragem, para aplicação cosmética dermatológica ou pediátrica, pois é tão simples e minimamente invasiva.

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² using a Whole Blood Stimulation Assay

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Medicina

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Cateterismo arterial e venoso femoral para coleta de sangue, Drug Administration e Pressão Arterial Consciente e Medidas de freqüência cardíaca

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

Isquemia Photothrombotic: Um Modelo de lesão cortical fotoquímica Minimamente Invasiva e reprodutível para mouse Estudos curso

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimamente Invasiva transversal aórtica constrição em Ratos

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Endoscopic Septoplasty with Limited Two-line Resection: Minimally Invasive Surgery for Septal Deviation

A septoplastia endoscópica com ressecção limitada de duas linhas: cirurgia minimamente invasiva para desvio do septo

Endoscopic septoplasty is a surgical procedure in otolaryngology that is commonly performed to treat nasal airway obstruction caused by nasal septal ...

Electromagnetic Navigation Transthoracic Nodule Localization for Minimally Invasive Thoracic Surgery

Localização do nódulo transtorácico de navegação eletromagnética para cirurgia torácica minimamente invasiva

The increased use of chest computed tomography (CT) has led to an increased detection of pulmonary nodules requiring diagnostic evaluation and/or ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Gravação simultânea de eletrocardiografia e sangue invasiva pressão medida em ratos

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...