Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
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Este estudio fue parcialmente financiado por Roche S.p.A. y la agencia italiana de medicamentos (AIFA).

Nota: Realizar todos los pasos siguientes bajo una campana de humos esterilizados según buenas prácticas de laboratorio (BPL).
1. almacenamiento y recogida de plasma
<ol><li>Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de EDTA K3E.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a temperatura ambiente en 1.880 x g durante 15 minutos.</li>
	<li>Recupera el plasma sobrenadante en alícuotas de 450 μl.</li>
	<li>Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso. No...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs son pequeños no-codificación RNAs (18-25 nucleotides en longitud) capaces de atar la región 3' UTR de su objetivo de ARN mensajero e inhibiendo o lo degradantes. Así se pueden considerar los reguladores de expresión génica a nivel traduccional. En la última década, varios miRNAs se han correlacionado con cáncer iniciación y desarrollo, haciéndolos útiles biomarcadores clínicos para el diagnóstico, pronóstico y terapia. Protegido por RNasas, miRNAs están presentes en una forma estable en fluidos bio...

CRC representa la tercera más frecuentemente diagnosticada la malignidad y la cuarta causa de muerte relacionada con cáncer en todo el mundo. Hasta la fecha, (B) el bevacizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y (C) el cetuximab o panitumumab (P), anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), han sido aprobados para tratamiento de primera línea en combinación con regímenes de quimioterapia (CT).
Las mutaciones en los genes K-ras y N-RAS son los biomarcadores clínicamente útiles sólo capaces de identificar pacientes que tienen menos probabilidades de beneficiarse de las CT basadas en anti-EGFR Aunque se han realizado varios estudios para buscar biomarcadores que son predictores de respuesta al TC de B, todavía hay una falta importante de drogas eficaces y confiables para su uso en la práctica clínica1.
miRNAs son RNAs pequeños (18-25 nucleotides en longitud) que regulan la traducción de genes diana y desempeñan un papel crucial en numerosos procesos fisiopatológicos, incluyendo la embriogénesis y la carcinogénesis. Estas moléculas son muy estables en fluidos biológicos como el plasma, suero, orina y esputo, que los hace robustos biomarcadores para muestreo no invasivo2. Usando un panel de miRNAs involucrados en la vía angiogénica, se procuró identificar circulando nuevos biomarcadores capaces de predecir el resultado clínico en pacientes con CCR metastático (mCRC) tratados con un régimen de CT basados en B.
Hemos analizado una serie de 52 mCRC pacientes tratados con CT B basado en el prospectivo multicéntrico aleatorizado fase III ensayo "italiano prueba en avanzado cáncer colorrectal" (ITACa). El presente Protocolo fue aprobado por el Comité de ética Local (Comitato Etico área Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo por lo dei de Studio e la Cura Tumori (IRST) IRCCS, Nº 674) en 19th septiembre de 2007. Todos los pacientes dieron consentimiento informado antes de la recogida de muestras de sangre. Para cada paciente, se recogieron muestras de sangre venosa antes del tratamiento y en la primera evaluación clínica (después de 8 semanas) para evaluar la expresión del miRNA de línea de base y su modulación durante el tratamiento en relación con los resultados de los pacientes.
A través de una búsqueda de la literatura, se seleccionaron 21 miRNAs correlacionados con el proceso angiogénico que son conocidos por ser detectable en el plasma humano: p ha-miR-107, ha-miR-126-3, ha-miR-145-5 p, p ha-miR-194-5, ha-miR-199a - 5p, ha-miR-200b - 3P, ha-miR-20b - 5p , ha-miR-21-5 p, p ha-miR-210-3, ha-miR-221-3 p, p ha-miR-24-3, p ha-miR-27a - 3P, ha-miR-29b - 3P, ha-miR-335-5, p ha-miR-424-5, ha-miR-497-5 p, p ha-miR - 520d - 3P, ha-miR-92a - 3P, ha-miR-17-5 y ha-miR-155-5 p. También seleccionamos p ha-miR-223-3 y ha-mir-484 para normalización endógena3,4,5,6y cel-miR-39 purificaron de C. elegans como un punto de normalización exógeno. Normalizar los datos se realizaron utilizando el método de ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
La detección de circulación miRNAs presenta algunas dificultades técnicas porque las moléculas están presentes en niveles muy bajos en el plasma y su amplificación es químicamente un desafío dada su secuencia corta. Por estas razones, hemos seleccionado un procedimiento que considera la extracción orgánica con fenol y una metodología basada en la columna de fibra de vidrio. Extracción de miRNA de circulación es un tema candente en el área de líquido biopsia, y seleccionamos un kit comercial que ha demostrado ser uno de los más confiables en términos de cantidad y calidad de rendimientos recuperados7,8. Hemos seleccionado un protocolo para invertir transcriba miRNAs por la adición de un adaptador en 5' y una cola de poly(A) a 3' de lo miRNA maduro para mejorar la selectividad y especificidad de la reacción.
Dada la robustez del método, diseñamos personalizadas platos con sondas previamente manchadas para RT-PCR evaluar cada muestra por duplicado y análisis a 2 pacientes dentro de cada placa, como se muestra en la figura 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Existe un creciente interés en líquido biopsia para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, creando la necesidad de marcadores biológicos confiables y útiles para la práctica clínica. Aquí, presentamos un protocolo para extraer, retroceso transcribir y evaluar los niveles de expresión de miRNAs de muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de circulación. microRNAs (miRNAs) son una clase de RNAs no codificantes de 18-25 nucleotides en longitud que regulan la expresión de genes diana a nivel traduccional y juegan un papel importante, incluyendo el de la función de pro - y anti-angiogénicos, en la fisiopatología de varios órganos. miRNAs son estables en fluidos biológicos como el suero y el plasma, que los hace ideal circulación biomarcadores para cáncer diagnóstico, pronóstico y tratamiento la toma de decisiones y monitoreo. Extracción de miRNA de circulación se realizó mediante un método rápido y eficaz que consiste en métodos orgánicos y basados en la columna. Para miRNA retrotranscripción, se utilizó un procedimiento de múltiples paso que considera poliadenilación en 3' y la ligadura de un adaptador a 5' de los miRNAs maduros, seguido de pre-amplificación miRNA al azar. Seleccionamos un panel personalizado 24-miRNA a prueba por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y vistos los sondeos miRNA en placas personalizadas de matriz. Se realizaron carreras de placa de qRT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real. Limpieza miRNAs de normalización fueron seleccionados utilizando el software GeNorm (v. 3.2). Los datos se analizaron utilizando el software de la suite de expresión (v 1.1) y se realizaron análisis estadísticos. El método demostró para ser confiable y técnicamente robusto y puede ser útil para evaluar los niveles de biomarcadores en muestras líquidas como el plasma o suero.

Hemos analizado un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión (PFS), general supervivencia y respuesta objetiva tarifa (ORR) en un mCRC 52 pacientes tratados con base B CT. La evaluación de estos biomarcadores en muestras de plasma es un reto debido a dificultades técnicas. Utilizamos métodos establecidos para la extracción de miRNA de las muestras de plasma paciente, transcripción inversa y amplificación prev...

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Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación traslacional, como la relación entre los biomarcadores circulantes y el pronóstico del paciente. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de evaluar la expresión de un panel de biomarcadores circulantes con una metodología fácil y fiable con baja cantidad de material de entrada. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de pacientes con cáncer porque podría identificar biomarcadores circulantes útiles en la toma de decisiones y el seguimiento del tratamiento de los pacientes.Además, este método puede proporcionar información sobre el análisis de biomarcadores circulantes. También se puede aplicar a otros sistemas, como el análisis de expresión de biomarcadores de tejidos para la caracterización molecular de la enfermedad. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de extracción son difíciles de aprender.Para empezar, transfiera 400 microlitros de la muestra de plasma a un tubo de dos mililitros sin RNase. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de desnaturalizadora al tubo. Agregue cuatro microlitros de un pinchatro nanomolar.Después de mezclar la solución, añadir 800 microlitros de fenol-cloroformo ácido. Vórtice la solución durante 60 segundos, y centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos. A continuación, transfiera el izado contenido en la fase acuosa superior a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar la interfase.Mida el volumen de la fase acuosa recuperada y añada 1/3 de volumen de etanol al izado. A continuación, coloque un cartucho de filtro en un tubo de recogida nuevo. Transfiera hasta 700 microlitros de la mezcla de etanol-izado al cartucho de filtro.Centrifugar el cartucho del filtro durante 30 segundos a 10.000 veces la gravedad. A continuación, mida el volumen total del flujo a través. A continuación, agregue 2/3 del volumen de etanol al filtrado y mezcle bien.Coloque un segundo cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. A continuación, transfiera hasta 700 microlitros de la muestra al cartucho y centrifugar a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos antes de descartar el flujo a través. Agregue 700 microlitros de solución de lavado de microRNA al cartucho del filtro y centrífelo con un tubo de recogida a 10.000 veces la gravedad durante 15 segundos.Deseche el paso de flujo y vuelva a colocar el cartucho del filtro en el mismo tubo. Después de esto, mueva el cartucho del filtro a un nuevo tubo de recogida. A continuación, añada 100 microlitros de solución de elución precalentada al cartucho.Centrifugar el cartucho del filtro a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos para recuperar los microRNAs. Preparar el cóctel de mezcla de reacción de poliadenilación de acuerdo con el protocolo de texto. Transfiera dos microlitros de la muestra a cada pozo de una placa de reacción.A continuación, agregue tres microlitros del cóctel de reacción a cada pozo. Vórtice y centrifugar la placa brevemente para girar hacia abajo el contenido. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto.Prepare el cóctel de mezcla de reacción de ligadura en un tubo centrífugo. A continuación, añada 10 microlitros del cóctel a cada pozo de la placa de reacción. A continuación, mezcle el contenido de la placa de reacción en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa.Después de esto, coloque la placa de reacción en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. Para realizar la reacción de transcripción inversa, prepare la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, añada 15 microlitros de la mezcla a cada pocód en el pozo de la placa que contiene el producto de ligadura.Mezclar el contenido de la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. A continuación, prepare la mezcla de reacción miR-Amp y agregue 45 microlitros de la mezcla a cada pozo de una nueva placa de reacción.Después de esto, añadir cinco microlitros del producto RT a cada pozo de la placa de reacción. Mezclar la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguida de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en la tabla uno del protocolo de texto.Primero, diluya cada muestra de ADNc en el búfer TE. A continuación, prepare la mezcla de reacción PCR en un tubo centrífugo. añadiendo el 10% del volumen en exceso.Transfiera 19 microlitros de la mezcla de reacción a cada pozo de la placa. Selle la placa y centrifuga brevemente. Finalmente, realice el protocolo térmico en un sistema RT-PCR, como se describe en la tabla dos del protocolo de texto.Se realizaron diluciones en serie de control de picos para elegir cuál era la mejor concentración para añadir en todas las muestras plasmáticas de esta serie de casos en particular. Gracias a este protocolo, fue posible evaluar todos los biomarcadores en cada paciente, así como un solo biomarcador en la serie de casos generales. En este protocolo, se analizó un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión, la supervivencia global y la tasa de respuesta objetiva en pacientes con cáncer colorrectal tratados con un régimen de quimioterapia.Comparando los niveles de expresión de miRNA entre la línea de base y la primera evaluación clínica, se observó un aumento en has-miR-155-5p. Este aumento se asoció con SLP y sistema operativo más cortos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los pasos usando fenol-cloroformo bajo una campana de humo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento y el análisis de proteínas circulantes o la codificación de ARN para responder a preguntas adicionales, como la evaluación de un panel más exhaustivo de biomarcadores circulantes.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biopsia líquida exploraran la expresión de biomarcadores circulantes en pacientes con cáncer. No olvide que trabajar con sangre y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como guantes y bata de laboratorio durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

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