Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Roche S.p.A. en de Italiaanse geneesmiddelen Agentschap (AIFA).

Opmerking: Alle van de volgende stappen uit onder een gesteriliseerde zuurkast volgens goede laboratorium praktijk (GLP) uitvoeren.
1. plasma inzameling en opslag
<ol><li>Verzamelen van 3 mL van perifeer bloedmonster in de buis van een K3E EDTA.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 1,880 x g gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Het supernatant plasma in porties van 450 µL herstellen.</li>
	<li>De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik. Op...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs zijn kleine niet-coderende RNAs (18-25 nucleotiden in lengte) staat de 3' UTR regio van hun doel messenger RNA bindend en remmen en/of vernederende het. Zij kunnen dus gen expressie regelgevers op translationeel niveau worden beschouwd. In het laatste decennium, hebben verschillende miRNAs zijn gecorreleerd met kanker inleiding en ontwikkeling, waardoor ze nuttig klinische biomarkers voor diagnose, prognose en therapie. Beschermd door RNases, zijn miRNAs aanwezig in een stabiele vorm in biologische vloeistoffen zo...

CRC vertegenwoordigt de derde meest voorkomende gediagnosticeerd maligniteit en de vierde oorzaak van kanker sterfgevallen wereldwijd. Tot op heden zijn voor bevacizumab (B), een monoclonal antilichaam gericht tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), en cetuximab (C) of panitumumab (P), monoklonale antilichamen gericht tegen epidermale groeifactor receptor (EGFR), goedgekeurd eerstelijns behandeling in combinatie met chemotherapie (CT) regimes.
Mutaties in de genen van K-RAS en N-RAS zijn de enige klinisch nuttig biomarkers staat van identificatie van de patiënten die zijn minste kans om te profiteren van de anti-EGFR-gebaseerde CT. Hoewel verschillende onderzoeken zijn uitgevoerd om te zoeken naar biomarkers die voorspellende van reactie op B gebaseerde CT zijn, is er nog steeds een aanzienlijk gebrek aan betrouwbare en effectieve geneesmiddelen voor gebruik in de klinische praktijk1.
miRNAs zijn kleine RNAs (18-25 nucleotiden in de lengte) dat de vertaling van de doelgenen reguleren en een cruciale rol in tal van pathofysiologische processen, met inbegrip van de embryogenese en carcinogenese. Deze moleculen zijn zeer stabiel in biologische vloeistoffen zoals plasma/serum, urine en sputum, waardoor ze robuuste biomarkers voor niet-invasieve bemonstering2te gebruiken. Met behulp van een panel van miRNAs die betrokken zijn bij het angiogenic traject, wij gericht vast te stellen nieuwe circulerende biomarkers staat het voorspellen van klinische resultaten bij patiënten met metastatische CRC (mCRC) behandeld met B gebaseerde CT.
We analyseren van een reeks van 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT binnen de toekomstige multicentrische gerandomiseerde fase III trial "Italiaanse Trial in geavanceerde colorectaal carcinoom" (ITACa). Dit protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (Comitato Etico gebied Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (eerste) IRCCS, no. 674) op 19th September 2007. Alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming voordat bloed monster collectie. Voor elke patiënt, werden veneuze bloedmonsters verzameld vóór de behandeling en bij de eerste klinische evaluatie (na 8 weken) om basislijn miRNA expressie en haar modulatie tijdens behandeling met betrekking tot de patiënt resultaten te evalueren.
Via een zoekopdracht van de literatuur, die we geselecteerd 21 miRNAs gecorreleerd met het angiogenic-proces waarvan bekend is dat aantoonbaar in menselijk plasma: heeft-miR-107, heeft-miR-126-3 p heeft-miR-145-5 p, heeft-miR-194-5 p, heeft-miR-199a - 5p, heeft-miR-200b - 3p, heeft-miR-20b - 5p , heeft-miR-21-5 p, heeft-miR-210-3 p, heeft-miR-221-3 p, heeft-miR-24-3 p, heeft-miR-27a - 3p, heeft-miR - 29 ter - 3p, heeft-miR-335-5 p, heeft-miR-424-5 p, heeft-miR-497-5 p, heeft-miR - 520d - 3p, heeft-miR-92a - 3p, heeft-miR-17-5-p en heeft-miR-155-5 p. Wij ook geselecteerd heeft-miR-223-3 p en heeft-mir-484 endogene normalisatie3,,4,,5,6, en cel-miR-39 gezuiverd van C. elegans als een piek voor exogene normalisatie. Alle gegevens belangrijk waren uitgevoerd met behulp van de methode van de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
De detectie van circulerende miRNAs presenteert enkele technische problemen omdat de moleculen aanwezig op een zeer laag niveau in plasma zijn en hun versterking chemisch uitdagende gezien hun korte opeenvolging is. Wij hebben gekozen om deze redenen een procedure dat zowel organische extractie met fenol en een glasvezel kolom gebaseerde methodiek acht. Circulerend miRNA extractie is een hot topic op het gebied van vloeibare biopsie, en we kozen een commerciële kit die heeft aangetoond dat een van de meest betrouwbare in termen van hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde opbrengsten7,8. We kozen een protocol om te keren het transcriberen van miRNAs door de toevoeging van een adapter op 5' en een poly(A) staart naar 3' van de volwassen miRNA ter verbetering van de selectiviteit en de specificiteit van de reactie.
Gezien de robuustheid van de methode, wij ontwierp aangepaste borden met vooraf gevlekte sondes voor RT-PCR te beoordelen van elk monster in tweevoud en geanalyseerd 2 patiënten binnen elke plaat, zoals afgebeeld in figuur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Er is steeds meer belangstelling in vloeibare biopsie voor kanker-diagnose, prognose en therapeutische monitoring, de behoefte aan betrouwbare en nuttige biomarkers voor de klinische praktijk te maken. Hier presenteren we een protocol wilt ophalen, omgekeerde transcriberen en evalueren van de expressie niveaus van circulerende miRNAs uit plasma monsters van patiënten met een colorectaal carcinoom (CRC). microRNAs (miRNAs) vormen een klasse van niet-coderende RNAs van 18-25 nucleotiden in lengte die de uitdrukking van de doelgenen translationeel niveau regelen en spelen een belangrijke rol, met inbegrip van de pro - en anti-angiogenic functie, in de fysiopathologie van verschillende organen. miRNAs zijn stabiel in biologische vloeistoffen zoals serum en plasma, waardoor ze ideale circulerende biomarkers voor kanker-diagnose, prognose en behandeling besluitvorming en controle. MiRNA extractie circulerende werd uitgevoerd met behulp van een snelle en effectieve methode, waarbij zowel organische als kolom gebaseerde methoden. Voor miRNA retrotranscription gebruikten we een scriptingregel procedure dat polyadenylatie op 3' en de afbinding van een adapter op 5' van de volwassen miRNAs acht, gevolgd door willekeurige miRNA pre versterking. Wij een 24-miRNA aangepaste panel te worden getest door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) geselecteerd en de miRNA sondes gespot op matrix aangepaste platen. Wij uitgevoerd qRT-PCR plaat draait op een real-time PCR-systeem. Huishouden miRNAs voor normalisatie zijn gekozen aan de hand van de GeNorm software (v. 3.2). Gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de software van de suite van de expressie (v 1.1) en statistische analyses werden uitgevoerd. De methode bleek te zijn betrouwbaar en technisch robuust en nuttig kan zijn voor het evalueren van biomerker niveaus in vloeibare monsters zoals plasma en/of serum.

We een panel van angiogenese-gerelateerde circulerende miRNAs in verband met de progressie-vrije overleving (PFS) geanalyseerd, totale overleving (OS) en objectieve reactie (ORR) stem in een 52 mCRC patiënten behandeld met B gebaseerde CT. De evaluatie van dergelijke biomarkers in plasma monsters is uitdagend vanwege technische problemen. We gebruikten gevestigde methodes voor miRNA extractie van patiënt plasma monsters, omgekeerde transcriptie en pre versterking. Na instructies van de ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van translationeel onderzoek, zoals de relatie tussen circulerende biomarkers en de patiëntenprognose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de kans om de expressie van een paneel van circulerende biomarkers te evalueren met een eenvoudige en betrouwbare methodologie met een lage hoeveelheid inputmateriaal. De implicaties van deze techniek uit te breiden tot therapie van kankerpatiënten, omdat het kon identificeren circulerende biomarkers nuttig in de besluitvorming en behandeling monitoring van patiënten.Ook kan deze methode inzicht geven in circulerende biomarkers analyse. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals weefsel biomarker expressie analyse voor moleculaire karakterisering van de ziekte. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de extractiestappen moeilijk te leren zijn.Om te beginnen, breng 400 microliter van het plasmamonster over in een RNase-vrije, twee milliliter buis. Voeg vervolgens 400 microliter denatureringsoplossing toe aan de buis. Voeg vier microliters van een nanomolar spike-in.Voeg na het mengen van de oplossing 800 microliter zuurfenol-chloroform toe. Vortex de oplossing voor 60 seconden, en centrifuge op maximale snelheid gedurende 15 minuten. Breng vervolgens het lysaat in de bovenste waterige fase over naar een schone buis, waarbij u ervoor zorgt dat de interfase niet wordt verstoord.Meet het volume van de waterige fase hersteld, en voeg 1/3 volume ethanol aan het lysaat. Plaats vervolgens een filtercartridge in een verse opvangbuis. Breng tot 700 microliter van het ethanollysaatmengsel over naar de filtercartridge.Centrifugeren de filtercartridge gedurende 30 seconden bij 10.000 keer zwaartekracht. Meet vervolgens het totale volume van de doorstroom. Voeg vervolgens 2/3 van het volume ethanol toe aan het filtraat en meng goed.Plaats een tweede filtercartridge in een verse opvangbuis. Breng vervolgens tot 700 microliter van het monster over naar de cartridge en vercentrifuge 30 seconden bij 10.000 keer zwaartekracht voordat de flow-through wordt weggegooid. Voeg 700 microliter micropleters microRNA-wasoplossing toe aan de filtercartridge en vercentrifuger deze met een opvangbuis bij 10.000 keer zwaartekracht gedurende 15 seconden.Gooi de doorstroom weg en plaats de filtercartridge weer in dezelfde buis. Verplaats hierna de filtercartridge naar een nieuwe opvangbuis. Voeg vervolgens 100 microliters voorverwarmde elutieoplossing toe aan de cartridge.Centrifugeren de filtercartridge op 10.000 keer zwaartekracht gedurende 30 seconden om de microRNAs te herstellen. Bereid de polyadenylation reactie mix cocktail volgens het tekstprotocol. Breng twee microliter van het monster over naar elke put van een reactieplaat.Voeg vervolgens drie microliters van de reactiecocktail toe aan elke put. Vortex en centrifugeren de plaat kort om de inhoud te draaien. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven.Bereid de ligatiereactiemixcocktail in een centrifugebuis. Voeg vervolgens 10 microliter van de cocktail toe aan elke put van de reactieplaat. Meng vervolgens gedurende een minuut de inhoud van de reactieplaat op een shaker bij 1, 900 tpm, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat.Plaats hierna de reactieplaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven. Om de omgekeerde transcriptiereactie uit te voeren, bereidt u de reactiemix voor in een centrifugebuis volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 15 microliter van het mengsel toe aan elke put van de plaat die ligatieproduct bevat.Meng de inhoud van de plaat op een shaker bij 1, 900 rpm gedurende een minuut, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in het tekstprotocol wordt beschreven. Bereid vervolgens de miR-Amp-reactiemix voor en voeg 45 microliter van de mix toe aan elke put van een nieuwe reactieplaat.Voeg hierna vijf microliter van het RT-product toe aan elke put van de reactieplaat. Meng de plaat op een shaker bij 1, 900 rpm gedurende een minuut, gevolgd door een korte centrifuge van de plaat. Plaats vervolgens de plaat in een thermische cycler en volg de procedure die in tabel een van het tekstprotocol wordt beschreven.Verdun eerst elk cDNA-monster in DE-buffer. Bereid vervolgens de PCR-reactiemix in een centrifugebuis. 10% van het volume te veel toe te voegen.Breng 19 microliter van de reactiemix over op elke put van de plaat. Sluit de plaat af en vercentrifuge het kort. Ten slotte voert u het thermische protocol uit op een RT-PCR-systeem, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol.Seriële verdunningen van spike-in controle werden uitgevoerd om te kiezen welke was de beste concentratie toe te voegen in alle plasma monsters van deze specifieke case serie. Dankzij dit protocol was het mogelijk om alle biomarkers bij elke patiënt te evalueren, evenals een enkele biomarker in de algemene caseserie. In dit protocol werd een panel van angiogenesegerelateerde circulerende miRNAs met betrekking tot progressievrije overleving, algehele overleving en objectieve respons geanalyseerd bij patiënten met colorectale kanker die met een chemotherapieregime werden behandeld.Door de expressieniveaus van miRNA tussen baseline en eerste klinische evaluatie te vergelijken, werd een toename van has-miR-155-5p waargenomen. Deze stijging ging gepaard met kortere PFS en OS. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de stappen uit te voeren met behulp van fenol-chloroform onder een rookkap. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals isolatie en analyse van circulerende eiwitten of coderings-RNAs om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de evaluatie van een meer uitputtend panel van circulerende biomarkers.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van vloeibare biopsie om de expressie van circulerende biomarkers bij kankerpatiënten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met bloed en chemische reagentia zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals handschoenen en laboratoriumjas moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Een Syngenische muismodel van gemetastaseerd niercelcarcinoom voor Kwantitatieve en Longitudinale Evaluatie van de preklinische therapieën

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...