Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Diese Studie wurde teilweise durch Roche s.p.a. und die italienische Agentur für Arzneimittel (AIFA) finanziert.

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem sterilisierten Abzug entsprechend gute Labor Praxis (GLP).
(1) Plasma Datenerhebung und-Speicherung
<ol><li>Sammeln Sie 3 mL des peripheren Blutprobe in einem K3E EDTA-Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur bei 1.880 X g für 15 min.</li>
	<li>Der Überstand Plasma in Aliquote von 450 µL zu erholen.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung. Hinwe...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge) in der Lage, verbindliche 3' UTR und Umgebung ihr Ziel Boten-RNA und Hemmung bzw. es erniedrigend. Sie können somit gen Ausdruck Regulierungsbehörden auf der translationalen Ebene betrachtet werden. In den letzten zehn Jahren haben mehrere MiRNAs mit Krebs Initiierung und Entwicklung, so dass sie nützliche klinische Biomarker für die Diagnose, Prognose und Therapie korreliert. Geschützt durch RNases, sind MiRNAs in eine stabile Form in biologi...

CRC ist die dritte Bösartigkeit und die vierte Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit am häufigsten diagnostiziert. Bis heute sind Bevacizumab (B), einem monoklonalen Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), und (C) Cetuximab oder Panitumumab (P), monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), zugelassen First-Line-Behandlung in Kombination mit Chemotherapie (CT)-Regimen.
Mutationen im K-RAS und N-RAS -gen sind die einzige klinisch nützlich Biomarker identifizieren Patienten, die am seltensten zugunsten von Anti-EGFR-basierten CT. Obwohl mehrere Studien sind, zur Suche nach Biomarkern, die vorausschauende Antwort auf B-basierten CT sind durchgeführt worden, gibt es immer noch ein erheblichen Mangel an zuverlässige und wirksame Arzneimittel für den Einsatz in der klinischen Praxis1.
MiRNAs sind kleine RNAs (18-25 Nukleotide in der Länge), die die Übersetzung von Zielgenen regulieren und spielen eine entscheidende Rolle in zahlreichen pathophysiologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und in der Karzinogenese. Diese Moleküle sind hochstabile in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma/Serum, Urin und Speichel, die sie macht, robuste Biomarker für nicht-invasive Probenahme2verwenden. Mit einem Panel von MiRNAs angiogenen Weg beteiligt, wir wollten identifizieren neuer Biomarker zur Vorhersage klinische Ergebnisse bei Patienten mit metastasiertem CRC (mCRC) im Umlauf mit einer B-basierten CT-Therapie behandelt.
Wir analysieren eine Reihe von 52 mCRC Patienten mit B-basierten CT innerhalb der prospektiven multizentrischen randomisierten phase III Studie "italienische Trial in Advanced Colorectal Krebs" (ITACa). Dieses Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comitato Etico Bereich Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Nr. 674) auf 19th September 2007. Alle Patienten gaben Einwilligung vor Blut Musterkollektion. Für jeden Patienten wurden venöse Blutproben vor der Behandlung und bei der ersten klinischen Untersuchung (nach 8 Wochen) gesammelt, um die Basislinie MiRNA Ausdruck und seine Modulation während der Behandlung in Bezug auf Patienten-Outcome zu bewerten.
Durch eine Suche der Literatur ausgewählt wir 21 MiRNAs korreliert mit dem Angiogenese-Prozess, die bekanntermaßen im menschlichen Plasma nachweisbar sind: hat-MiR-107, hat-MiR-126-3 p, hat-MiR-145-5-p, hat-MiR-194-5 p, hat-MiR-199a - 5P, hat-MiR - 200 b - 3p, hat-MiR - 20 b - 5P , hat-MiR-21-5 p, hat-MiR-210-3 p, hat-MiR-221-3 p, hat-MiR-24-3 p, hat-MiR-27a - 3P, hat-MiR - 29 b - 3p, hat-MiR-335-5 p, hat-MiR-424-5 p, hat-MiR-497-5 p, hat-MiR - 520d - 3p, hat-MiR-92a - 3P, hat-MiR-17-5 p und hat-MiR-155-5 p. Auch wir ausgewählt hat-MiR-223-3 p und hat-Mir-484 für endogene Normalisierung3,4,5,6und Cel-MiR-39 von C. Elegans als Spike-in für exogene Normalisierung gereinigt. Alle Daten Normierungen wurden mit 2 ̂ ̄(ΔΔCt) Methode durchgeführt.
Der Nachweis von zirkulierenden MiRNAs präsentiert einige technischen Schwierigkeiten, weil die Moleküle auf einem sehr niedrigen Niveau im Plasma sind und ihre Verstärkung chemisch anspruchsvollen angesichts ihrer kurze Sequenz ist. Aus diesen Gründen haben wir ein Verfahren, das organische Extraktion mit Phenol und einem Glasfaser Spalte basierenden Methodik hält ausgewählt. Zirkulierenden MiRNA-Extraktion ist ein heißes Thema im Bereich der flüssigen Biopsie und eine kommerzielle Kit, das gezeigt hat, zu einem der zuverlässigsten ausgewählt wurden in Bezug auf Menge und Qualität der wiederhergestellten Erträge7,8. Wir haben ein Protokoll zum Umkehren MiRNAs durch das Hinzufügen eines Adapters an 5' und ein Poly-Tail, 3' die Reife MiRNA zur Verbesserung der Selektivität und Spezifität der Reaktion zu transkribieren.
Die Robustheit der Methode gegeben, wir entwickelt kundenspezifische Platten mit Pre-gefleckte Sonden für RT-PCR zu jeder Probe in zweifacher Ausfertigung zu beurteilen und 2 Patienten innerhalb jeder Platte analysiert, wie in Abbildung 1dargestellt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Es ist wachsendes Interesse an flüssigen Biopsie für Diagnose, Prognose und therapeutische Begleitung, die Notwendigkeit zuverlässiger und nützlicher Biomarker für die klinische Praxis zu schaffen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu extrahieren, rückwärts zu transkribieren und bewerten die Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MiRNAs aus Plasma-Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom (CRC). Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierende RNAs von 18-25 Nukleotide in der Länge, die den Ausdruck der Zielgene translationalen Ebene Regeln und spielen eine wichtige Rolle, einschließlich der Pro und Anti-angiogenen Funktion in die Physiopathologie des verschiedenen Organen. MiRNAs sind stabil in biologischen Flüssigkeiten wie Serum und Plasma, das macht sie ideal zirkulierende Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose und Behandlung Entscheidungen und Überwachung. Zirkulierenden MiRNA Extraktion erfolgte mittels eine schnelle und effektive Methode, die sowohl organische als auch Spalte basierenden Methoden beinhaltet. Für MiRNA Retrotranscription verwendeten wir ein Multi-Schritt-Verfahren, das Polyadenylation auf 3' und der Ligatur eines Adapters auf 5' von den Reifen MiRNAs, gefolgt von zufälligen MiRNA Vorverstärkung hält. Wir wählten einen 24-MiRNA benutzerdefinierten Bereich durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) getestet werden und die MiRNA-Sonden auf Array benutzerdefinierter Platten entdeckt. Wir führten qRT-PCR Platte läuft auf einer Echtzeit-PCR-System. Zimmermädchen MiRNAs für Normalisierung wurden ausgewählt, mit GeNorm-Software (v. 3.2). Daten wurden analysiert mit Expression Suite Software (V 1.1) und statistische Analysen wurden durchgeführt. Die Methode erwies sich als zuverlässig und technisch robust sein und könnte nützlich sein, Biomarker Ebenen in flüssigen Proben wie Plasma/Serum oder zu bewerten.

Analysierten wir ein Gremium von Angiogenese-bezogene zirkulierenden MiRNAs in Bezug auf progressionsfreies Überleben (PFS), insgesamt überleben (OS) und objektives Ansprechen (ORR) in einem 52 mCRC behandelt Patienten mit B-basierten CT. Die Bewertung solcher Biomarker in Plasma-Proben ist aus technischen Gründen schwierig. Wir haben bewährte Methoden für MiRNA-Extraktion aus Patienten Plasmaproben, reverse Transkription und Vorverstärkung. Nach den Anweisungen des Herstellers und ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im bereichder translationaler Forschung zu beantworten, wie z. B. die Beziehung zwischen zirkulierenden Biomarkern und der Patientenprognose. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die Expression eines Panels von zirkulierenden Biomarkern mit einer einfachen und zuverlässigen Methodik mit geringer Menge an Eingangsmaterial zu bewerten. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebspatienten, da sie zirkulierende Biomarker identifizieren könnte, die für die Entscheidungsfindung und Behandlungsüberwachung von Patienten nützlich sind.Diese Methode kann auch Einblicke in die Analyse von zirkulierenden Biomarkern geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie Gewebe Biomarker Expressionsanalyse für die molekulare Charakterisierung von Krankheiten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Extraktionsschritte schwer zu erlernen sind.Übertragen Sie zunächst 400 Mikroliter der Plasmaprobe in eine RNase-freie, zweiMilliliter-Röhre. Dann 400 Mikroliter Denaturierungslösung in das Rohr geben. Fügen Sie vier Mikroliter ein-Nanomolar-Spike-in hinzu.Nach dem Mischen der Lösung 800 Mikroliter Säurephenol-Chlorform hinzufügen. Wirbel die Lösung für 60 Sekunden, und Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten. Als nächstes übertragen Sie das in der oberen wässrigen Phase enthaltene Lysat in ein sauberes Rohr, wobei darauf zu achten ist, dass die Interphase nicht gestört wird.Messen Sie das Volumen der wiedergewonnenen wässrigen Phase und fügen Sie dem Lysat ein 1/3 Volumen Ethanol hinzu. Legen Sie dann eine Filterpatrone in ein frisches Sammelrohr. Bis zu 700 Mikroliter des Ethanollysatgemisches auf die Filterpatrone übertragen.Zentrifugieren Sie die Filterpatrone 30 Sekunden lang bei 10.000-facher Schwerkraft. Als Nächstes messen Sie das Gesamtvolumen des Durchflusses. Dann 2/3 des Ethanolvolumens in das Filtrat geben und gut mischen.Legen Sie eine zweite Filterpatrone in ein frisches Sammelrohr. Übertragen Sie dann bis zu 700 Mikroliter der Probe auf die Patrone und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang mit der 10.000-fachen Schwerkraft, bevor Sie den Durchfluss entsorgen. Fügen Sie der Filterpatrone 700 Mikroliter microRNA-Waschlösung hinzu und zentrifugieren Sie sie mit einem Sammelrohr mit 10.000-facher Schwerkraft für 15 Sekunden.Entsorgen Sie den Durchfluss, und legen Sie die Filterpatrone wieder in das gleiche Rohr. Danach verschieben Sie die Filterpatrone in ein neues Sammelrohr. Fügen Sie dann 100 Mikroliter vorgeheizte Elutionslösung in die Patrone ein.Zentrifugieren Sie die Filterpatrone mit der 10.000-fachen Schwerkraft 30 Sekunden lang, um die microRNAs wiederherzustellen. Bereiten Sie den Polyadenylierungs-Reaktionsmix-Cocktail gemäß dem Textprotokoll vor. Zwei Mikroliter der Probe auf jeden Brunnen einer Reaktionsplatte übertragen.Dann fügen Sie drei Mikroliter des Reaktionscocktails zu jedem Brunnen hinzu. Wirbel und Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt zu drehen. Legen Sie als Nächstes die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren.Bereiten Sie den Ligationsreaktionsmix-Cocktail in einem Zentrifugenrohr vor. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter des Cocktails zu jedem Brunnen der Reaktionsplatte hinzu. Dann mischen Sie den Inhalt der Reaktionsplatte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte.Legen Sie danach die Reaktionsplatte in einen thermischen Cycler und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Um die umgekehrte Transkriptionsreaktion durchzuführen, bereiten Sie den Reaktionsmix in einem Zentrifugenrohr gemäß dem Textprotokoll vor. Dann fügen Sie 15 Mikroliter der Mischung zu jedem Brunnen der Platte enthalten Ligation Produkt.Mischen Sie den Inhalt der Platte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte. Legen Sie als Nächstes die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren. Dann bereiten Sie den miR-Amp-Reaktionsmix vor und fügen Sie 45 Mikroliter der Mischung zu jedem Brunnen einer neuen Reaktionsplatte hinzu.Danach fünf Mikroliter des RT-Produkts in jeden Brunnen der Reaktionsplatte geben. Mischen Sie die Platte auf einem Shaker bei 1, 900 U/min für eine Minute, gefolgt von einer kurzen Zentrifuge der Platte. Legen Sie dann die Platte in einen thermischen Cycler, und folgen Sie dem in Tabelle 1 des Textprotokolls beschriebenen Verfahren.Verdünnen Sie zunächst jede cDNA-Probe im TE-Puffer. Bereiten Sie dann den PCR-Reaktionsmix in einem Zentrifugenrohr vor. 10 % des Volumens im Übermaß.Übertragen Sie 19 Mikroliter der Reaktionsmischung auf jeden Brunnen der Platte. Versiegeln Sie die Platte, und zentrieren Sie sie kurz. Führen Sie schließlich das thermische Protokoll auf einem RT-PCR-System aus, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben.Serielle Verdünnungen der Spike-in-Kontrolle wurden durchgeführt, um zu wählen, welche die beste Konzentration war, die in allen Plasmaproben dieser speziellen Fallserie hinzugefügt werden sollte. Dank dieses Protokolls konnten alle Biomarker bei jedem einzelnen Patienten sowie ein einzelner Biomarker in der gesamten Fallreihe ausgewertet werden. In diesem Protokoll wurde ein Panel von angiogenesebedingten zirkulierenden miRNAs in Bezug auf progressionsfreies Überleben, Gesamtüberleben und objektive Ansprechrate bei Patienten mit Dickdarmkrebs analysiert, die mit einer Chemotherapie behandelt wurden.Vergleicht man die Expressionsniveaus von miRNA zwischen der Baseline und der ersten klinischen Bewertung, wurde ein Anstieg von has-miR-155-5p beobachtet. Dieser Anstieg war mit kürzeren PFS und OS verbunden. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, daran zu denken, die Schritte mit Phenol-Chlor-Form unter einer Dunstabzugshaube durchzuführen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Isolierung und Analyse zirkulierender Proteine oder kodierende RNAs durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Auswertung eines umfassenderen Panels zirkulierender Biomarker.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der flüssigen Biopsie, um die Expression von zirkulierenden Biomarkern bei Krebspatienten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut und chemischen Reagenzien extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Labormantel sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Forschung

Krebsforschung

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Ein Syngenetische Maus-Modell von metastasierendem Nierenzellkarzinom für Quantitative und Longitudinal Beurteilung der vorklinischen Therapien

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Bewertung des Darmkrebsrisikos und der Prävalenz durch Stuhl-DNA-Integritätsnachweis

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...