Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
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Questo studio è stato parzialmente finanziato da Roche s.p.a. e l'agenzia italiana di farmaci (AIFA).

Nota: Eseguire tutti i passaggi seguenti sotto una cappa sterilizzati secondo buona pratica di laboratorio (BPL).
1. plasma raccolta e conservazione
<ol><li>Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo di K3E EDTA.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a temperatura ambiente a 1.880 x g per 15 min.</li>
	<li>Recuperare il plasma surnatante in aliquote di 450 µ l.</li>
	<li>Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo. Nota: Processo...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. 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(88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

i miRNA sono piccoli non-codificazione RNAs (18-25 nucleotidi di lunghezza) in grado di associazione regione 3' UTR del loro obiettivo di RNA messaggero e d'inibizione e/o degradanti si. Possono quindi essere considerati regolatori di espressione genica a livello traduzionale. Nell'ultimo decennio, diversi miRNA sono stati correlati con l'inizio del cancro e lo sviluppo, che li rende utile clinici biomarcatori per la diagnosi, prognosi e terapia. Protetto da RNasi, Mirna sono presenti in una forma stabile nei liquidi bio...

CRC rappresenta il terzo più frequentemente diagnosticata la malignità e la quarta causa di morte per cancro in tutto il mondo. Ad oggi, (B) il bevacizumab, un anticorpo monoclonale diretto contro il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) e (C) di cetuximab o panitumumab (P), anticorpi monoclonali diretti contro il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), sono stati approvati per trattamento di prima linea in combinazione con regimi di chemioterapia (CT).
Mutazioni dei geni K-RAS e N-RAS sono i biomarcatori clinicamente utili soli in grado di identificare i pazienti che sono meno probabili trarre giovamento da basati su anti-EGFR CT. Anche se parecchi studi sono stati condotti per la ricerca di biomarcatori che sono predittivi di risposta al CT basato su B, c'è ancora una sostanziale mancanza di farmaci affidabile ed efficace per l'uso nella pratica clinica1.
i miRNA sono piccole molecole di RNA (18-25 nucleotidi di lunghezza) che regolano la traduzione dei geni bersaglio e svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi fisiopatologici, tra cui l'embriogenesi e carcinogenesi. Queste molecole sono altamente stabili nei liquidi biologici come plasma/siero, urina e dell'espettorato, che li rende robusti biomarcatori da utilizzare per il campionamento non invasivo2. Utilizzando un pannello di miRNA coinvolti nel pathway angiogenici, abbiamo mirato a identificare circolanti nuovi biomarcatori in grado di predire il risultato clinico in pazienti con CRC metastatico (mCRC) trattati con un regime di CT basato su B.
Abbiamo analizzato una serie di 52 mCRC pazienti trattati con CT B-base entro il prospettico multicentrico randomizzato di fase III prova "Italiano Trial in Advanced cancro colorettale" (ITACa). Il presente protocollo è stato approvato dal comitato etico locale (Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, n. 674) su 19th settembre 2007. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato prima di raccolta del campione di sangue. Per ogni paziente, campioni di sangue venosi sono stati raccolti prima del trattamento e alla prima valutazione clinica (dopo 8 settimane) per valutare l'espressione dei miRNA basale e la sua modulazione durante il trattamento in relazione al risultato paziente.
Attraverso una ricerca della letteratura, abbiamo selezionato 21 miRNAs correlato con il processo angiogenetico che sono noti per essere rilevabile nel plasma umano: ha-miR-107, ha-miR-126-3 p, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, ha-miR-210-3 p, p ha-miR-221-3, ha-miR-24-3 p, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, ha-miR-424-5 p, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 e ha-miR-155-5 p. Abbiamo inoltre selezionato ha-miR-223-3 p e ha-mir-484 per normalizzazione endogeno3,4,5,6e cel-miR-39 purificato dal c. elegans come spike-in per la normalizzazione esogeno. Le normalizzazioni di tutti i dati sono state eseguite utilizzando il metodo di ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La rilevazione di Mirna in circolazione presenta alcune difficoltà tecniche, perché le molecole sono presenti a livelli molto bassi nel plasma e la loro amplificazione è chimicamente impegnativo dato loro breve sequenza. Per queste ragioni, abbiamo selezionato una procedura che ritiene sia organico estrazione con fenolo e una metodologia basata su colonna di fibra di vetro. Estrazione di miRNA di circolazione è un tema caldo nel campo della biopsia liquida, e abbiamo scelto un kit commerciale che ha dimostrato di essere uno dei più affidabili in termini di quantità e qualità di rendimenti recuperati7,8. Abbiamo selezionato un protocollo per invertire trascrivere Mirna dall'aggiunta di un adattatore a 5' e una coda di poli (a) a 3' del quieto maturo per migliorare la selettività e specificità della reazione.
Data la robustezza del metodo, abbiamo progettato targhe personalizzate con sonde pre-macchiati per RT-PCR valutare ciascun campione in duplicato e analizzati 2 pazienti all'interno di ogni piatto, come mostrato nella Figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Vi è crescente interesse nella biopsia liquida per cancro diagnosi, prognosi e monitoraggio terapeutico, creando la necessità di biomarcatori affidabili e utili per la pratica clinica. Qui, presentiamo un protocollo per estrarre, reverse trascrivere e valutare i livelli di espressione di Mirna da campioni di plasma di pazienti con cancro colorettale (CRC) di circolazione. i microRNA (Mirna) sono una classe di RNA non codificanti di 18-25 nucleotidi di lunghezza che regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello traduzionale e svolgono un ruolo importante, compreso quello della funzione di pro - e anti-angiogenici, nella fisiopatologia delle vari organi. i miRNA sono stabili nei fluidi biologici come siero e plasma, che li rende ideale circolanti biomarcatori per il processo decisionale di diagnosi, prognosi e trattamento di cancro e monitoraggio. Estrazione di miRNA in circolazione è stato effettuato usando un metodo rapido ed efficace che coinvolge metodologie biologiche e basata su colonne. Per retrotrascrizione di miRNA, abbiamo utilizzato una procedura multi-step che considera poliadenilazione al 3' e la legatura di un adattatore a 5' dei miRNA maturi, seguiti pre-dall'amplificazione miRNA casuale. Abbiamo selezionato un pannello personalizzato 24-miRNA per essere testato da reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e macchiato le sonde miRNA su targhe personalizzate matrice. Abbiamo effettuato qRT-PCR piastra viene eseguito su un sistema di PCR in tempo reale. Le pulizie miRNA per normalizzazione sono stati selezionati utilizzando il software GeNorm (v. 3.2). I dati sono stati analizzati utilizzando Expression suite software (v 1.1) e le analisi statistiche sono state eseguite. Il metodo ha dimostrato di essere affidabile e tecnicamente robusto e potrebbe essere utile per valutare i livelli di biomarcatore in campioni liquidi come plasma e/o del siero.

Abbiamo analizzato un panel di Mirna circolanti angiogenesi-correlate in relazione alla sopravvivenza libera da progressione (PFS), il tasso globale del sopravvivenza (OS) e risposta obiettiva (ORR) in un mCRC 52 pazienti trattati con B-base CT. La valutazione di tali biomarcatori in campioni di plasma è impegnativa a causa di difficoltà tecniche. Abbiamo utilizzato metodi consolidati per l'estrazione di miRNA da campioni di plasma paziente, trascrizione d'inversione e pre-amplificazion...

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Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca traslizionale, come la relazione tra i biomarcatori circolanti e la prognosi del paziente. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di valutare l'espressione di un pannello di biomarcatori circolanti con una metodologia facile e affidabile con bassa quantità di materiale di input. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dei pazienti oncologici perché potrebbe identificare biomarcatori circolanti utili nel processo decisionale e nel monitoraggio del trattamento dei pazienti.Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sull'analisi dei biomarcatori circolanti. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'analisi dell'espressione del biomarcatore tissutale per la caratterizzazione molecolare della malattia. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di estrazione sono difficili da imparare.Per iniziare, trasferire 400 microlitri del campione di plasma in un tubo privo di RNasi e a due millilitri. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione di denaturazione al tubo. Aggiungere quattro microlitri di un chiodo nanomolare.Dopo aver miscelato la soluzione, aggiungere 800 microlitri di fenolo-cloroformio acido. Vortice la soluzione per 60 secondi e centrifuga alla massima velocità per 15 minuti. Successivamente, trasferire il lysate contenuto nella fase acquosa superiore in un tubo pulito, facendo attenzione a non disturbare l'interfase.Misurare il volume della fase acquosa recuperata e aggiungere 1/3 di volume di etanolo al lysate. Quindi, posizionare una cartuccia di filtro in un nuovo tubo di raccolta. Trasferire fino a 700 microlitri della miscela etanolo-glisato sulla cartuccia del filtro.Centrifugare la cartuccia del filtro per 30 secondi a 10.000 volte la gravità. Quindi, misurare il volume totale del flusso. Quindi, aggiungere 2/3 del volume di etanolo al filtrato e mescolare bene.Posizionare una seconda cartuccia filtrante in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, trasferire fino a 700 microlitri del campione sulla cartuccia e centrifugare a 10.000 volte la gravità per 30 secondi prima di scartare il flusso. Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio a microRNA alla cartuccia del filtro e centrifugarla con un tubo di raccolta a 10.000 volte la gravità per 15 secondi.Scartare il flusso e rimettere la cartuccia del filtro nello stesso tubo. Successivamente, spostare la cartuccia del filtro in un nuovo tubo di raccolta. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di eluizione preriscaldata alla cartuccia.Centrifugare la cartuccia del filtro a 10.000 volte la gravità per 30 secondi per recuperare i microRNA. Preparare il cocktail mix di reazione di poliadenilazione secondo il protocollo di testo. Trasferire due microlitri del campione in ogni pozzo di una piastra di reazione.Quindi, aggiungere tre microlitri del cocktail di reazione ad ogni pozzo. Vortice e centrifugare brevemente la piastra per far girare il contenuto. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo.Preparare il cocktail mix di reazione di legatura in un tubo di centrifuga. Quindi, aggiungere 10 microlitri del cocktail ad ogni pozzo della piastra di reazione. Quindi, mescolare il contenuto della piastra di reazione su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguito da una breve centrifuga della piastra.Successivamente, posizionare la piastra di reazione in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo. Per eseguire la reazione di trascrizione inversa, preparare la miscela di reazione in un tubo di centrifuga secondo il protocollo di testo. Quindi, aggiungere 15 microlitri del mix ad ogni pozzo della piastra contenente prodotto legante.Mescolare il contenuto della piastra su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguito da una breve centrifuga della piastra. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nel protocollo di testo. Quindi, preparare il mix di reazione miR-Amp e aggiungere 45 microlitri del mix ad ogni pozzo di una nuova piastra di reazione.Successivamente, aggiungere cinque microlitri del prodotto RT a ciascun pozzo della piastra di reazione. Mescolare la piastra su uno shaker a 1.900 giri/min per un minuto, seguita da una breve centrifuga della piastra. Quindi, posizionare la piastra in un ciclore termico e seguire la procedura descritta nella tabella uno del protocollo di testo.In primo luogo, diluire ogni campione di cDNA nel buffer TE. Quindi, preparare il mix di reazione PCR in un tubo di centrifuga. aggiungendo il 10% del volume in eccesso.Trasferire 19 microlitri della miscela di reazione ad ogni pozzo della piastra. Sigillare la piastra e centrifugarla brevemente. Infine, eseguire il protocollo termico su un sistema RT-PCR, come indicato nella tabella due del protocollo di testo.Sono state effettuate diluizioni seriali del controllo spike-in per scegliere quale fosse la migliore concentrazione da aggiungere in tutti i campioni di plasma di questa particolare serie di casi. Grazie a questo protocollo, è stato possibile valutare tutti i biomarcatori in ogni singolo paziente, nonché un singolo biomarcatore nella serie di casi complessiva. In questo protocollo, un pannello di miRNA circolanti correlati all'angiogenesi in relazione alla sopravvivenza senza progressione, alla sopravvivenza complessiva e al tasso di risposta oggettivo è stato analizzato in pazienti con cancro colorettale trattati con un regime di chemioterapia.Confrontando i livelli di espressione del miRNA tra la linea di base e la prima valutazione clinica, è stato osservato un aumento dell'has-miR-155-5p. Questo aumento è stato associato a PFS e sistema operativo più brevi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i passaggi utilizzando fenolo-cloroformio sotto una cappa aspirante. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'isolamento e l'analisi delle proteine circolanti o la codifica degli RNA al fine di rispondere a domande aggiuntive, come la valutazione di un pannello più esaustivo di biomarcatori circolanti.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biopsia liquida per esplorare l'espressione dei biomarcatori circolanti nei pazienti oncologici. Non dimenticare che lavorare con sangue e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come guanti e camice da laboratorio dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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