Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
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Este estudo foi parcialmente financiado pela Roche s.p.a. e a Agência italiana de medicamentos (AIFA).

Nota: Execute todas as etapas seguintes sob uma coifa esterilizados de acordo com boas práticas de laboratório (BPL).
1. armazenamento e coleta de plasma
<ol><li>Colete 3 mL de amostra de sangue periférico em um tubo de EDTA K3E.</li>
	<li>Centrifugar o tubo à temperatura ambiente a 1.880 x g durante 15 min.</li>
	<li>Recupere o plasma sobrenadante em alíquotas de 450 µ l.</li>
	<li>Armazene as amostras a-80 ° C até o uso. Nota: Processo ...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) capazes de ligação 3' UTR região do alvo do RNA mensageiro e inibindo e/ou degradante, não-codificante. Assim, podem ser considerados reguladores de expressão do gene no nível de translação. Na última década, vários miRNAs tem sido correlacionados com câncer iniciação e desenvolvimento, tornando-os úteis biomarcadores clínicos para diagnóstico, prognóstico e terapia. Protegido por RNases, miRNAs estão presentes em uma forma estável em flu...

CRC representa o terceiro mais frequentemente diagnosticado malignidade e a quarta causa de morte relacionada com câncer em todo o mundo. Até à data, bevacizumab (B), um anticorpo monoclonal dirigido contra o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e cetuximab (C) ou panitumumab (P), anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), foram aprovados para tratamento de primeira linha, em combinação com regimes de quimioterapia (CT).
Mutações nos genes K-RAS e N-RAS são os biomarcadores clinicamente útil única capazes de identificar os pacientes que são menos susceptíveis de beneficiar de anti EGFR-baseado em CT. Embora vários estudos têm sido conduzidos para procurar biomarcadores que são preditivos da resposta ao CT B-baseado, há ainda uma falta substancial de drogas confiáveis e eficazes para a prática clínica1.
os miRNAs são pequenos RNAs (18-25 nucleotides no comprimento) que regulamentam a tradução de genes-alvo e desempenham um papel crucial em inúmeros processos fisiopatológicos, incluindo embriogénese e carcinogénese. Estas moléculas são altamente estáveis em fluidos biológicos como plasma/soro, urina e escarro, que processa-los robustos biomarcadores para usar para a amostragem não-invasivo2. Usando um painel de miRNAs envolvidos na via angiogênico, tivemos como objetivo identificar circulando nova biomarcadores capazes de prever resultados clínicos em pacientes com metástase CRC (mCRC) tratados com um regime de CT B-baseado.
Analisamos uma série de 52 mCRC pacientes tratados com CT B-baseado dentro o multicêntrico prospectivo randomizado de fase III trial "italiano experimental em avançado câncer colorretal" (ITACa). O presente protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei Tumori (IRST) IRCCS, n. º 674 Cura la do e Studio) em 19th de setembro de 2007. Todos os pacientes deram consentimento informado antes da coleta de amostra de sangue. Para cada paciente, amostras de sangue venoso foram coletadas antes do tratamento e na primeira avaliação clínica (após 8 semanas) para avaliar a expressão de miRNA de linha de base e sua modulação durante o tratamento em relação ao resultado do paciente.
Através de uma pesquisa da literatura, nós selecionamos 21 miRNAs correlacionados com o processo angiogênico que são conhecidos por serem detectáveis no plasma humano: p tem-miR-107, tem-miR-126-3, tem-miR-145-5 p, tem-miR-194-5 p, tem-miR-199a - 5p, tem-miR-200b - 3P, tem-miR-20b - 5P , tem-miR-21-5 p, tem-miR-210-3 p, tem-miR-221-3 p, tem-miR-24-3-p, tem-miR-27a - 3P, tem-miR-29oB - 3P, tem-miR-335-5 p, tem-miR-424-5 p, tem-miR-497-5 p, p tem-miR - 520d - 3P, tem-miR-92a - 3P, tem-miR-17-5 e tem-miR-155-5 p. Também selecionamos tem-miR-223-3 p... e tem-mir-484 para normalização endógena3,4,5,6e cel-miR-39 purificado de c. elegans como pico de normalização exógenos. Todas as normalizações de dados foram realizadas usando o método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
A detecção de circulação miRNAs apresenta algumas dificuldades técnicas, porque as moléculas estão presentes em níveis muito baixos no plasma e sua amplificação é quimicamente um desafio, dada sua pequena sequência. Por estas razões, nós selecionamos um procedimento que considera tanto orgânica extração com fenol e uma metodologia baseada em coluna de fibra de vidro. MiRNA extração de circulação é um tema quente no campo da biópsia líquida, e nós selecionamos um kit comercial que tem demonstrado ser um dos mais confiável em termos de quantidade e qualidade dos rendimentos recuperado7,8. Nós selecionamos um protocolo para reverter transcrever os miRNAs pela adição de um adaptador em 5' e uma cauda poli a 3' da miRNA maduro para melhorar a seletividade e especificidade da reação.
Dada a robustez do método, projetamos placas personalizadas com sondas pre-manchadas por RT-PCR avaliar cada amostra em duplicado e analisados 2 pacientes em cada prato, como mostrado na Figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Existe uma crescente interesse na biópsia líquida para câncer diagnóstico, prognóstico e monitorização terapêutica, criando a necessidade de biomarcadores confiáveis e úteis para a prática clínica. Aqui, apresentamos um protocolo para extrair, reverso transcrever e avaliar os níveis de expressão de miRNAs de amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) em circulação. microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNA não-codificante de 18-25 nucleotides no comprimento que regulam a expressão de genes-alvo a nível translacional e desempenham um papel importante, incluindo o da função de pro - e antiangiogênico, na fisiopatologia da vários órgãos. os miRNAs são estáveis em fluidos biológicos, tais como soro e plasma, que processa-los ideal circulando biomarcadores para tomada de decisão diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer e monitoramento. Extração de miRNA de circulação foi realizada usando um método rápido e eficaz que envolve metodologias orgânicas e baseados em colunas. Para miRNA retrotranscription, foi utilizado um processo de várias etapa que considera poliadenilação 3' e a ligadura de um adaptador em 5' dos miRNAs maduros, seguidos de Pre-amplificação aleatória miRNA. Selecionamos um painel personalizado 24-miRNA para ser testado por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e avistou as sondas de miRNA em placas personalizadas de matriz. Realizamos qRT-PCR placa é executado em um sistema de PCR em tempo real. Os miRNAs limpeza para normalização foram selecionados usando o software GeNorm (v. 3.2). Os dados foram analisados utilizando o software suite de expressão (v 1.1) e análises estatísticas foram realizadas. O método mostrou-se tecnicamente robusto e confiável e pode ser útil para avaliar os níveis de biomarcador em amostras líquidas, tais como o plasma ou soro.

Analisou-se um painel de angiogênese relacionados miRNAs circulantes em relação a sobrevivência livre de progressão (PFS), global sobrevivência (OS) e objetiva resposta taxa (ORR) em um mCRC 52 pacientes tratados com tomografia baseada em B. A avaliação de tais biomarcadores em amostras de plasma é um desafio, devido a dificuldades técnicas. Utilizamos métodos estabelecidos para miRNA extração de amostras de plasma do paciente, transcrição reversa e pré-amplificação. Seg...

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Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa translacional, como a relação entre biomarcadores circulantes e o prognóstico do paciente. A principal vantagem dessa técnica é a chance de avaliar a expressão de um painel de biomarcadores circulantes com uma metodologia fácil e confiável com baixa quantidade de material de entrada. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de pacientes com câncer, pois poderia identificar biomarcadores circulantes úteis na tomada de decisão e monitoramento do tratamento dos pacientes.Além disso, este método pode fornecer insights sobre a análise de biomarcadores circulantes. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como análise de expressão biomarcadora de tecido para caracterização molecular da doença. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de extração são difíceis de aprender.Para começar, transfira 400 microliters da amostra de plasma para um tubo de dois mililitros sem RNase. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de desnaturação ao tubo. Adicione quatro microliters de um nanomolar.Depois de misturar a solução, adicione 800 microliters de fenol-clorofórmio ácido. Vórtice a solução por 60 segundos, e centrífuga em velocidade máxima por 15 minutos. Em seguida, transfira o lisato contido na fase aquosa superior para um tubo limpo, tomando cuidado para não perturbar a interfase.Meça o volume da fase aquosa recuperada e adicione 1/3 de volume de etanol ao lisato. Em seguida, coloque um cartucho de filtro em um tubo de coleta fresco. Transfira até 700 microliters da mistura etanol-lysate para o cartucho do filtro.Centrifugar o cartucho do filtro por 30 segundos a 10.000 vezes a gravidade. Em seguida, meça o volume total do fluxo. Em seguida, adicione 2/3 do volume de etanol ao filtrado e misture bem.Coloque um segundo cartucho de filtro em um tubo de coleta fresco. Em seguida, transfira até 700 microliters da amostra para o cartucho, e centrífuga a 10.000 vezes a gravidade por 30 segundos antes de descartar o fluxo-through. Adicione 700 microliters de solução de lavagem de microRNA ao cartucho do filtro e centrifuá-lo com um tubo de coleta a 10.000 vezes a gravidade por 15 segundos.Descarte o fluxo-through e coloque o cartucho do filtro de volta no mesmo tubo. Depois disso, mova o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta. Em seguida, adicione 100 microliters de solução de eluição pré-aquecido ao cartucho.Centrifugar o cartucho do filtro a 10.000 vezes de gravidade durante 30 segundos para recuperar as microRNAs. Prepare o coquetel de mistura de reação de poliadenilação de acordo com o protocolo de texto. Transfira dois microliters da amostra para cada poço de uma placa de reação.Em seguida, adicione três microliters do coquetel de reação a cada poço. Vórtice e centrífuga a placa brevemente para girar o conteúdo. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto.Prepare o coquetel de mistura de reação de ligadura em um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione 10 microliters do coquetel a cada poço da placa de reação. Em seguida, misture o conteúdo da placa de reação em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido de uma breve centrífuga da placa.Depois disso, coloque a placa de reação em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto. Para realizar a reação de transcrição reversa, prepare a mistura de reação em um tubo de centrífuga de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 15 microliters da mistura a cada poço da placa contendo produto de ligadura.Misture o conteúdo da placa em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido de uma breve centrífuga da placa. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito no protocolo de texto. Em seguida, prepare a mistura de reação miR-Amp e adicione 45 microliters da mistura a cada poço de uma nova placa de reação.Depois disso, adicione cinco microliters do produto RT a cada poço da placa de reação. Misture a placa em um shaker a 1.900 rpm por um minuto, seguido por uma breve centrífuga da placa. Em seguida, coloque a placa em um cicloviário térmico e siga o procedimento descrito na tabela um do protocolo de texto.Primeiro, diluir cada amostra de cDNA no buffer TE. Em seguida, prepare a mistura de reação pcr em um tubo de centrífuga. adicionando 10% do volume em excesso.Transfira 19 microliters da mistura de reação para cada poço da placa. Sele a placa e centrífuga brevemente. Por fim, execute o protocolo térmico em um sistema RT-PCR, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto.Diluições seriais de controle de pico foram realizadas para escolher qual foi a melhor concentração para adicionar em todas as amostras de plasma desta série de casos particulares. Graças a este protocolo, foi possível avaliar todos os biomarcadores em cada paciente, bem como um único biomarcador na série geral de casos. Neste protocolo, um painel de miRNAs circulantes relacionadas à angiogênese em relação à sobrevida livre de progressão, sobrevida geral e taxa de resposta objetiva foi analisado em pacientes com câncer colorretal tratados com regime quimioterápico.Comparando-se os níveis de expressão do miRNA entre a linha de base e a primeira avaliação clínica, observou-se um aumento no has-miR-155-5p. Esse aumento foi associado a PFS e OS mais curtos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar os passos usando fenol-clorofórmio sob um capô de fumaça. Após esse procedimento, outros métodos como isolamento e análise de proteínas circulantes ou RNAs de codificação podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como a avaliação de um painel mais exaustivo de biomarcadores circulantes.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biópsia líquida explorarem a expressão de biomarcadores circulantes em pacientes com câncer. Não se esqueça que trabalhar com reagentes de sangue e químicos pode ser extremamente perigoso, e precauções como luvas e casaco de laboratório devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

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