Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
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Cette étude a été partiellement financée par Roche S.p.A. et l’agence italienne du médicament (AIFA).

Remarque : Exécuter toutes les étapes suivantes sous une hotte de laboratoire stérilisé selon les bonnes pratiques de laboratoire (bpl).
1. stockage et collecte de plasma
<ol><li>Collecter 3 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube EDTA K3E.</li>
	<li>Centrifuger le tube à température ambiante comprise entre 1 880 x g pendant 15 min.</li>
	<li>Récupérer le plasma surnageant dans des parties aliquotes de 450 µL.</li>
	<li>Conserver les échan...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. 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G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. 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miARN est petit RNAs (18-25 nucléotides de long) qui lie la région 3' UTR de leurs cibles ARN messager et inhibant et/ou dégradant il non codantes. Ils peuvent donc être considérés régulateurs d’expression de gène au niveau traductionnel. Au cours de la dernière décennie, plusieurs miARN ont été corrélés avec le déclenchement du cancer et le développement, ce qui les rend utiles biomarqueurs cliniques pour le diagnostic, le pronostic et la thérapie. Protégés par des ribonucléases, miARN est présent...

CRC représente la troisième plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et la quatrième cause de décès liés au cancer dans le monde. A ce jour, (B) le bevacizumab, un anticorps monoclonal dirigé contre le facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et (C) le cetuximab ou panitumumab (P), des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), ont été approuvées pour traitement de première ligne en combinaison avec la chimiothérapie (CT).
Mutations dans les gènes de K-RAS et N-RAS sont les seuls biomarqueurs cliniquement utiles capables d’identifier les patients qui sont moins susceptibles de bénéficier de CT base anti-EGFR. Bien que plusieurs études ont été menées pour rechercher les biomarqueurs qui sont prédictifs de réponse au CT axée sur la B, il y a toujours un manque considérable de médicaments fiables et efficaces pour une utilisation en pratique clinique1.
miARN est de petits ARN (18-25 nucléotides de long) qui réglementent la traduction des gènes cibles et joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiopathologiques, y compris l’embryogenèse et cancérogenèse. Ces molécules sont très stables dans les liquides biologiques comme le plasma/sérum, urine et crachats, ce qui les rend robustes biomarqueurs à utiliser pour l’échantillonnage non invasif2. Utilisant un panel des miARN impliqués dans la voie angiogénique, notre objectif était d’identifier les nouvelles circulant biomarqueurs capables de prédire l’issue clinique chez les patients atteints de cancer Colorectal métastatique (mCRC) traités par un traitement à base de B CT.
Nous avons analysé une série de 52 mCRC patients traités par CT B-basée dans la prospective multicentrique randomisée de phase III du procès « italien du procès dans Advanced Cancer Colorectal » (ITACa). Le présent protocole a été approuvé par le Comité d’éthique Local (Comitato Etico zone Vasta e Scientifico Romagnolo Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n° 674) sur 19th septembre 2007. Tous les patients ont donné le consentement éclairé avant le prélèvement d’échantillons de sang. Pour chaque patient, les échantillons de sang veineux ont été recueillies avant traitement et à la première évaluation clinique (après 8 semaines) pour évaluer le niveau de référence miRNA expression et sa modulation pendant le traitement par rapport aux résultats pour les patients.
Grâce à une recherche de la littérature, nous avons sélectionné des 21 miARN en corrélation avec le processus angiogénique qui sont connus pour être détectable dans le plasma humain : a-miR-107, a-miR-126-3 p. p a-miR-145-5, a-miR-194-5, a-miR-199 - 5P, a-miR - 200 b - 3P, a-miR - 20 b - 5p , a-miR-21-5 p, a-miR-210-3 p, p a-miR-221-3, a-miR-24-3 p, p a-miR - 27 a - 3 p. a-miR - 29 b - 3, a-miR-335-5, p a-miR-424-5, a-miR-497-5 p, p a-miR - 520d - 3 p. a-miR - 92 a - 3, a-miR-17-5 et a-miR-155-5 p. Nous avons également sélectionné p a-miR-223-3 et a-mir-484 pour normalisation endogène3,4,5,6et cel-miR-39 épuré de c. elegans comme spike-in pour la normalisation exogène. Tous les normalisations de données ont été réalisées à l’aide de la méthode de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La détection des miARN en circulation présente quelques difficultés techniques car les molécules sont présents en très faibles quantités dans le plasma et leur amplification est chimiquement difficile compte tenu de leur courte séquence. Pour ces raisons, nous avons choisi une procédure qui tient compte tant organique d’extraction avec le phénol et une méthodologie basée sur les colonnes de fibre de verre. MiRNA extraction en circulation est un sujet d’actualité dans le domaine des liquide biopsie, et nous avons choisi une trousse commerciale qui a montré l’un des plus fiables en termes de quantité et qualité des rendements récupéré7,8. Nous avons sélectionné un protocole pour inverser transcrire des miARN par l’ajout d’un adaptateur à 5' et une queue poly (a) à 3' de la miRNA mature pour améliorer la sélectivité et la spécificité de la réaction.
Étant donné la robustesse de la méthode, nous avons conçu des plaques personnalisées avec des sondes pré tachetés de RT-PCR évaluer chaque échantillon en double exemplaire et analysé 2 patients dans chaque assiette, comme illustré à la Figure 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Il est un intérêt croissant pour liquide biopsie pour le diagnostic du cancer, de pronostic et de suivi thérapeutique, créer le besoin pour des biomarqueurs fiables et utiles pour la pratique clinique. Nous présentons ici un protocole pour extraire, reverse transcrire et évaluer les niveaux d’expression des miARN provenant d’échantillons de plasma de patients atteints de cancer colorectal (CCR) en circulation. microARN (miARN) sont une classe d’ARN non codants des 18-25 nucléotides de long qui régulent l’expression de gènes cibles au niveau traductionnel et jouent un rôle important, y compris celle de la fonction pro - et anti-angiogéniques, dans la physiopathologie de différents organes. miARN est stables dans les fluides biologiques tels que le sérum et le plasma, ce qui les rend idéal circulant de biomarqueurs pour la prise de diagnostic, pronostic et le traitement du cancer et de surveillance. MiRNA extraction en circulation a été réalisée à l’aide d’une méthode rapide et efficace qui implique des méthodes organiques et basée sur les colonnes. MiRNA fut, nous avons utilisé une procédure multi-étapes qui considère la polyadénylation en 3' et la ligature d’un adaptateur à 5' de la miARN matures, suivie de pré-amplification miRNA aléatoire. Nous avons sélectionné un panneau personnalisé 24-miRNA à tester par quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et repéré les sondes miRNA sur plaques personnalisées de tableau. Nous avons effectué qRT-PCR plaque fonctionne sur un système de PCR en temps réel. MiARN de ménage pour la normalisation ont été sélectionnés à l’aide du logiciel GeNorm (version 3.2). Données ont été analysées à l’aide du logiciel de la suite Expression (v 1.1) et les analyses statistiques ont été réalisées. La méthode s’est avérée fiable et techniquement solide et pourrait être utile pour évaluer les niveaux de biomarqueurs dans les échantillons liquides tels que le plasma ou le sérum.

Nous avons analysé un panel des miARN circulant axés sur l’angiogenèse en ce qui concerne la survie sans progression (PFS), dans l’ensemble la survie (OS) et réponse objective taux (ORR) dans une mCRC 52 patients traités par CT B-basée. L’évaluation de tels biomarqueurs dans les échantillons de plasma est difficile en raison de difficultés techniques. Nous avons utilisé des méthodes établies pour miRNA extraction des échantillons de plasma patient, transcription inverse...

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Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Nous présentons un protocole pour évaluer les niveaux d’expression des microARN (miARN) en circulation dans les échantillons de plasma de patients atteints de cancer. En particulier, nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour faire circuler l’extraction de miRNA et transcriptase inverse. Enfin, nous avons analysé un panel de 24 miARN sélectionnés à l’aide de plaques personnalisées sonde préalablement repéré en temps réel.

Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la recherche translationnelle, telles que la relation entre les biomarqueurs en circulation et le pronostic du patient. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’évaluer l’expression d’un panel de biomarqueurs circulants avec une méthodologie facile et fiable avec une faible quantité de matériel d’entrée. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie des patients atteints de cancer parce qu’elle pourrait identifier les biomarqueurs circulants utiles dans la prise de décision et la surveillance du traitement des patients.En outre, cette méthode peut fournir un aperçu de l’analyse des biomarqueurs en circulation. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que l’analyse de l’expression des biomarqueurs tissulaires pour la caractérisation moléculaire de la maladie. La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car les étapes d’extraction sont difficiles à apprendre.Pour commencer, transférez 400 microlitres de l’échantillon plasmatique dans un tube de deux millilitres sans RNase. Ajouter ensuite 400 microlitres de solution de dénaturation au tube. Ajouter quatre microlitres d’un nanomolaire spike-in.Après avoir mélangé la solution, ajouter 800 microlitres de phénol-chloroforme acide. Vortex la solution pendant 60 secondes, et centrifugeuse à vitesse maximale pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le lysate contenu dans la phase aqueuse supérieure à un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber l’interphase.Mesurer le volume de la phase aqueuse récupérée et ajouter 1/3 volume d’éthanol au lysate. Ensuite, placez une cartouche de filtre dans un tube de collecte frais. Transférer jusqu’à 700 microlitres du mélange éthanol-lysate dans la cartouche de filtre.Centrifugeuse la cartouche de filtre pendant 30 secondes à 10 000 fois la gravité. Ensuite, mesurez le volume total du flux. Ajouter ensuite les 2/3 du volume d’éthanol au filtrate et bien mélanger.Placer une deuxième cartouche de filtre dans un tube de collecte frais. Ensuite, transférez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon à la cartouche, et centrifugez à 10 000 fois la gravité pendant 30 secondes avant de jeter le flux. Ajoutez 700 microlitres de solution de lavage microARN à la cartouche de filtre, et centrifuger avec un tube de collecte à 10 000 fois la gravité pendant 15 secondes.Jetez le flow-through, et remettre la cartouche de filtre dans le même tube. Après cela, déplacez la cartouche de filtre dans un nouveau tube de collecte. Ajouter ensuite 100 microlitres de solution d’élitution préchauffée à la cartouche.Centrifugez la cartouche du filtre à 10 000 fois la gravité pendant 30 secondes pour récupérer les microARN. Préparer le cocktail de mélange de réaction de polyadenylation selon le protocole du texte. Transférer deux microlitres de l’échantillon à chaque puits d’une plaque de réaction.Ajouter ensuite trois microlitres du cocktail de réaction à chaque puits. Vortex et centrifugeuse de la plaque brièvement pour faire tourner le contenu. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte.Préparer le cocktail de mélange de réaction de ligature dans un tube de centrifugeuse. Ensuite, ajouter 10 microlitres du cocktail à chaque puits de la plaque de réaction. Ensuite, mélanger le contenu de la plaque de réaction sur un shaker à 1900 rpm pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque.Après cela, placez la plaque de réaction dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte. Pour effectuer la réaction de transcription inverse, préparez le mélange de réaction dans un tube de centrifugeuse selon le protocole de texte. Ajouter ensuite 15 microlitres du mélange à chaque puits de la plaque contenant du produit de ligature.Mélanger le contenu de la plaque sur un shaker à 1 900 r/min pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte. Ensuite, préparer le mélange de réaction miR-Amp, et ajouter 45 microlitres du mélange à chaque puits d’une nouvelle plaque de réaction.Après cela, ajouter cinq microlitres du produit RT à chaque puits de la plaque de réaction. Mélanger l’assiette sur un shaker à 1 900 r/h pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le tableau un du protocole de texte.Tout d’abord, diluer chaque échantillon cDNA dans le tampon TE. Ensuite, préparez le mélange de réaction PCR dans un tube de centrifugeuse. ajoutant 10% du volume en excès.Transférer 19 microlitres du mélange de réaction à chaque puits de la plaque. Sceller brièvement la plaque et la centrifuger. Enfin, effectuez le protocole thermique sur un système RT-PCR, tel que décrit dans le tableau deux du protocole texte.Des dilutions périodiques du contrôle spike-in ont été exécutées afin de choisir quelle était la meilleure concentration à ajouter dans tous les échantillons de plasma de cette série particulière de cas. Grâce à ce protocole, il a été possible d’évaluer tous les biomarqueurs chez chaque patient, ainsi qu’un seul biomarqueur dans la série globale de cas. Dans ce protocole, un panneau des miARN circulants angiogenèse-connexes par rapport à la survie progression-libre, à la survie globale, et au taux de réponse objectif a été analysé dans les patients présentant le cancer côlorectal traité avec un régime de chimiothérapie.En comparant les niveaux d’expression du miRNA entre la ligne de base et la première évaluation clinique, une augmentation du has-miR-155-5p a été observée. Cette augmentation a été associée à un SFP et à un système d’exploitation plus courts. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les étapes en utilisant phénol-chloroforme sous un capot de fumée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’isolement et l’analyse des protéines circulantes ou le codage des ARN peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, comme l’évaluation d’un panel plus exhaustif de biomarqueurs en circulation.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biopsie liquide pour explorer l’expression des biomarqueurs circulants chez les patients atteints de cancer. N’oubliez pas que le travail avec le sang et les réapprovisionnements chimiques peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que les gants et le manteau de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

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Cancer Research

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