Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Denne undersøgelse var delvist finansieret af Roche S.p.A. og den italienske medicin (AIFA).

Bemærk: Udføre alle de følgende trin under en steriliseret stinkskab ifølge Good Laboratory praksis (GLP).
1. plasma indsamling og opbevaring
<ol><li>Indsamle 3 mL af perifert blodprøven i en K3E EDTA tube.</li>
	<li>Der centrifugeres rør ved stuetemperatur på 1.880 x g i 15 min.</li>
	<li>Genskab den supernatanten plasma i delprøver af 450 µL.</li>
	<li>Gemme prøver på-80 ° C indtil brug. Bemærk: Processen perifert blod røret inden...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs er små ikke-kodende RNA'er (18-25 nukleotider i længde) i stand til at bindende 3' UTR region af deres mål messenger RNA og hæmmende og/eller nedværdigende det. De kan således betragtes gen expression lovgivere på translationel niveau. I det sidste årti, har flere miRNAs blevet korreleret med kræft indledning og udvikling, hvilket gør dem nyttige kliniske biomarkører for diagnose, prognose og terapi. Beskyttet af RNases, er miRNAs til stede i en stabil form i biologiske væsker som blod, plasma, serum, ...

CRC repræsenterer tredje hyppigst diagnosticeret malignitet og den fjerde årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Til dato, er bevacizumab (B), et monoklonalt antistof rettet mod vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), og cetuximab (C) eller panitumumab (P), monoklonale antistoffer rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), blevet godkendt til første-linie behandling i kombination med kemoterapi (CT) regimer.
Mutationer i K-RAS og N-RAS gener er de eneste klinisk nyttige biomarkører i stand til at identificere patienter, der er mindst tilbøjelige til at drage fordel af anti-EGFR-baserede CT. Selv om flere undersøgelser er blevet gennemført for at søge efter biomarkører, der er prædiktive for respons på B-baserede CT, er der stadig en betydelig mangel på pålidelige og effektive lægemidler til brug i klinisk praksis1.
miRNAs er små RNA'er (18-25 nukleotider i længde), der regulerer oversættelse af target gener og spiller en afgørende rolle i mange physiopathological processer, herunder embryogenese og carcinogenese. Disse molekyler er yderst stabil i biologiske væsker såsom plasma/serum, urin og spyt, hvilket gør dem robuste biomarkører til brug for non-invasiv prøveudtagning2. Ved hjælp af et panel af miRNAs involveret i angiogene pathway, vi havde til formål at identificere nye cirkulerende biomarkører i stand til at forudsige kliniske resultater hos patienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlet med en B-baserede CT regime.
Analyserede vi en serie af 52 mCRC patienter behandlet med B-baserede CT i den prospektive multicenter randomiseret fase III forsøg "italienske retssag i avanceret kolorektal Cancer" (ITACa). Denne protokol blev godkendt af det lokale etiske udvalg (Comitato Etico område Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr. 674) på 19th September 2007. Alle patienter gav informeret samtykke før blod prøve samling. For hver patient, blev venøse blodprøver indsamlet før behandling og ved den første klinisk evaluering (efter 8 uger) for at vurdere baseline miRNA udtryk og dets graduering under behandling i forhold til patienten resultat.
Gennem en søgning i litteraturen, har vi valgt 21 miRNAs korreleret med angiogene proces, der er kendt for at kunne påvises i humant plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a - 5p, har-miR-200b - 3p, har-miR-20b - 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a - 3p, har-miR-29b - 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR - 520d - 3p, har-miR-92a - 3p, har-miR-17-5 p og har-miR-155-5 p. Vi valgte også har-miR-223-3 p og har-mir-484 for endogene normalisering3,4,5,6, og cel-miR-39 renset fra C. elegans som en spike til eksogene normalisering. Alle data normalizations blev udført ved hjælp af metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Påvisning af cirkulerende miRNAs præsenterer nogle tekniske vanskeligheder, fordi molekylerne er til stede på et meget lavt niveau i plasma og deres forstærkning er kemisk udfordrende givet deres kort sekvens. Af disse grunde har valgt vi en procedure, der finder både økologisk ekstraktion med phenol og en glas-fiber kolonne-baseret metode. Cirkulerende miRNA ekstraktion er et varmt emne i feltet af flydende biopsi, og vi valgte en kommerciel kit, der har vist sig for at være en af de mest pålidelige med hensyn til mængde og kvalitet af gendannede udbytter7,8. Vi valgte en protokol til at tilbageføre transskribere miRNAs ved tilsætning af et netværkskort på 5' og en poly(A) hale til 3' af den modne miRNA at øge selektiviteten og specificitet af reaktionen.
Givet robustheden af metoden, vi designet brugerdefinerede plader med pre plettede sonder til RT-PCR til at vurdere hver prøve i to eksemplarer og analyseret 2 patienter inden for hver plade, som vist i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Der stigende interesse i flydende biopsi for kræftdiagnose, prognose og terapeutiske overvågning, oprettelse af behovet for pålidelig og nyttige biomarkører for klinisk praksis. Vi præsenterer her, en protokol til at udtrække, reverse transskribere og evaluere udtryk niveauer af cirkulerende miRNAs fra plasmaprøver af patienter med tarmkræft (CRC). MicroRNA (miRNAs) er en klasse af ikke-kodende RNA'er af 18-25 nukleotider i længde, der regulerer udtryk for target gener på translationel niveau og spiller en vigtig rolle, herunder pro - og anti-angiogene funktion, i Patofysiologi af forskellige organer. miRNAs er stabile i biologiske væsker som serum og plasma, hvilket gør dem ideelle cirkulerende biomarkører for cancer diagnose, prognose og behandling beslutningstagning og overvågning. Cirkulerende miRNA udvinding blev udført ved hjælp af en hurtig og effektiv metode, der involverer både økologisk og kolonne-baserede metoder. For miRNA retrotranscription brugte vi en multi-trins procedure, der finder polyadenylation på 3' og ligatur af et netværkskort på 5' af den modne miRNAs, efterfulgt af tilfældige miRNA pre forstærkning. Vi valgte en 24-miRNA brugerdefineret panel skal testes ved kvantitative real-time polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) og spottet miRNA sonder array brugerdefinerede plader. Vi udførte qRT-PCR pladen kører på en real-time PCR-System. Husholdning miRNAs for normalisering blev udvalgt ved hjælp af GeNorm software (v. 3.2). Data blev analyseret ved hjælp af udtrykket suite-software (version 1.1) og statistiske analyser blev udført. Metoden viste sig for at være pålidelig og teknisk robust og kunne være nyttigt at evaluere biomarkør niveauer i flydende prøver såsom plasma og/eller serum.

Vi analyseret et panel af angiogenese-relaterede cirkulerende miRNAs i forhold til progressionsfri overlevelse (PFS), total overlevelse (OS) og objektive svar sats (ORR) i en 52 mCRC patienter behandlet med B-baserede CT. Evalueringen af disse biomarkører i plasmaprøver er udfordrende på grund af tekniske vanskeligheder. Vi brugte etablerede metoder til miRNA udvinding fra patient plasmaprøver, reverse transkription og pre forstærkning. Efter fabrikantens anvisninger og med kun et pa...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Vi præsenterer en protokol for at evaluere udtryk niveauer af cirkulerende mikroRNA (miRNAs) i plasmaprøver fra patienter. Navnlig, brugte vi et kommercielt tilgængeligt kit for cirkulerende miRNA udvinding og omvendt transkription. Endelig, vi analyseret et panel af 24 udvalgte miRNAs ved hjælp af real-time pre plettede sonde brugerdefinerede plader.

Påvisning af en cirkulerende mikroRNA brugerdefineret Panel hos patienter med metastatisk kolorektal Cancer

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for translationel forskning, såsom forholdet mellem cirkulerende biomarkører og patientprognosen. Den største fordel ved denne teknik er chancen for at evaluere udtrykket af et panel af cirkulerende biomarkører med en nem og pålidelig metode med lav mængde inputmateriale. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af kræftpatienter, fordi det kunne identificere cirkulerende biomarkører nyttige i beslutningsprocessen og behandling overvågning af patienter.Også, denne metode kan give indsigt i cirkulerende biomarkører analyse. Det kan også anvendes på andre systemer, såsom væv biomarkør udtryk analyse for molekylær karakterisering af sygdom. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da udtrækningstrinnene er svære at lære.Til at begynde overføres 400 mikroliter af plasmaprøven til et RNase-frit, to milliliterrør. Derefter tilsættes 400 mikroliter af denatureringsopløsning til røret. Tilføj fire mikroliter af en nanomolar spike-in.Efter blanding af opløsningen tilsættes 800 mikroliter af syre phenol-chloroform. Vortex opløsningen i 60 sekunder, og centrifuge ved maksimal hastighed i 15 minutter. Dernæst overføre lysatet indeholdt i den øvre vandige fase til et rent rør, idet du passe på ikke at forstyrre interfasen.Der måles mængden af den vandige fase, der genvindes, og der tilsættes 1/3 volumen ethanol til lysatet. Derefter skal du placere en filterpatron i et nyt opsamlingsrør. Overfør op til 700 mikroliter af ethanollyatblandingen til filterpatronen.Centrifuge filterpatronen i 30 sekunder ved 10.000 gange tyngdekraften. Derefter skal du måle den samlede mængde flow-through. Derefter tilsættes 2/3 af mængden af ethanol til filtratet, og bland godt.An kan du placere endnu en filterpatron i et nyt opsamlingsrør. Derefter overføres op til 700 mikroliter af prøven til patronen, og centrifuge ved 10.000 gange tyngdekraften i 30 sekunder, før flow-through'en kasseres. Tilsæt 700 mikroliter microRNA-vaskeopløsning til filterpatronen, og centrifuge den med et opsamlingsrør ved 10.000 gange tyngdekraften i 15 sekunder.Kassér gennemstrømningen, og læg filterpatronen tilbage i det samme rør. Derefter skal du flytte filterpatronen til et nyt opsamlingsrør. Derefter tilsættes 100 mikroliter forvarmet elueringsopløsning til patronen.Centrifuge filterpatronen ved 10.000 gange tyngdekraften i 30 sekunder for at genvinde mikroRNA'erne. Forbered polyadenylation reaktion mix cocktail i henhold til tekstprotokollen. Overfør to mikroliter af prøven til hver brønd på en reaktionsplade.Derefter tilsættes tre mikroliter af reaktionscocktailen til hver brønd. Vortex og centrifuge pladen kort for at dreje ned indholdet. Dernæst skal du placere pladen i en termisk cycler, og følg den procedure, der er beskrevet i tekstprotokollen.Forbered ligation reaktion mix cocktail i en centrifuge rør. Dernæst tilsættes 10 mikroliter af cocktailen til hver brønd af reaktionspladen. Derefter blandes indholdet af reaktionspladen på en shaker ved 1,900 rpm i et minut, efterfulgt af en kort centrifuge af pladen.Derefter skal du placere reaktionspladen i en termisk cycler og følge den procedure, der er beskrevet i tekstprotokollen. For at udføre den omvendte transskriptionsreaktion skal reaktionsblandingen forberedes i et centrifugerør i henhold til tekstprotokollen. Derefter tilsættes 15 mikroliter af blandingen til hver brønd af pladen, der indeholder ligation produkt.Bland indholdet af pladen på en shaker ved 1, 900 rpm i et minut, efterfulgt af en kort centrifuge af pladen. Dernæst skal du placere pladen i en termisk cycler, og følg den procedure, der er beskrevet i tekstprotokollen. Derefter forberede miR-Amp reaktion mix, og tilsæt 45 mikroliter af blandingen til hver brønd af en ny reaktion plade.Derefter tilsættes fem mikroliter af RT-produktet til hver brønd af reaktionspladen. Bland pladen på en shaker ved 1, 900 rpm i et minut, efterfulgt af en kort centrifuge af pladen. Placer derefter pladen i en termisk cykelr, og følg den procedure, der er beskrevet i tabel et af tekstprotokollen.Fortyndes først hver cDNA-prøve i TE-buffer. Derefter forberede PCR reaktion mix i en centrifuge rør. 10 % af den overskydende mængde.Overfør 19 mikroliter af reaktionsblandingen til hver brønd af pladen. Forsegle pladen, og centrifuge det kort. Endelig udføre den termiske protokol på en RT-PCR-system, som skitseret i tabel to i tekstprotokollen.Serielle fortyndinger af spike-in kontrol blev udført for at vælge, hvilken var den bedste koncentration at tilføje i alle plasmaprøver i denne særlige tilfælde serie. Takket være denne protokol var det muligt at evaluere alle biomarkører hos hver enkelt patient samt en enkelt biomarkør i den samlede case-serie. I denne protokol, et panel af angiogenese-relaterede cirkulerende miRNAs i forhold til progressionsfri overlevelse, samlet overlevelse, og objektiv responsrate blev analyseret hos patienter med kolorektal cancer behandlet med en kemoterapi regime.Hvis man sammenligner ekspressionsniveauerne for miRNA mellem baseline og første kliniske evaluering, blev der observeret en stigning i has-miR-155-5p. Denne stigning var forbundet med kortere PFS og OS. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at udføre trinene ved hjælp af phenol-chloroform under en røghætte. Efter denne procedure kan andre metoder som isolering og analyse af cirkulerende proteiner eller kodning af RNA'er udføres for at besvare yderligere spørgsmål, såsom evaluering af et mere udtømmende panel af cirkulerende biomarkører.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for flydende biopsi til at udforske udtrykket af cirkulerende biomarkører hos kræftpatienter. Glem ikke, at arbejde med blod og kemiske reagenser kan være yderst farligt, og forholdsregler såsom handsker og laboratoriekittel bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

En syngen musemodel af metastaserende renalcellecarcinom for Kvantitativ og Longitudinal Vurdering af Prækliniske Terapier

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering af cirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodel af kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

En genetisk manipuleret musemodel af sporadisk kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo hæmning af MicroRNA at mindske tumor vækst i mus

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluering af kolorektal cancer risiko og prævalens ved afføring DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvågning af tumor associeret cirkulerende DNA i patientens Biofluider

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...