Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

이 연구로 기존과 이탈리아 약 기관 (AIFA)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

참고: 모든 소독된 연기 후드 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 다음 단계를 수행 합니다.
1. 플라즈마 수집 및 저장
<ol><li>3 mL K3E EDTA 튜브에 주변 혈액 샘플을 수집 합니다.</li>
	<li>1880 x g 15 분 동안에 실내 온도에 튜브 원심</li>
	<li>450 µ L의 aliquots에서 표면에 뜨는 플라즈마를 복구 합니다.</li>
	<li>사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 참고: ...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs는 작은 비 코딩 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서) 그들의 목표 메신저 RNA의 3' UTR 지역 바인딩 및 억제 및 그것을 타락 하는 것은 가능. 그들은 따라서 변환 수준에서 유전자 식 레 귤 레이 터를 간주 될 수 있습니다. 지난 10 년간, 몇몇 miRNAs 암 개시 및 개발, 진단, 예 후 및 치료에 대 한 유용한 임상 바이오 마커 들을 만들고 상관 되어 있다. RNases에 의해 보호, miRNAs은 혈액, 혈장, 혈 청, 소변과 ...

CRC 나타냅니다 3 가장 자주 악성 종양 및 암 관련 된 죽음은 전세계의 4 번째 원인 진단. 날짜 하려면, bevacizumab (B), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), cetuximab (C) 또는 panitumumab (P), 단일 클론 항 체 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 대 한 감독에 대 한 감독 단일 클론 항 체 승인에 대 한 첫 번째 라인 치료 (CT) 화학요법 식이요법과 함께.
K-RAS 및 N-RAS 유전자에 있는 돌연변이 유일한 임상적으로 유용한 생체 혜택 EGFR 기반 시작 안티 코네티컷에서 같다 적어도 환자 식별 가능 비록 B 기반 CT에 대 한 응답의 예측은 생체에 대 한 검색을 여러 연구를 실시 했습니다, 아직 임상 실습1에서 사용 하기 위해 안정적이 고 효과적인 약물의 상당한 부족이 이다.
miRNAs는 대상 유전자의 번역을 통제 하 고 embryogenesis와 발암을 포함 하 여 수많은 physiopathological 프로세스에서 중요 한 역할을 하는 작은 RNAs (18-25 뉴클레오티드 길이에서). 이 분자는 혈장/혈 청, 소변,가 래, 비-침략 적 샘플링2에 사용할 강력한 생체 그들을 렌더링 등 생물 학적 체액에서 매우 안정 된. 우리 식별 하기 위한 신생 통로에 관련 된 miRNAs의 패널을 사용 하 여, B 기반 CT 처방으로 치료 새로운 전이성 CRC (mCRC)를 가진 환자에 있는 임상 결과 예측할 수 있는 biomarkers를 순환.
52의 시리즈 분석 무작위로 예비 multicenter 내 B 기반 CT로 치료 하는 mCRC 환자 단계 III 예 심 "이탈리아 재판에 고급 대 장 암" (ITACa). 현재 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (Comitato Etico 지역 Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo 당 소호 스튜디오 e 라 Cura 데이 Tumori (IRST) IRCCS, no. 674) 19회 2007 년 9 월에. 모든 환자는 혈액 샘플 수집 하기 전에 동의 했다. 각 환자에 대 한 정 맥 혈액 샘플 기준선 미르 식 및 환자 결과 관하여 치료 하는 동안 그것의 변조 치료 전과 (8 주) 후 첫 번째 임상 평가에서 수집 되었습니다.
문학의 검색을 통해 우리는 인간 플라스마에서 감지 것으로 알려져 있다 21 miRNAs 신생 프로세스와 상관을 선택: 있다-미르-107, 미르-126-3 p는-미르-145-5 p, 있다-미르-194-5 p, 있다-미르-199a-5 p, 있다-미르-200b-3 p, 있다-미르-20b-5 p 은-미르-21-5 p,-미르-210-3 p,-미르-221-3 p,-미르-24-3 p, 있다-미르-27a-3 p, 있다-미르-29b-3 p, 있다-미르-335-5 p, 있다-미르-424-5 p, 있다-미르-497-5 p, 있다-미르-520 d-3 p, 있다-미르-92a-3 p, 있다-미르-17-5 p는-미르-155-5 p. 우리는 또한-미르-223-3 p를 선택 하 고 있다-미르-484 생 정규화3,,45,6, 및 cel-미르-39 세 정규화에 스파이크도 C. 선 충 에서 정화. 모든 데이터 정규화 2 ̂ ̄(ΔΔCt) 메서드를 사용 하 여 수행 했다.
순환 miRNAs의 검출 분자 플라즈마에 매우 낮은 수준에서 존재 하 고 그들의 증폭은 화학적 도전 그들의 짧은 순서를 부여 하기 때문에 몇 가지 기술적인 어려움을 선물 한다. 이러한 이유로, 우리는 페 놀과 유기 추출 및 유리 섬유 열 기반 방법론을 고려 하는 절차를 선택. 미르 추출 순환 액체 생 검의 분야에서 뜨거운 주제 이며 우리가 선택 중 가장 신뢰할 수 있는 표시는 상업 키트 복구 된 수익률7,8의 품질과 금액. 우리는 반대 하는 프로토콜을 선택 miRNAs의 선택도 향상 시키기 위해 5'과 3 ' 성숙한 miRNA의 많은 꼬리에서 어댑터 추가 및 반응의 특이성에 의해 속기.
방법의 견고성을 감안할 때, 우리는 미리 발견 프로브 RT-PCR 중복에서 각 샘플을 평가 대 한 사용자 지정 접시를 설계 하 고 그림 1에서 보듯이 각 배지 내의 2 환자를 분석.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

거기는 증가 액체 생 검 암 진단, 예 후 및 치료 모니터링에 대 한 관심이 임상 연습을 위한 안정적이 고 유용 생체에 대 한 필요성을 만들기. 여기, 선물이 추출, 프로토콜 반전 녹음 하 고 환자 대 장 암 (CRC)의 플라즈마 샘플에서 miRNAs 순환의 식 수준 평가. microRNAs (miRNAs)는 변환 수준에서 대상 유전자의 표정을 통제 하 고 중요 한 역할의 physiopathology에서 프로 및 안티 신생 함수를 포함 하는 길이 18-25 뉴클레오티드의 비 코딩 RNAs의 클래스 다양 한 기관입니다. miRNAs는 혈 청 및 플라즈마, 암 진단, 예 후 및 치료 결정에 대 한 생체 순환 고 모니터링 그들을 렌더링 같은 생물 학적 체액에 안정. 미르 추출 순환 유기 및 열 기반 방법론 관련 된 신속 하 고 효과적인 방법을 사용 하 여 수행 되었다. MiRNA retrotranscription, 고려에서 3' 5 ' 뒤에 임의의 미르 사전 증폭 성숙한 miRNAs의 어댑터의 결 찰 polyadenylation 멀티 단계 절차를 사용 했습니다. 우리 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 시험 될 24-미르 사용자 패널을 선택 하 고 배열 사용자 지정 접시에 미르 프로브를 발견. 우리는 실시간 PCR 시스템에서 실행 되는 qRT-PCR 플레이트를 수행. 정규화에 대 한 가사 miRNAs (3.2) 대 GeNorm 소프트웨어를 사용 하 여 선정 됐다. 데이터 식을 스위트 소프트웨어 (v 1.1)을 사용 하 여 분석 했다 고 통계 분석을 수행 했다. 메서드는 안정적이 고 기술적으로 강력한 것을 입증 하 고 플라즈마 혈 청 등 액체 샘플의 바이오 마커 수준 평가에 도움이 될 수 있습니다.

진행 성 자유로운 생존 (PFS) 관련 신생 관련 순환 miRNAs의 패널 분석, 전반적인 생존 (OS) 및 객관적인 응답 속도 (오 어) 52 mCRC 중부 B 기반으로 환자 치료에 플라즈마 샘플에서 이러한 바이오 마커의 평가 기술적인 어려움 때문에 도전 이다. 우리는 환자 혈장 샘플, 반전 녹음 방송 및 사전 증폭에서 미르 추출 설립된 메서드를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라과 추출 단?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

이 방법은 순환 바이오마커와 환자 예후 사이의 관계와 같은 번역 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 입력 재료로 쉽고 신뢰할 수있는 방법론으로 순환 바이오 마커 패널의 발현을 평가 할 수있는 기회입니다. 이 기술의 의미는 환자의 의사 결정 및 치료 모니터링에 유용한 순환 바이오 마커를 식별 할 수 있기 때문에 암 환자의 치료로 확장.또한,이 방법은 순환 바이오 마커 분석에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 질병의 분자 특성화를 위한 조직 바이오마커 발현 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있다. 추출 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.먼저 플라즈마 샘플 400마이크로리터를 RNase 가 없는 2밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음 튜브에 400 마이크로리터의 데니어링 솔루션을 추가합니다. 1나노몰러 스파이크인의 마이크로리터 4개를 추가합니다.용액을 혼합 한 후 800 마이크로 리터의 산 페놀 클로로폼을 추가하십시오. 60초 동안 용액을 소용돌이치며, 원심분리기는 최대 속도로 15분 동안 사용됩니다. 다음으로, 상부 수성 단계에 포함된 리자이트들을 깨끗한 튜브로 옮기고, 단계 간을 방해하지 않도록 주의한다.복구된 수성 상의 부피를 측정하고 1/3 부피를 용액에 추가합니다. 그런 다음 필터 카트리지를 신선한 수집 튜브에 넣습니다. 에탄올-리세이트 혼합물의 최대 700마이크로리터를 필터 카트리지로 옮길 수 있습니다.10, 000배 의 중력에서 30초 동안 필터 카트리지를 원심분리합니다. 다음으로, 흐름 의 총 볼륨을 측정합니다. 그런 다음, 에탄올 부피의 2/3을 여과에 넣고 잘 섞는다.두 번째 필터 카트리지를 신선한 컬렉션 튜브에 넣습니다. 이어서, 최대 700마이크로리터의 카트리지로 옮기고, 원심분리기는 30초 동안 10, 000배 의 중력으로 유동을 폐기한다. 필터 카트리지에 700 마이크로리터의 마이크로리터를 추가하고 15초 동안 10, 000배 의 중력으로 수집 튜브로 원심분리기를 제공합니다.흐름을 버리고 필터 카트리지를 동일한 튜브에 다시 넣습니다. 이 후 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 이동합니다. 그런 다음 예열된 용용 용액 100마이크로리터를 카트리지에 추가합니다.필터 카트리지를 10, 000배 의 중력으로 30초 동안 원심분리하여 마이크로RNA를 복구합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 다각성 반응 혼합 칵테일을 준비합니다. 반응 플레이트의 각 웰에 샘플의 두 마이크로 리터를 전송합니다.그런 다음 반응 칵테일의 마이크로 리터 3 개를 각 우물에 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 접시를 짧게 분리하여 내용물아래로 회전합니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다.원심분리기 튜브에서 리기션 반응 믹스 칵테일을 준비합니다. 다음으로 반응 플레이트의 각 웰에 칵테일 10 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 반응 플레이트의 내용을 혼합한 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 혼합합니다.그 후 반응 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 역전사 반응을 수행하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 원심분리기 튜브에서 반응 혼합을 준비한다. 그런 다음, 리깅 생성물을 포함하는 플레이트의 각 웰에 믹스15 마이크로리터를 추가합니다.1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 플레이트의 내용기를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 그런 다음 miR-Amp 반응 믹스를 준비하고, 새로운 반응 플레이트의 각 웰에 45 마이크로리터를 첨가한다.그 후 반응 플레이트의 각 웰에 RT 제품의 5마이크로리터를 추가합니다. 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 접시를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 그런 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 절차를 따릅니다.첫째, 각 cDNA 샘플을 TE 버퍼로 희석시 희석시. 그런 다음 원심분리기 튜브에서 PCR 반응 믹스를 준비합니다. 볼륨의 10%를 초과하여 추가합니다.반응 믹스의 19 마이크로리터를 플레이트의 각 웰에 옮기. 접시를 밀봉하고 원심분리기를 짧게 밀봉합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 RT-PCR 시스템에서 열 프로토콜을 수행합니다.스파이크인 제어의 직렬 희석은 이 특정 케이스 시리즈의 모든 플라즈마 샘플에 첨가하는 가장 좋은 농도를 선택하기 위해 수행되었다. 이 프로토콜 덕분에 전체 케이스 시리즈에서 단일 바이오마커뿐만 아니라 모든 단일 환자에서 모든 바이오마커를 평가할 수 있었습니다. 본 프로토콜에서, 진행없는 생존, 전반적인 생존 및 객관적인 반응 비율과 관련하여 혈관 신생 관련 순환 miRNAs의 패널은 화학요법 요법으로 치료된 대장암 환자에서 분석되었다.기준선과 제1 임상 평가 사이의 miRNA의 발현 수준을 비교하면, 하스-miR-155-5p의 증가가 관찰되었다. 이 증가는 짧은 PFS 및 OS와 연관되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 연기 후드 에서 페놀 클로로폼을 사용하여 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 순환 단백질 또는 코딩 RNA의 격리 및 분석과 같은 다른 방법은 순환 바이오 마커의 보다 철저한 패널의 평가와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 액체 생검 분야의 연구원들이 암 환자의 순환 바이오마커의 발현을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 혈액 및 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 실험실 코트와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

연구

암 연구학

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

산발성 대장 암의 유 전적으로 조작 된 마우스 모델

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...