Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

מחקר זה מומן באופן חלקי על ידי רוש S.p.A., סוכנות התרופות האיטלקית (דמרי).

הערה: לבצע את כל הפעולות הבאות תחת ברדס fume סטיריליים על פי התרגול מעבדה טובה (GLP).
1. פלזמה האיסוף והאחסון
<ol><li>לאסוף 3 מ"ל של דם היקפיים צינור K3E EDTA.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר ב x 1,880 g למשך 15 דקות.</li>
	<li>לשחזר פלזמה supernatant ב aliquots של 450 µL.</li>
	<li>לאחסן את הדגימו...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3' UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs...

CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).
מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני1.
miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית2. באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.
ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט "האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס" (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.
דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר - 200 ב' - 3p, יש-מיר - 20 ב' - 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר - 3p, יש-מיר-29b - 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר - 520d - 3p, יש-מיר-92a - 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני3,4,5,6, צ'ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5' ו זנב poly(A) כדי 3' של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.
בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro - ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3' ו את מצדו של מתאם-5' של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס' 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.

ניתחנו את פאנל של הקשורות אנגיוגנזה miRNAs במחזור ביחס ההישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS), הכולל הישרדות (OS) ותגובות האובייקטיבית לדרג (אור) ב mCRC 52 חולים שטופלו עם טי מבוסס-B הערכת סמנים כזה בדגימות הפלסמה הוא מאתגר בשל קשיים טכניים. השתמשנו בשיטות הוקמה לחילוץ miRNA דגימות פלסמה הח?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר התרגומי, כגון הקשר בין סמנים ביולוגיים במחזור לבין הפרוגנוזה של המטופל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההזדמנות להעריך את הביטוי של פאנל של סמנים ביולוגיים במחזור עם מתודולוגיה קלה ואמינה עם כמות נמוכה של חומר קלט. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי טיפול של חולי סרטן כי זה יכול לזהות סמנים ביולוגיים במחזור שימושי בקבלת החלטות וניטור טיפול של חולים.כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה על ניתוח סמנים ביולוגיים במחזור. זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון ניתוח ביטוי סמן ביולוגי רקמות עבור אפיון מולקולרי של מחלה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו שלבי החילוץ קשה ללמוד.כדי להתחיל, להעביר 400 microliters של דגימת הפלזמה לתוך RNase חינם, שני מיליליטר צינור. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון denaturing לצינור. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של ספייק-אין ננו-מולאר אחד.לאחר ערבוב הפתרון, מוסיפים 800 מיקרוליטרים של חומצה פנול-כלורופורם. Vortex הפתרון במשך 60 שניות, צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר את lysate הכלול בשלב המים העליון לצינור נקי, דואג לא להפריע interphase.למדוד את נפח השלב הממיקי התאושש, ולהוסיף 1/3 נפח של אתנול לליזט. לאחר מכן, מניחים מחסנית מסנן לתוך צינור איסוף טרי. מעבירים עד 700 מיקרוליטרים של תערובת האתנול-ליסאט למחסנית המסנן.צנטריפוגה מחסנית המסנן במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים כבידה. לאחר מכן, למדוד את הנפח הכולל של זרימה דרך. לאחר מכן, מוסיפים 2/3 מנפח האתנול לסינון, ומערבבים היטב.מניחים מחסנית סינון שנייה בצינור איסוף טרי. לאחר מכן, להעביר עד 700 microliters של המדגם למחסנית, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות לפני השלכת הזרימה דרך. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפת microRNA למחסנית המסנן, וצנטריפוג אותו עם צינור איסוף ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 15 שניות.השלך את הזרימה דרך, והחזר את מחסנית המסנן לאותו צינור. לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון אלוט שחומם מראש למחסנית.צנטריפוגה מחסנית המסנן ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות כדי לשחזר את microRNAs. מכינים את תערובת תגובת הפוליאדנילציה לפי פרוטוקול הטקסט. מעבירים שני מיקרוליטרים של הדגימה לכל באר של צלחת תגובה.לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של קוקטייל התגובה לכל באר. מערבולת וצנטריפוגה הצלחת בקצרה כדי לסובב את התוכן. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט.מכינים את תערובת תגובת הקשירה בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים 10 microliters של הקוקטייל לכל באר של צלחת התגובה. לאחר מכן, מערבבים את התוכן של צלחת התגובה על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת.לאחר מכן, מקם את לוח התגובה במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את תגובת שעתוק הפוכה, להכין את תערובת התגובה בצינור צנטריפוגה על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של הצלחת המכילה מוצר קשירה.מערבבים את תכולת הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הכינו את תערובת התגובות miR-Amp, והוסיפו 45 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של צלחת תגובה חדשה.לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של המוצר RT לכל באר של צלחת התגובה. מערבבים את הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.תחילה, לדלל כל דוגמת cDNA במאגר TE. לאחר מכן, להכין את התגובה PCR לערבב צינור צנטריפוגה. הוספת 10% מאמצעי האחסון עודף.מעבירים 19 מיקרוליטרים של תערובת התגובה לכל באר של הצלחת. לאטום את הצלחת, צנטריפוגה זה לזמן קצר. לבסוף, בצע את הפרוטוקול התרמי במערכת RT-PCR, כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.דילול סדרתי של שליטה ספייק-in בוצעו על מנת לבחור איזה היה הריכוז הטוב ביותר להוסיף את כל דגימות הפלזמה של סדרת מקרה מסוימת זו. הודות לפרוטוקול זה, ניתן היה להעריך את כל סמנים ביולוגיים בכל חולה, כמו גם סמן ביולוגי יחיד בסדרת המקרים הכוללת. בפרוטוקול זה, פאנל של miRNAs במחזור הקשורים אנגיוגנזה ביחס הישרדות ללא התקדמות, ההישרדות הכוללת, שיעור התגובה האובייקטיבית נותחה בחולים עם סרטן המעי הגס שטופלו במשטר כימותרפיה.השוואת רמות הביטוי של miRNA בין הערכה קלינית בסיסית הראשונה, עלייה יש-miR-155-5p נצפתה. עלייה זו הייתה משויכת ל- PFS ו- OS קצרים יותר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את השלבים באמצעות פנול-כלורופורם מתחת למכסה המנוע אדים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד וניתוח של חלבונים במחזור או RNAs קידוד על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו הערכה של פאנל ממצה יותר של סמנים ביולוגיים במחזור.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופסיה הנוזלית לחקור את הביטוי של סמנים ביולוגיים במחזור חולי סרטן. אל תשכח כי עבודה עם דם וריג'ים כימיים יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון כפפות מעיל מעבדה תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

דגם עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס ספוראדי

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...