Name: detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Bu çalışmada kısmen Roche S.p.A. ve İtalyan ilaç Ajansı (AIFA) tarafından finanse edildi.

Not: Tüm iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre steril duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
1. plazma toplama ve depolama
<ol><li>3 mL periferik kan örneği K3E EDTA tüp içinde toplamak.</li>
	<li>Tüp 1,880 x g 15dk için de oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Aliquots 450 µL süpernatant plazmada kurtarmak.</li>
	<li>-80 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak. Not: Periferik kan tüpü 2s...

<ol>
	<li>Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer.">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li><li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer:+A+systematic+review.">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li><li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR.">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li><li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegn&#233;r, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR.">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li><li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer:+Analysis+and+verification+of+current+data.">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li><li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients.">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples.">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li><li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs.">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430 (2015).</li><li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+(REMARK):+explanation+and+elaboration.">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li><li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers.">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels.">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li><li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction.">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li><li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum).">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).</li><li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer.">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li></ol>

miRNAs küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) 3' UTR bölge hedeflerinin mesajcı RNA bağlama ve inhibe ve/veya aşağılayıcı, yetenekli kodlamayan. Böylece gen ifade düzenleyiciler translasyonel düzeyde kabul edilebilir. Son on yılda birkaç miRNAs kanser başlatma ve geliştirme, tanı, teşhis ve tedavisi için yararlı klinik biyolojik geliştirmelerde ile ilişkili. RNases tarafından korunan, miRNAs kan, plazma, serum, idrar ve tükürük, potansiyel kullanışlılığı klinik pratikte<sup class=...

CRC temsil eden üçüncü en sık malignite ve dördüncü ölüm sebebi kanser ile ilgili dünya çapında tanısı. Bugüne kadar bevacizumab (B), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve cetuximab (C) veya panitumumab (P), monoklonal antikorlar karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), yönetmen karşı Monoklonal antikor onaylanmış olan birinci basamak tedavi kemoterapi (CT) rejimleri ile birlikte.
K-RAS ile N-RAS gen mutasyonlar tek klinik olarak yararlı biyolojik anti-EGFR tabanlı CT yararlanmak en az olan hastalar belirleme yeteneğine sahip olan Yanıt CT B tabanlı akıllı biyolojik aramak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır rağmen hala güvenilir ve etkili ilaçların klinik pratikte1kullanmak için önemli bir eksikliği olduğunu.
miRNAs çeviri hedef genlerin düzenleyen ve embriyo ve karsinojenezis dahil olmak üzere çok sayıda Fizyopatolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak küçük RNA'lar (18-25 nükleotid uzunluğunda) vardır. Bu moleküller biyolojik sıvı plazma/serum, idrar ve non-invaziv örnekleme2için kullanmak için sağlam biyolojik işler balgam gibi son derece kararlı. MiRNAs anjiogenik yolu yer Masası, biz tanımlamak için amaçlayan yeni biyolojik metastatik CRC (mCRC) olan hastalarda klinik sonuçlar oluşabileceğini yetenekli dolaşan bir B tabanlı CT rejimi ile tedavi.
52 bir dizi analiz randomize potansiyel multicenter içinde B tabanlı CT ile tedavi edilen mCRC hastaların evre III deneme "İtalyan deneme içinde gelişmiş kolorektal kanser" (Itaca). Mevcut iletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi (Comitato Etico alan Vasta e Istituto bilimsel Enstitüsü Romagnolo başına lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, No 674) 19th Eylül 2007 tarihinde. Tüm hasta Onam kanı örnek toplama önce verdi. Her bir hasta için Venöz kan örneği tedavi öncesi ve (sonra 8 hafta) ilk klinik değerlendirme, temel miRNA ifade ve hasta sonuç ile ilgili olarak tedavi sırasında onun modülasyon değerlendirmek için toplandı.
Edebiyat bir arama, biz insan plazmada tespit olduğu bilinmektedir anjiogenik işlemle ilişkili 21 miRNAs seçilmiş: vardır-miR-107, sahip-miR-126-3 p, vardır-miR-145-5 p, vardır-miR-194-5 p, vardır-miR-199a - 5p, vardır-miR-200b - 3p, vardır-miR-20b - 5p , vardır-miR-21-5 p, sahip-miR-210-3 p, sahip-miR-221-3 p, sahip-miR-24-3 p, vardır-miR-27a - 3p, vardır-miR-29b - 3p, vardır-miR-335-5 p, vardır-miR-424-5 p, vardır-miR-497-5 p, vardır-miR - 520d - 3p, vardır-miR-92a - 3p, vardır-miR-17-5 p ve vardır-miR-155-5 p. Biz de sahip-miR-223-3 p ve seçilen vardır-mir-484 endojen normalleştirme3,4,5,6ve cel-miR-39 spike bileşeni olarak eksojen normalleştirme için C. elegans arıtılmış. Tüm veri normalizations 2 ̂ ̄(ΔΔCt) yöntemiyle yapıldı.
MiRNAs dolaşan algılama molekülleri plazmada çok düşük düzeylerde varsa ve onların amplifikasyon kısa sırasına verilen kimyasal olarak zordur çünkü bazı teknik sorunlar sunar. Bu nedenlerden dolayı biz fenol ile organik çıkarma ve sütunlara göre bir cam elyaflı metodoloji dikkate alır bir yordam seçildi. MiRNA ayıklama dolaşan sıvı biyopsi alanında bir konu olduğunu ve biz en güvenilir olmak göstermiştir bir ticari kiti seçili tutar ve kurtarılan verimleri7,8kalite açısından. Biz tersine çevirmek için bir iletişim kuralı seçili selectivity geliştirmek için bir adaptör 5' ve Poli(a) kuyruğu için 3' olgun miRNA eklenmesi ve reaksiyon özgüllüğü tarafından miRNAs uyarlamak.
Sağlamlık yöntemi göz önüne alındığında, biz özel plakaları önceden benekli probları yinelenen her örnekte değerlendirmek RT-PCR ile tasarlanmış ve her plaka içinde 2 hasta şekil 1' de gösterildiği gibi analiz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 123.344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 20 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1123-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 200 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-free 1000 &#181;L tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A28007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol anidrous ACS grade</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>414605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercapto-ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4444558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Advanced miRNA Assays</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4406984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 &#181;L laboratory pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop heating block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of a circulating microrna custom panel in patients with metastatic colorectal cancer

Orada sıvı biyopsi için kanser tanı, teşhis ve tedavi kontrolü, ilgi klinik uygulaması için güvenilir ve yararlı biyolojik gereksinimini oluşturma artmaktadır. Burada, ayıklamak için bir iletişim kuralı mevcut ters uyarlamak ve kolorektal kanser (CRC) hastalarda plazma örneklerinden miRNAs dolaşan ifade düzeyini değerlendirin. MikroRNA (miRNAs) kodlamayan RNA'ların translasyonel düzeyinde hedef genlerin ifade düzenleyen ve pro - ve anti-anjiogenik işlevi, Fizyopatoloji da dahil olmak üzere önemli bir rol oynamaktadır 18-25 nükleotid uzunluğunda, sınıfıdır çeşitli organları. miRNAs serum ve onları ideal biyolojik kanser tanı, teşhis ve tedavi karar için dolaşan ve izleme işler plazma gibi biyolojik sıvı stabildir. MiRNA ayıklama dolaşan hem organik hem de sütun tabanlı yöntemleri içerir hızlı ve etkin bir yöntemle gerçekleştirildi. MiRNA retrotranscription için biz 3' ve bir bağdaştırıcı, 5' in rasgele miRNA öncesi amplifikasyon tarafından takip olgun miRNAs ligasyonu Poliadenilasyon dikkate alır bir çok adım yordam kullanılır. Nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) tarafından test edilecek, özel bir 24-miRNA bölmesi seçili ve miRNA probları dizi özel Tabaklarda gördü. Biz qRT-PCR plaka ishal üstünde bir gerçek zamanlı PCR sistemi uygulandı. Temizlik miRNAs normalleştirme için GeNorm yazılım (v. 3.2) kullanarak seçildi. Veri ifade suite yazılımı (v 1.1) kullanarak analiz edildi ve istatistiksel analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem güvenilir ve teknik olarak sağlam olduğu ortaya çıktı ve plazma ve/veya serum gibi sıvı örnekleri biyomarker düzeyleri değerlendirmek için yararlı olabilir.

Analiz ettik angiogenez ilgili dolaşan miRNAs ilerleme-Alerjik hayatta kalma (PFS) ile ilgili olarak bir panel, genel olarak hayatta kalma (OS) ve objektif yanıt oranı (ORR) B tabanlı CT ile hasta tedavi 52 mCRC içinde Plazma numuneleri böyle biyolojik değerlendirilmesi teknik zorluklardan dolayı zordur. Biz hasta plazma örnekleri, ters transkripsiyon ve öncesi amplifikasyon miRNA çıkarılması için kurulan yöntemleri kullanılır. Üreticinin yönergelerini izleyerek ve sad...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer at JoVE.com

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Biz mikroRNA (miRNAs) dolaşan ifade düzeylerini değerlendirmek için bir protokol kanserli hastalarda plazma örnekleri mevcut. Özellikle, biz piyasada bir kit miRNA çıkarma ve ters transkripsiyon dolaşan için kullanılır. Son olarak, gerçek zamanlı önceden benekli sonda özel plakaları kullanarak 24 seçili miRNAs oluşan bir panel analiz ettik.

Metastatik kolorektal kanser hastalarında dolaşımdaki mikroRNA özel Panel tespiti

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Bu yöntem, çeviriaraştırma alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin dolaşan biyobelirteçler ile hasta prognozu arasındaki ilişki gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük miktarda giriş materyali ile kolay ve güvenilir bir metodoloji ile dolaşan biyobelirteçlerden oluşan bir panelin ekspresyonunu değerlendirme şansıdır. Bu tekniğin etkileri kanser hastalarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hastaların karar verme ve tedavi takibinde yararlı olan dolaşan biyobelirteçleri belirleyebilir.Ayrıca, bu yöntem biyobelirteçanalizi dolaşan içine fikir sağlayabilir. Ayrıca hastalığın moleküler karakterizasyonu için doku biyomarker ekspresyon analizi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çıkarma adımlarını öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.Başlamak için, plazma örneğinin 400 mikrolitresini RNase içermeyen, iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tüpe 400 mikrolitre denaturing çözeltisi ekleyin. Bir-nanomolar spike-in dört mikrolitre ekleyin.Çözeltiyi karıştırdıktan sonra 800 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin. 60 saniye boyunca çözeltiyi girdap ve maksimum hızda 15 dakika santrifüj. Daha sonra, üst sulu fazda bulunan lysate'yi temiz bir tüpe aktarın ve interfazı bozmamaya özen gösteriyor.Kurtarılan sulu fazın hacmini ölçün ve lysate'ye 1/3 hacim etanol ekleyin. Ardından, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Etanol-lysate karışımının 700 mikrolitreye kadarını filtre kartuşuna aktarın.Filtre kartuşu 10,000 kat yerçekiminde 30 saniye santrifüj edin. Ardından, akış yoluyla toplam hacmini ölçün. Sonra, filtrat etanol hacminin 2/3 ekleyin ve iyice karıştırın.Yeni bir toplama tüpüne ikinci bir filtre kartuşu yerleştirin. Ardından, numunenin 700 mikrolitrekadarını kartuşa aktarın ve akış tan zindanetmeden önce 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj yapın. Filtre kartuşu için 700 mikrolitre mikrorna yıkama çözeltisi ekleyin ve 15 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde bir toplama tüpüyle santrifüj edin.Akış tan atın ve filtre kartuşu'nu aynı tüpe geri koyun. Bundan sonra, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne taşıyın. Ardından, kartuşa önceden ısıtılmış elüsyon çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.MikroRNA'ları kurtarmak için filtre kartuşu 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj edin. Metin protokolüne göre poliadenilasyon reaksiyonkarışımı kokteylini hazırlayın. Numunenin iki mikrolitresini bir reaksiyon plakasının her kuyuya aktarın.Sonra, her kuyuya reaksiyon kokteylinin üç mikrolitresini ekleyin. Girdap ve kısa bir süre içeriğini aşağı spin plaka santrifüj. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin.Bir santrifüj tüp içinde ligasyon reaksiyon karışımı kokteyl hazırlayın. Daha sonra, reaksiyon plakaher kuyuya kokteyl 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, bir dakika için bir shaker üzerinde reaksiyon plaka içeriğini karıştırın, 900 rpm, plaka kısa bir santrifüj izledi.Bundan sonra, reaksiyon plakasını bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı uygulayın. Ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek için, metin protokolüne göre bir santrifüj tüpünde reaksiyon karışımını hazırlayın. Daha sonra, ligasyon ürünü içeren plakaher kuyuya karışımı 15 mikrolitre ekleyin.Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka içeriğini karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin. Daha sonra miR-Amp reaksiyon karışımını hazırlayın ve yeni bir reaksiyon plakasının her kuyuya 45 mikrolitre karışımı ekleyin.Bundan sonra, reaksiyon plakasının her kuyuya BEŞ mikrolitre RT ürünü ekleyin. Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünün tablo birinde özetlenen yordamı izleyin.İlk olarak, TE tampon her cDNA örnek seyreltmek. Daha sonra, bir santrifüj tüp IÇINDE PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. hacmin %10'u fazla dır.Plakanın her kuyusu için reaksiyon karışımının 19 mikrolitresini aktarın. Plakayı kapatın ve kısa bir süre santrifüj edin. Son olarak, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi, bir RT-PCR sisteminde termal protokolü gerçekleştirin.Bu vaka serisinin tüm plazma örneklerine eklenecek en iyi konsantrasyonun hangisi olduğunu seçmek için başak kontrolüseri seyreltmeleri yapıldı. Bu protokol sayesinde her hastadaki tüm biyobelirteçlerin yanı sıra genel vaka serisinde tek bir biyomarker in değerlendirilmesi mümkün oldu. Bu protokolde, kemoterapi rejimi ile tedavi edilen kolorektal kanserli hastalarda progresyonsuz sağkalım, genel sağkalım ve objektif yanıt oranı ile ilgili anjiyogeneze bağlı sirkülasyon miRNA'lardan oluşan bir panel analiz edildi.MiRNA'nın ekspresyon düzeyleri ile ilk klinik değerlendirme arasında karşılaştırıldığında has-miR-155-5p'de artış gözlendi. Bu artış daha kısa PFS ve Os ile ilişkiliydi. Bu yordamı çalışırken, bir duman başlık altında fenol-kloroform kullanarak adımları gerçekleştirmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, dolaşımdaki proteinlerin izolasyonu ve analizi veya kodlama RNA'ları gibi diğer yöntemler, dolaşan biyobelirteçlerden oluşan daha kapsamlı bir panelin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.Bu teknik, gelişiminden sonra sıvı biyopsi alanında araştırmacıların kanser hastalarında dolaşan biyobelirteçlerin ekspresyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır. Kan ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar kaplaması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Preklinik Tedaviler Nicel ve Boyuna Değerlendirme A sinjeneik Fare Modeli Yapmış Bir Renal Hücreli Karsinom

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Geliştirilmiş Fare Modeli

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...