Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
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这项研究得到了罗氏公司和意大利药品管理局 (aifa) 的部分资助。

请注意:根据良好实验室规范 (glp), 在灭菌的烟罩下执行以下所有步骤。
1. 等离子体收集和储存
<ol><li>在 k3e edta 管中收集3毫升外周血样本。</li>
	<li>在室温下离心管, 温度为 1, 880 x g , 15分钟。</li>
	<li>以450μl 的等价物回收上清液等离子体。</li>
	<li>将样品存放在-80°c, 直至使用。 请注意:在收集2小时内处理外周血管。从试管中恢复血浆时, 不?...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. 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mirna 是小型非编码 rna (长度为18-25 核苷酸), 能够结合其目标信使 rna 的 3 ' utr 区域并抑制和降解它。因此, 它们可以被认为是翻译水平上的基因表达调节剂。在过去的十年中, 一些 mirna 与癌症的发生和发展有关, 使其成为诊断、预后和治疗的有用临床生物标志物。在 rnase 的保护下, mirna 以稳定的形式存在于血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物液体中, 这使得人们对其在临床实践中的</...

crc 是全世界第三大最常见的恶性肿瘤和第四大癌症相关死亡原因。迄今为止, 贝伐单抗 (b), 一种针对血管内皮生长因子 (vegf) 和西妥昔单抗 (c) 或 panitumab (p) 的单克隆抗体, 已被批准用于一线治疗联合化疗 (ct) 方案。
k-ras和n-ras基因的突变是唯一能够识别最不可能从抗 egf ct 中受益的患者的临床有用生物标志物。虽然已经进行了几项研究, 以寻找生物标志物, 预测反应的基于 b 的 ct, 仍然严重缺乏可靠和有效的药物用于临床实践 1。
mirna 是小型 rna (长度为18-25 核苷酸), 调节目标基因的翻译, 并在包括胚胎和致癌在内的众多生理病理过程中发挥着至关重要的作用。这些分子在血浆血清、尿液和痰等生物液体中具有高度稳定性, 使其成为用于非侵入性取样的坚固生物标志物 2。利用参与血管生成途径的 mirna 面板, 我们的目标是确定新的循环生物标志物, 能够预测转移性 crc (mcrc) 患者的临床结果, 使用 b 基 ct 方案治疗。
我们分析了在前瞻性多中心随机三期试验 "意大利晚期结直肠癌试验" (itaca) 中使用 b 基 ct 治疗的52例 mcrc 患者。本议定书于2007年9月19日获得地方道德委员会 (comitato etico 地区 vasta e iestito 科学 romagnolo per lo studio e la cura dei tumori (irst) ircs, 第674号)。所有患者在采集血样前都给予了知情同意。对于每个患者, 在治疗前和第一次临床评估 (8周后) 收集静脉血液样本, 以评估基线 mirna 的表达及其在治疗过程中与患者结果相关的调节。
通过对文献的研究, 我们选择了21个与已知在人类血浆中检测到的血管生成过程相关的 mirna: has-msr-107, has-msr-126-3p, has-mil5-5p, has-mil-194-5p, has-mil-595-5 p, has-msr-200b-3p, has-myr-20b-5 p, has-mr-5p, has-m30-3p, has-mir-21-1 p, has-mir-24-3p, has-mra-27a-3p, has-m9b-3p, has-msr-5p, has-msr-424-5p, has-mid9-5p, has-mir-520d-3p, has-mir-92a-3p, has-m1-17-5p 和 has-mir-155 页。我们还选择了 has-mir-223p 和 has-miR-用于内源性归一化3、4、5、6和 cel-miR-, 从线虫中纯化, 作为外源归一化的尖峰。所有数据归一化都是使用 2 (ct) 方法执行的。
循环 mirna 的检测带来了一些技术上的困难, 因为分子在等离子体中的含量很低, 而且由于其序列较短, 其扩增具有化学挑战性。出于这些原因, 我们选择了一个既考虑苯酚有机萃取的程序, 也考虑了玻璃纤维柱学方法。循环 mirna 提取是液体活检领域的一个热门话题, 我们选择了一个商业试剂盒, 在恢复的 7,8的数量和质量方面已经被证明是最可靠的.我们选择了一种逆转转录 mirna 的协议, 在成熟的 mirna 的 5 ' 和 3 ' 的聚 (a) 尾添加一个适配器 (a) 尾, 以提高反应的选择性和特异性。
考虑到该方法的鲁棒性, 我们为 rt-pcr 设计了带有预斑探针的定制板, 以评估每个样本一式两份, 并分析了每个板内的2名患者, 如图 1所示。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

人们对用于癌症诊断、预后和治疗监测的液体活检越来越感兴趣, 因此需要可靠和有用的生物标志物用于临床实践。在这里, 我们提出了一个方案, 提取, 逆转录酶和评估循环 mirna 的表达水平从血浆样本的结直肠癌 (crc)。微 rna (mirna) 是一类长度为18-25 核苷酸的非编码 rna, 它调节目标基因在平移水平上的表达, 并在生理病理中发挥重要作用, 包括促红细胞生成和抗血管生成功能。各种器官。mirna 在血清和血浆等生物液体中是稳定的, 这使得它们成为癌症诊断、预后和治疗决策及监测的理想循环生物标志物。循环 mirna 提取是使用一种快速有效的方法进行的, 该方法涉及有机方法和基于列的方法。对于 mirna 逆转录酶, 我们使用了一个多步骤的程序, 考虑了成熟 mirna 的 3 ' 时的多腺苷酸和 5 ' 处的适配器结扎, 然后是随机 mirna 预扩。我们选择了一个 24 mirna 自定义面板, 通过定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 进行测试, 并在阵列定制板上发现 mirna 探针。我们在实时 pcr 系统上进行了 qrt-pcr 板运行。使用 genorm 软件选择了用于规范化的家政中心 (第3.2 节)。使用表达套件软件 (v 1.1) 对数据进行分析, 并进行了统计分析。该方法被证明是可靠的和技术上稳健的, 可用于评估液体样品, 如血浆和血清中的生物标志物水平。

我们分析了一个与血管生成相关的循环 mirna 小组的无进展生存 (pfs), 整体生存率 (os) 和客观反应率 (orr) 的 52 mcrc 患者治疗的 b 基 ct。由于技术上的困难, 对血浆样品中的此类生物标志物的评估具有挑战性。我们使用了从患者血浆样本中提取 mirna、逆转录酶和预扩增的既定方法。按照制造商的说明, 只需稍作修改, 特别是在提取步骤中, 我们成功地评估了患者群体中的所有目?...

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Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

我们提出了一个评估循环微 rna (mirna) 在癌症患者血浆样本中的表达水平的方案。特别是, 我们使用了商业上可用的循环 mirna 提取和逆转录酶试剂盒。最后, 我们使用实时预斑探针自定义板分析了一个由24个选定 mirna 组成的面板。

转移性结直肠癌患者循环微 rna 自定义面板的检测

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

该方法有助于回答转化研究领域的一些关键问题，如循环生物标志物与患者预后的关系。该技术的主要优点是有机会评估循环生物标志物面板的表达，该方法简单可靠，投入材料量小。这种技术的影响延伸到癌症患者的治疗，因为它可以识别循环生物标志物，在患者的决策和治疗监测中有用。此外，该方法还可以提供循环生物标志物分析的见解。它也可以应用于其他系统，如组织生物标志物表达分析，用于疾病的分子表征。此方法的可视化演示至关重要，因为提取步骤很难学习。首先，将 400 微升的血浆样品转移到无 RNase 的两毫升管中。然后，在管中加入400微升变性溶液。添加四个微升的一纳米摩尔尖峰。混合溶液后，加入800微升的酸酚-氯仿。旋转溶液60秒，以最大速度离心15分钟。接下来，将上水相中所含的利酸盐转移到干净的管中，注意不要干扰相间。测量回收的水相的体积，并在酸盐中加入1/3体积的乙醇。然后，将滤芯放入新的收集管中。将多达 700 微升乙醇-分离混合物转移到滤芯中。在重力为 10，000 倍时将滤芯离心 30 秒。接下来，测量流经的总量。然后，将2/3的乙醇体积加入过滤中，并混合好。将第二个滤芯放入新的收集管中。然后，将多达 700 微升的样品转移到墨盒中，并在 10，000 倍重力下离心 30 秒，然后丢弃流经。在滤芯中加入700微升微RNA清洗溶液，并在10000倍重力下用收集管将其离心15秒。丢弃流式，将滤芯放回同一管中。在此之后，将滤芯移动到新的收集管。然后，向墨盒添加 100 微升预热洗脱溶液。将滤芯在重力为 10，000 倍的离心 30 秒，以回收微RNA。根据文本协议准备聚亚二聚二聚反应混合鸡尾酒。将样品的两微升转移到反应板的每个井中。然后，在每井中加入三个反应鸡尾酒的微升。漩涡和离心板短暂旋转的内容。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。在离心管中准备结扎反应混合鸡尾酒。接下来，在反应板的每个井中加入10微升的鸡尾酒。然后，在转速为 1，900 rpm 的摇床上混合反应板的内容，持续一分钟，然后短暂离心板。在此之后，将反应板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。要执行逆转录反应，请根据文本协议在离心管中准备反应混合物。然后，在含有结扎产品的板的每个井中加入15微升混合物。以 1，900 rpm 的转速将板的内容混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。接下来，将板放在热循环器中，并遵循文本协议中概述的步骤。然后，准备 miR-Amp 反应混合物，并在新反应板的每个井中加入 45 微升混合。在此之后，在反应板的每个井中加入五微升RT产品。以 1，900 rpm 的转速将板混合在摇床上一分钟，然后短暂离心机。然后，将板放在热循环器中，并遵循文本协议表之一中概述的步骤。首先，稀释TE缓冲液中的每个cDNA样品。然后，在离心管中准备PCR反应混合物。增加超过10%的体积。将 19 微升的反应混合物转移到板的每个井中。密封板，并短暂离心。最后，在RT-PCR系统上执行热协议，如文本协议表2所示。进行尖峰控制序列稀释，以选择在此特定案例系列的所有等离子体样品中添加的最佳浓度。得益于此协议，可以评估每个患者的所有生物标志物，以及整个病例系列中的单一生物标志物。在该协议中，对用化疗方案治疗的结直肠癌患者进行了与无进展生存、整体存活率和客观反应率相关的血管生成相关循环miRNA的小组分析。比较基线和首次临床评价之间的miRNA表达水平，观察到有miR-155-5p的增加。这一增加与较短的PFS和操作系统有关。在尝试此过程时，重要的是要记住在烟罩下使用苯酚氯仿执行步骤。按照这个程序，可以执行其他方法，如分离和分析循环蛋白或编码RNA，以回答其他问题，如评估一个更详尽的循环生物标志物面板。该技术开发后，为液体活检领域的研究人员探索癌症患者循环生物标志物的表达铺平了道路。不要忘记，使用血液和化学试剂可能极其危险，执行此程序时应始终采取手套和实验室外套等预防措施。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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肝大肠癌转移的高级动物模型：成像技术和转移性克隆性质

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

科研

癌症研究

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

转移性的型号同源小鼠肾细胞癌的临床前疗法的定量和纵向评估

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

在直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

遗传工程小鼠模型的散发性结肠直肠癌

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

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在微RNA的Vivo抑制下，降低小鼠的肿瘤生长

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循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

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Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

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免疫荧光对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的半自动PD-L1特征化及枚举

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...