Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة جزئيا s.p.a. روش ووكالة الأدوية الإيطالية (أيفا).

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء دخان معقمة وفقا للممارسة المختبرية الجيدة (GLP).
1-البلازما جمع وتخزين
<ol><li>جمع 3 مل عينة الدم المحيطي في أنبوب يدتا K3E.</li>
	<li>الطرد المركزي الأنبوب في درجة حرارة الغرفة في س 1,880 ز لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>استرداد البلازما طافي?...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

ميرناس صغيرة الكشف (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) قادرة على ملزمة 3 ' UTR منطقة هدفهم رسول الجيش الملكي النيبالي وتثبيط و/أو المهينة غير الترميز. وبالتالي يمكن اعتبار المنظمين التعبير الجيني على المستوى متعدية الجنسيات. في العقد الماضي، وقد ارتبط ارتباطاً ميرناس عدة مع بدء السرطان والتنمية، ?...

تمثل اتفاقية حقوق الطفل الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص الأورام الخبيثة والسبب الرابع للوفيات المتصلة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. وحتى الآن، تمت الموافقة بيفاسيزوماب (ب)، وجسم [مونوكلونل] ضد عامل نمو الأوعية الدموية غشائي (VEGF)، وسيتوكسيماب (ج) أو بانيتوموماب (ع) من الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، على العلاج الخط الأول بالاقتران مع نظم العلاج الكيميائي (CT).
الطفرات في الجينات رأس ك و رأس ن هي المؤشرات الحيوية مفيدة سريرياً فقط قادرة على تحديد المرضى الذين هم الأقل احتمالاً الاستفادة من قيراط المستندة إلى EGFR مكافحة على الرغم من أن عدة دراسات أجريت للبحث عن المؤشرات الحيوية التي تنبؤية للاستجابة ليقوم ب CT، لا يزال هناك نقص كبير في المخدرات فعالة وموثوقة لاستخدامها في الممارسة السريرية1.
ميرناس يتم الكشف الصغيرة (18-25 النيوكليوتيدات في الطول) التي تنظم ترجمة الجينات المستهدفة، وتلعب دوراً حاسما في العديد من عمليات فيسيوباثولوجيكال، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتسرطن. هذه الجزيئات مستقرة جداً في السوائل بيولوجية مثل البلازما/مصل الدم والبول والبصاق، مما يجعلها قوية المؤشرات الحيوية لاستخدامها لأخذ العينات غير الغازية2. يمكننا استخدام لوحة للمشاركة في مسار الأوعية ميرناس، تهدف إلى تحديد جديد تعميم المؤشرات الحيوية قادرة على التنبؤ بالنتائج السريرية في المرضى مع اتفاقية حقوق الطفل المتنقل (بترول) تعامل مع نظام التصوير المقطعي المستندة إلى ب.
قمنا بتحليل مجموعة من 52 بترول المرضى الذين يعالجون على أساس ب CT داخل متعددة مستقبلية معشاة ذات شواهد المرحلة الثالثة للمحاكمة "الإيطالية للمحاكمة في متقدمة سرطان القولون والمستقيم" (ITACa). تمت الموافقة على هذا البروتوكول "اللجنة المحلية لأخلاقيات" (اللجنة Etico منطقة Vasta ه المعهد العلمية روماجنولو الواحد لو الاستوديو ه la Cura dei توموري (IRST) إيرككس، رقم 674) في 19عشر أيلول/سبتمبر 2007. وأعطى جميع المرضى المستنيرة قبل جمع عينة الدم. لكل مريض، جمعت عينات الدم الوريدي قبل العلاج وفي التقييم السريري الأول (بعد 8 أسابيع) لتقييم التعبير ميرنا الأساس والتحوير في أثناء فترة العلاج بالنسبة للمريض نتائج.
من خلال بحث الأدب، اخترنا ميرناس 21 يرتبط بعملية الأوعية التي هي معروفة لتكون قابلة للكشف في البلازما البشرية: ف له-مير-107، وقد-مير-126-3، ف قد-مير-145-5، ف قد-مير-194-5، قد-مير-199a-5 ف، قد مير-200b-3 ف، وقد-مير-20b-5 ف ، وقد-مير-21-5 ف، ف قد-مير-210-3، وف له-مير-221-3، ف قد-مير-24-3، ف قد مير-27 ألف-3 ف، قد-مير-29 باء-3 ف، قد-مير-335-5، ف قد-مير-424-5، ف قد-مير-497-5، ف قد مير-د 520-3 ف، قد-مير-92a-3 ف، قد-مير-17-5 وف له-مير-155-5. نحن أيضا بتحديد ف له-مير-223-3 وقد-مير-484 للتطبيع الذاتية3،،من45،6، وسل-مير-39 تنقيته من C. ايليجانس كمسمار في تطبيع خارجية. وأجريت جميع البيانات نورماليزيشنز باستخدام الأسلوب ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
ويعرض الكشف عن تعميم ميرناس بعض الصعوبات التقنية لأنه توجد الجزيئات عند مستويات منخفضة جداً في البلازما وعلى التضخيم كيميائيا صعبة نظراً لتسلسل قصيرة بها. لهذه الأسباب، نحن تحديد إجراء الذي يعتبر استخراج العضوية مع الفينول ومنهجية تستند إلى عمود ألياف زجاجية. تعميم استخراج ميرنا موضوع ساخن في ميدان خزعة سائلة، واخترنا مجموعة تجارية قد أظهرت أن تكون واحدة من الأكثر موثوقية من حيث كمية ونوعية غلة المستردة7،8. علينا تحديد بروتوكول لعكس نسخ ميرناس بإضافة محول في 5 'وذيل poly(A) إلى 3' لميرنا ناضجة لتعزيز انتقائية وخصوصية من رد فعل.
نظراً لمتانة الأسلوب، ونحن تصميم لوحات مخصصة مع تحقيقات مسبقاً رصدت ل RT-PCR لتقييم كل عينة في التكرارات وحلل 2 المرضى داخل كل لوحة، كما هو مبين في الشكل 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

هناك اهتمام متزايد في خزعة سائلة لتشخيص مرض السرطان والتشخيص والرصد العلاجي، وخلق الحاجة إلى المؤشرات الحيوية موثوق بها ومفيدة للممارسة السريرية. نقدم هنا، بروتوكولا لاستخراج، عكس تدوين وتقييم مستويات التعبير المتداولة ميرناس من عينات البلازما للمرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم (CRC). ميكرورناس (ميرناس) هي فئة من الكشف غير الترميز من النيوكليوتيدات 18-25 في الطول التي تنظم التعبير عن الجينات المستهدفة على المستوى متعدية الجنسيات، وتلعب دوراً هاما، بما في ذلك وظيفة الأوعية الموالية والمناهضة، وفي الفيزيولوجيا المرضية الأجهزة المختلفة. ميرناس مستقرة في السوائل البيولوجية مثل المصل والبلازما، مما يجعلها مثالية تعميم المؤشرات الحيوية للسرطان في التشخيص والتشخيص والعلاج في عملية صنع القرار، والرصد. تعميم استخراج ميرنا أجرى باستخدام طريقة سريعة وفعالة تتضمن منهجيات العضوية ويستند إلى العمود. لميرنا ريتروترانسكريبتيون، استخدمنا إجراء متعدد خطوة التي تعتبر بوليادينيليشن في 3 'والربط للمحول في 5' من ميرناس ناضجة، تليها ميرنا عشوائي قبل التضخيم. نحن تحديد 24-ميرنا لوحة مخصصة اختبار بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) ورصدت تحقيقات ميرنا على لوحات مخصصة الصفيف. ونحن إجراء qRT PCR لوحة يعمل على نظام PCR الوقت الحقيقي. واختير ميرناس التدبير المنزلي لتطبيع استخدام البرمجيات جينورم (ف 3، 2). تم تحليل البيانات باستخدام التعبير جناح البرمجيات (v 1.1)، وأجريت التحليلات الإحصائية. الأسلوب ثبت أن تكون موثوقة وقوية من الناحية الفنية ويمكن أن تكون مفيدة لتقييم مستويات العلامات البيولوجية في العينات السائلة مثل البلازما أو المصل.

قمنا بتحليل فريق من الأوعية المتصلة ميرناس المتداولة فيما يتعلق ببقاء خالية من التقدم (PFS)، وعموما معدل البقاء على قيد الحياة (نظام التشغيل) واستجابة موضوعية (أور) في بترول 52 علاج المرضى مع قيراط المستندة إلى ب تقييم مثل هذه المؤشرات الحيوية في عينات البلازما يمثل تحديا بس...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

نقدم بروتوكولا لتقييم مستويات التعبير المتداولة ميكرورنا (ميرناس) في عينات البلازما من مرضى السرطان. على وجه الخصوص، قمنا باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً لتعميم استخراج ميرنا والنسخ العكسي. وأخيراً، قمنا بتحليل فريق من 24 ميرناس المحدد باستخدام مسبار مسبقاً رصدت في الوقت الحقيقي لوحات مخصصة.

الكشف عن لوحة مخصصة MicroRNA المتداولة في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحث الترجمي، مثل العلاقة بين المؤشرات الحيوية المتداولة وتكهن المريض. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في فرصة تقييم التعبير عن لوحة من المؤشرات البيولوجية المتداولة مع منهجية سهلة وموثوقة مع كمية منخفضة من مواد الإدخال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج مرضى السرطان لأنها يمكن أن تحدد المؤشرات الحيوية المتداولة المفيدة في صنع القرار ومراقبة علاج المرضى.كما أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تحليل المؤشرات الحيوية المتداولة. ويمكن أيضا أن تطبق على نظم أخرى، مثل تحليل التعبير العلامات الحيوية الأنسجة لتوصيف الجزيئية للمرض. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات الاستخراج.للبدء، نقل 400 ميكرولترات من عينة البلازما إلى أنبوب RNase خالية من مليلتر. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من حل denaturing إلى الأنبوب. إضافة أربعة ميكروليتر من واحد نانومولار ارتفاع في.بعد خلط الحل، إضافة 800 ميكرولترات من حمض الفينول الكلوروفورم. دوامة الحل لمدة 60 ثانية، والطرد المركزي في السرعة القصوى لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، نقل اللوين الوارد في الطور مائي العلوي إلى أنبوب نظيف ، مع الحرص على عدم إزعاج الطور الداخلي.قياس حجم المرحلة مائي استردادها، وإضافة 1/3 حجم الإيثانول إلى lysate. ثم ضع خرطوشة تصفية في أنبوب جمع جديد. نقل ما يصل إلى 700 ميكرولترات من خليط الإيثانول-lysate إلى خرطوشة التصفية.الطرد المركزي خرطوشة مرشح لمدة 30 ثانية في 10، 000 مرة الجاذبية. بعد ذلك، قم بقياس الحجم الإجمالي للتدفق. ثم، إضافة 2/3 من حجم الإيثانول إلى الترشيح، ويخلط جيدا.ضع خرطوشة تصفية ثانية في أنبوب جمع جديد. ثم، نقل ما يصل إلى 700 ميكرولترات من العينة إلى خرطوشة، والطرد المركزي في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 30 ثانية قبل التخلص من تدفق من خلال. إضافة 700 ميكرولترات من محلول غسل ميكرورنا لخراطيش تصفية، والطرد المركزي مع أنبوب جمع في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 15 ثانية.تجاهل التدفق من خلال، ووضع خرطوشة تصفية مرة أخرى في نفس الأنبوب. بعد ذلك، قم بتحريك خرطوشة التصفية إلى أنبوب تجميع جديد. ثم، إضافة 100 ميكروليترس من محلول elution مسخ مسبقا إلى خرطوشة.الطرد المركزي خرطوشة مرشح في 10، 000 مرة الجاذبية لمدة 30 ثانية لاسترداد microRNAs. إعداد مزيج التفاعل متعدد الادينيل وفقا للبروتوكول النص. نقل اثنين microliters من العينة إلى كل بئر من لوحة رد فعل.ثم، إضافة ثلاثة microliters من كوكتيل رد فعل إلى كل بئر. دوامة وطاردة مركزية لوحة لفترة وجيزة لتدور أسفل المحتويات. بعد ذلك، ضع اللوحة في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص.إعداد مزيج مزيج التفاعل ربط في أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من الكوكتيل إلى كل بئر من لوحة التفاعل. ثم اخلط محتويات لوحة التفاعل على شاكر عند 1،900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، تليها جهاز طرد مركزي موجز من لوحة.بعد ذلك، ضع لوحة التفاعل في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص. لتنفيذ رد فعل النسخ العكسي، قم بإعداد مزيج التفاعل في أنبوب الطرد المركزي وفقًا لبروتوكول النص. ثم، إضافة 15 ميكرولترات من المزيج إلى كل بئر من لوحة تحتوي على المنتج الربط.اخلط محتويات اللوحة على شاكر عند 1،900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، تليها جهاز طرد مركزي موجز من لوحة. بعد ذلك، ضع اللوحة في دورة حرارية، واتبع الإجراء المبين في بروتوكول النص. ثم، إعداد مزيج رد فعل مير Amp، وإضافة 45 ميكرولترات من المزيج إلى كل بئر من لوحة رد فعل جديدة.بعد ذلك، إضافة خمسة ميكرولترات من المنتج RT إلى كل بئر من لوحة رد الفعل. اخلطي اللوحة على شاكر عند 1، 900 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة، متبوعة بطاردة مركزية قصيرة من اللوحة. ثم ضع اللوحة في دورة حرارية واتبع الإجراء الموضح في جدول واحد من بروتوكول النص.أولاً، تخفيف كل عينة من عينات cDNA في المخزن المؤقت TE. ثم، إعداد مزيج تفاعل PCR في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 10٪ من حجم زائد.نقل 19 ميكرولترات من مزيج رد فعل إلى كل بئر من لوحة. ختم لوحة، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، قم بتنفيذ البروتوكول الحراري على نظام RT-PCR، كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص.تم تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلي من ارتفاع في السيطرة من أجل اختيار الذي كان أفضل تركيز لإضافة في جميع عينات البلازما من هذه السلسلة حالة معينة. بفضل هذا البروتوكول ، كان من الممكن تقييم جميع المؤشرات الحيوية في كل مريض ، بالإضافة إلى علامة حيوية واحدة في سلسلة الحالات الإجمالية. في هذا البروتوكول، تم تحليل لوحة من الـ miRNAs ذات الصلة بتولد الأوعية الدموية فيما يتعلق بالبقاء الخالي من التقدم، والبقاء على قيد الحياة، ومعدل الاستجابة الموضوعي في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم الذين عولجوا بنظام العلاج الكيميائي.وبمقارنة مستويات التعبير من ميرنا بين خط الأساس والتقييم السريري الأول، لوحظت زيادة في لديه-miR-155-5p. وارتبطت هذه الزيادة بأقصر PFS وOS. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر تنفيذ الخطوات باستخدام الفينول-كلوروفورم تحت غطاء أبخرة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل وتحليل البروتينات المتداولة أو ترميز RNAs من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل تقييم لوحة أكثر شمولا من المؤشرات الحيوية المتداولة.بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخزعة السائلة لاستكشاف التعبير عن المؤشرات الحيوية المتداولة في مرضى السرطان. لا تنس أن العمل مع الدم والكواشف الكيميائية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

وسرطان الخلايا مسانج ماوس نموذج الإنتقالية الكلوي لتقييم الكمي وطولية من قبل السريرية العلاج

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

نموذج الفأر المهندسة وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتفرقة

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

في تثبيط فيفو من MicroRNA لتقليل نمو الورم في الفئران

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...