Name: a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

Undersøgelsen blev finansieret af NIH grant MH101392 (RSL) og støtte fra de følgende priser og fonde: en NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann pris Investigator fond, James Wah humør lidelser Scholar fonden via Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation, og projektet Match Foundation (RSL).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells.">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution.">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li><li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips.">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li><li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients.">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis.">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li><li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes.">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li><li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array.">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).</li><li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment.">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li><li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure.">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li><li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores.">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences.">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li><li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats.">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li><li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+open:closed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat.">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSmooth:+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions.">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li><li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+obesity:+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease.">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li><li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets,+coronary+heart+disease,+and+stress.">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li><li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition:+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction.">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li><li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=methylKit:+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles.">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes.">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low/binge+from+heavy+alcohol+drinking.">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li></ol>

Håndskriftet er en del af en konkurrence præmie fra Agilent Technologies.

I denne undersøgelse, vi designet og implementeret Methyl-Seq platform for rotte genom. Ved at demonstrere dens nytte med en rotte model af stress, viste vi, at experimental og analytisk rørledningen kan give varierende methylerede regioner mellem to sammenligning grupper.
For at sikre en vellykket gennemførelse af platformen, skal flere kritiske trin overholdes. Første, indledende DNA kvalitet og mængde har en betydelig indvirkning på kvaliteten og kvantiteten af den endelige Methyl-Seq bibliotek. Vi brugte en fluorometer i stedet for et spektrofotometer, til at sikre, at vores DNA måling afspejles mængden af dobbelt-strenget DNA stede. Bioanalyzer blev brugt til at måle den molekylære størrelse og mængde DNA efter klipning og efter adapter ligatur. Kontrollere den molekylære størrelse "shift" mellem disse trin er afgørende for at bekræfte tilstedeværelsen af adaptere for enden af hver DNA-fragment, der vil gennemgå adapter-medieret PCR i de efterfølgende trin. Mængden af DNA resterende for enden af adapteren ligatur skridt er også vigtigt, siden mindst 100 ng af varens bibliotek er nødvendigt på dette skridt til at sikre tilstrækkelig mængde findes efter mål berigelse og bisulfite Konverteringstrin. En endelige Højfølsom måling blev udført på biblioteket bygget Methyl-Seq således at biblioteket kan fortyndes ordentligt for efterfølgende klynger på næste generations sequencer. Endelig var bisulfite pyrosequencing ansat som en yderst kvantitative, uafhængige metode til at vurdere nøjagtigheden af den analytiske pipeline. Den endelige validering ved hjælp af den oprindelige prøver og replikering ved hjælp af yderligere dyr er afgørende skridt til at sikre, at eksperimentet kan registrere biologisk signifikante ændringer i DNA methylering.
Vi har desuden flere retningslinjer i tilfælde af afvigelser fra protokollen eller hvis er stødt på problemer. For det første er det muligt at tabe for meget DNA i slutningen-reparation, adapter ligatur eller magnetisk bead rensning trin. Alternativt, starter mængder DNA kunne være små (< 200 ng) på grund af begrænset væv/DNA tilgængelighed eller gennemførelsen af forskellige berigelse metoder såsom fluorescens aktiveret celle sortering. Stigende cyklus antallet under to bibliotek forstærkning trin kan være stand til at kompensere for den uforholdsmæssigt store tab af DNA eller lave start DNA beløb i hele biblioteket konstruktion protokol. Dog anbefales ikke mere end en yderligere 2-3 cykler, som overdreven skabelon forstærkning forventes at føre til en stigning i antallet af dublerede læser at blive sekventeret. Disse dubletter er udelukket under trinnet tilpasning at forhindre bias i procent methylering beregninger. For det andet, hvis den gennemsnitlige DNA størrelse ikke øger af mere end 30 bps, kontrollere for at sikre, at reagenserne, der er nye, som T4 DNA polymerase, Klenow og/eller T4 ligase kan være gammel. Kan bruges kommercielt tilgængelige udskiftning reagenser.
Desuden er det muligt, at de forudsagte Mickael ikke kunne validere ved pyrosequencing, hvor DNA methylering forskelle eksisterer ikke eller er betydeligt mindre end dem forudsagt af analyse. Dårlig validering af kandidat regioner er et problem for fælles for mange analyser, genome-wide, som når pyrosequencing resultater ikke bekræfter differential methylering eller effekt størrelse er meget mindre end forudsagt af analysen. BSmooth er en analytisk pakke at "udjævner" methylering niveauer på tværs af en rude af flere CpGs. For den aktuelle eksperiment impliceret BSmooth en DMR hvis methylering niveauer blev valideret af bisulfite pyrosequencing. Dog vil der sandsynligvis være uoverensstemmelser mellem methylering niveauer forudsagt af BSmooth og verificeret af pyrosequencing. Forskellene opstår fra funktionen udjævning, der anslår de gennemsnitlige methylering værdier på tværs af alle CpGs inden for en DMR, herunder sammenhængende CpGs, der kan variere i DNA methylering af mere end 50% eller CpGs hvis methylering værdier blev udelukket grund sub tærskel læse dybde. R-pakker såsom MethylKit24 kan bruges til at identificere mindre vinduer i CpGs eller endda enkelt CpGs hvis methylering niveauer korrelerer stærkt med dem valideret af pyrosequencing. Gennemføre forskellige pakker og teste deres forudsagte regioner eller CpGs af differential methylering af pyrosequencing vil sikre robusthed af data. Alternativt, oprindelige Methyl-Seq biblioteker kan være resequenced og tilføjet til de Læs filer til at øge Læs dybde. Da bestemmelse af methylering niveauer er semi-kvantitative og dikteret af antallet af læser [(# of CpGs) / (# af TpGs + CpGs)], øge den Læs dybde for en given CpG vil øge nøjagtigheden af dens procent methylering værdi. I denne undersøgelse fandt vi kun CpGs hvis methylering værdier blev bestemt af mindst ti læser og opnåede en samlet Læs dækning af 19 x for hver CpG.
Rotte Methyl-Seq platform er ikke uden sine begrænsninger. Mens det er mere omkostningseffektive end hele-genom bisulfite sekventering, er det væsentligt dyrere end andre metoder. Ikke desto mindre, størstedelen af omkostningerne var købt baner på sequencer og ikke for capture-system. Afhængigt af den Læs dybde nødvendigt med cross-væv sammenligninger kræver mindre på grund af store (25-70%) forskelle12 i DNA methylering, kan omkostningerne reduceres ved multiplexing flere prøver pr. vognbane og bruge en højere kapacitet platform. Også, at prøveforberedelsen er mere tidskrævende end andre metoder. Mens ligner andre pulldown tilgange, der indarbejder næste generation sequencing, tilføje ekstra bisulfite konvertering og rensning trin til arbejdsbyrden. Samlet set Methyl-Seq platform er en omkostningseffektiv alternativ til hele-genome sequencing og giver basepar opløsning på mere end 2,3 millioner CpGs, hvilket er betydeligt mere end de analyseres af microarray-baserede platforme. Til dato, kommercielt tilgængelige menneskelige og mus har Methyl-Seq platforme været brugt til at dokumentere alkohol-afhængige ændringer i makak hjernen25,26, Neuro-udviklingsmæssige gener i mus hjernen9, og blod-hjerne af glukokortikoider10mål. Yderligere, evnen til at målrette specifikke regioner uanset sekvens anerkendelse af restriktionsenzymer gør det en ideel platform for cross-arter sammenligninger. For denne undersøgelse designet vi Methyl-Seq platformen for rotte, som mange farmakologiske, metaboliske og adfærdsmæssige eksperimenter er foretaget uden gavn for en genome-wide methylomic værktøj. Vores data viser, at det kan bruges til at registrere Isabella i en rotte model af stress og korreleret andre fysiologiske parametre såsom samlede plasma CORT niveauer.
Methyl-Seq-platformen er ideel til epigenetiske eksperimenter i dyr med sekventeret genomer, der ikke måske har nok eksperimentelle bevismateriale dokumenterer lovgivningsmæssige områder. Når sådanne regioner stilles til rådighed, kan yderligere regioner specialdesignede og knyttet til den aktuelle version. Yderligere, platformen er ideel til Komparativ genomforskning, da målet berigelse ikke er begrænset af begrænsning enzym anerkendelse. For eksempel, kan regionen promotor af enhver gen af interesse blive fanget uanset om det havne en specifik restriktion site. Ligeledes, enhver regulerende regioner, såsom dem fundet i mus eller mennesker, som er bevaret i genomet af interesse kan blive fanget.

Fremskridt i høj overførselshastighed sekventering har ført til et væld af genomiske sekvenser for både model og ikke-model organismer. Tilgængeligheden af sådanne sekvenser har fremmet forskningen i genetik, Komparativ genomforskning og transcriptomics. Eksempelvis tilgængelige genomiske sekvenser er meget nyttige til at justere sequencing data fra ChIP-Seq eksperimenter, der beriger DNA baseret på sin forening med Histon ændringer1eller bisulfite sekventering, som måler DNA methylering af afsløre uracil dannet af bisulfite omdannelse af unmethylated cytosines2. Der har imidlertid været forsinkelser i gennemførelsen af epigenomiske platforme, at inddrage tilgængelige genomisk sequencing data i deres design på grund af manglende kommenteret data artsspecifikke regulerende sekvenser, der kan påvirke genfunktion.
Navnlig er DNA methylering en af de mest studerede epigenetiske ændringer på DNA, der kan udnytte tilgængelige genomisk data for at opbygge en methylomic platform. Et eksempel er en array-baseret platform til den menneskelige methylome3, som har været meget anvendt i forskellige discipliner fra onkologi til psykiatri4,5. Desværre, lignende platforme for ikke-menneskelige dyr modeller er knappe, som der er stort set ingen udbredte platforme, der har draget fordel af den genomiske sekvens i deres oprindelige design.
En fælles metode til at vurdere methylomic landskabet af ikke-menneskelige dyr modeller er reduceret repræsentation bisulfite sekventering (RRBS)6. Denne tilgang overvinder udgifterne til hele-genom bisulfite sekventering, der samtidig med en omfattende methylomic landskab, giver lavere Læs-dybde dækning på grund af omkostningerne og begrænsede funktionelle oplysninger i store gen-fattige områder af genom2 . RRBS indebærer begrænsning digest og størrelse-udvalg af genomisk DNA til at berige for meget GC-rige sekvenser som CpG øer, der er almindeligt forekommende i nærheden af genet initiativtagere og menes at spille en rolle i gen forordning7. Mens metoden RRBS er blevet brugt i en række vigtige undersøgelser, er dens afhængighed af restriktionsenzymer ikke uden markante udfordringer og begrænsninger. For eksempel, er berigelse af GC-rige sekvenser i RRBS helt afhængig af tilstedeværelsen af specifikke sekvenser anerkendt af begrænsning enzym og efterfølgende størrelse udvælgelse af elektroforese. Det betyder, at enhver genomisk områder, der ikke indeholder disse begrænsning websteder er udelukket under valg af størrelse. Også, cross-arter sammenligninger er udfordrende, medmindre de samme begrænsning steder findes i de samme loci blandt de forskellige arter.
En metode til at overvinde begrænsningerne af RRBS er at bruge en berigelse metode, der udnytter den offentliggjorte genomisk sekvens i udformningen af platformen. Array-baserede menneskelige platformen bruger primer sonder designet mod specifikke CpGs for allel-specifik (CG vs TG efter bisulfite konvertering) target udglødning og primer forlængelse. Dens design afspejler ikke blot de tilgængelige menneskelige genomisk sekvens, men eksperimentelt verificeret regulerende regioner erhvervet fra flere linjer af undersøgelse, som INDKODE og ENSEMBL8. På trods af sin bredt anvendes i human methylomic undersøgelser findes en lignende platform ikke for model dyr. Derudover placerer array-baseret format betydelig begrænsning på arealet til sondens placering. I de sidste mange år, har været bestræbelser at kombinere mål-specificitet som fange sonde design og høj overførselshastighed i næste generation sequencing. Sådan en bestræbelse har resulteret i sekventering-baserede målsystemet-berigelse for musen genomet (mus Methyl-FF.), som blev brugt til at identificere hjerne-specifikke eller glukokortikoid induceret forskelle i methylering9,10. Lignende platforme for andre model og ikke-model dyr er nødvendig for at lette epigenomiske forskning i disse dyr.
Her viser vi gennemførelsen af denne roman platform til at gennemføre methylomic analyse på rotten. Rotten har fungeret som en vigtig dyremodeller i farmakologi, stofskifte, neuroendocrinology og adfærd. For eksempel er der et stigende behov for at forstå de underliggende mekanismer, der giver anledning til lægemiddeltoksicitet, fedme, stressrespons eller stofmisbrug. En høj overførselshastighed platform kan indfange methylomic ændringer forbundet med disse betingelser ville øge vores forståelse af mekanismerne. Da rotte genom mangler stadig anmærkning for lovgivningsmæssige områder, vi indgår ikke-redundante initiativtagere, CpG øer, island kyster11, og tidligere identificerede GC-rige sekvenser i rotte Methyl-Seq platform12.
For at vurdere vellykket design og implementering af SureSelect Target berigelse (generisk benævnt Methyl-Seq) platform for rotte genom, ansat vi en rotte model af kronisk variable stress (CVS)13 at identificere varierende methylerede regionerne mellem tryksvage og stressede dyr. Vores Platformsdesign, protokol og implementering kan være nyttige for efterforskere, der måtte ønske at foretage en omfattende og upartiske epigenetiske undersøgelse på en organisme, hvis genomisk sekvens er allerede tilgængelige, men er stadig dårligt kommenteret.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Radioimmuno assay (RIA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>7120126</td>
			<td>Corticosterone, 125I labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Pure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre/Illumina</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1102</td>
			<td>Used with 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td>Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>100% Ethanol, molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be capable of 20000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>High sensitivity DNA detection reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G9651A</td>
			<td>Reagents for preparing the Methyl-Seq library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931143</td>
			<td>RNA baits for enrichment of rat targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE, pH 8.0</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>11-05-01-09</td>
			<td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E-series or S-series</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>-</td>
			<td>Isothermal sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA-Binding magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96S Super Magnet</td>
			<td>ALPAQUA</td>
			<td>A001322</td>
			<td>Magnetic plate for purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td>Electrophresis-based bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA110 SpeedVac</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Vacuum Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Streptavidin magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake Tube Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>415110Q</td>
			<td>Nutator Mixer is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5006</td>
			<td>Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hi-Seq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>-</td>
			<td>Next-generation sequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR and Pyrosequencing Primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Variable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark MD96</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>-</td>
			<td>Pyrosequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>70% Ethanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>0.2 M NaOH denature buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Base) from J.T. Baker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-508</td>
			<td>10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>972807</td>
			<td>Reagents required for pyrosequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Annealing Buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Binding Buffer (200 ml)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td>Streptavidin-coated sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q96 HS Plate</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979101</td>
			<td>Pyrosequencing assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td>Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureDesign Website</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSC Genome Browser</td>
			<td>University of California Santa Cruz</td>
			<td>-</td>
			<td>rat Nov 2004 rn4 assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure

Som genomer af en bredere vifte af dyr bliver tilgængelige, er der et stigende behov for værktøjer, der kan fange dynamiske epigenetiske ændringer i disse dyremodeller. Rotten er en særlig model dyr hvor en epigenetisk værktøj kan supplere mange farmakologiske og adfærdsmæssige undersøgelser at give indsigtsfulde mekanistiske information. Med henblik herpå tilpasset vi SureSelect fange målsystemet (benævnt Methyl-Seq) rotte, som kan vurdere DNA methylering niveauer på tværs af rotte genom. Rotte design målrettet initiativtagere, CpG øer, island kyster og GC-rige regioner fra alle RefSeq gener.
For at gennemføre platformen på en rotte eksperiment, blev mandlige Sprague Dawley rotter udsat for kroniske variable stress for 3 uger, hvorefter blev blodprøver indsamlet for genomisk DNA-ekstraktion. Methyl-Seq biblioteker blev bygget fra rotte DNA-prøver af klipning, adapter ligatur, target berigelse, bisulfite konvertering og multiplexing. Biblioteker blev sekventeret på en next-generation sequencing platform og sekventeret læser blev analyseret for at identificere Mickael mellem DNA af stressede og tryksvage rotter. Spidskandidat Mickael blev selvstændigt valideret af bisulfite pyrosequencing at bekræfte robustheden af platformen.
Resultaterne viser, at rotte Methyl-Seq platform er en nyttig epigenetiske værktøj, der kan fange methylering forandringer som følge af eksponering til at understrege.

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Vi beskriver her, protokol og gennemførelsen af Methyl-FF., en epigenomiske platform, ved hjælp af en rotte model til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med kronisk stress eksponering. Resultaterne viser, at rotte Methyl-Seq platform er i stand til at opdage methylering forskelle, der opstår fra stress eksponering i rotter.

En rotte Methyl-Seq Platform til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med Stress eksponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål på epigenomics-området ved at demonstrere, hvordan man designer og implementerer et sekventeringsbaseret værktøj til at vurdere miljøfaktorers indvirkning på DNA-methylering. Den største fordel ved denne teknik er, at den kan give en mere omfattende og kvantitativ metode til at vurdere DNA-methyleringsniveauer sammenlignet med arraybaserede platforme. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod identifikation af DNA-methyleringsændringer på grund af forskellige typer fysiologiske processer i enhver organisme, hvis sekvensdata er tilgængelige.Selv om denne metode kan give indsigt i virkningen af stress på DNA methylering, det kan også anvendes på andre miljømæssige faktorer eller fysiologiske forhold, såsom eksponering for miljømæssige toksikanter i højt fedtindhold kost og betingelser såsom diabetes og hjerte-kar-sygdom. Efter klipning AF DNA og kontrol af størrelsen via bioanalyzer tilsættes 180 mikroliter af DNA-bindende magnetiske perler til hver prøve og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Pellet perlerne på en magnetisk plade, og fjern supernatant.Opsplitet pellet i 200 mikroliter på 70% ethanol. Dernæst skal du bruge en magnetisk plade til at pellet perlerne, og fjern så meget ethanol som muligt. Tør perlerne i en varmeblok ved 37 grader Celsius i tre til fem minutter.Derefter resuspend pellet i 44 mikroliter af nuklease-fri vand, og indsamle ca 42 mikroliter af supernatant. Efter ligation af adapterne og kontrol af ligation via bioanalyzer overføres prøverne til lav DNA-bindende mikrocentrifugerør. Brug derefter en opvarmet vakuumkoncentrator til at reducere prøvevolumenet til under 3,4 mikroliter.Efter dette, tilsæt 5,6 mikroliter af Methyl-Seq Block Mix til hver prøve, og inkubere dem i en termisk cycler. Forbered hybridiseringsblanding af capturebibliotek i henhold til tekstprotokollen. Derefter tilsættes 20 mikroliter Capture Library Hybridization Mix til hver prøve, og inkuberes ved 65 grader Celsius i 16 timer.Mod slutningen af inkubationstiden forberedes streptavidin magnetiske perler ved at tilføje 50 mikroliter streptavidin magnetiske perler pr. prøve til et nyt otte-brønds striprør. Vask perlerne med 200 mikroliter methyl-seq bindingsbuffer. Placer strimlen rør på en magnetisk plade, og fjern supernatant fra perlerne.Derefter resuspenderede perlerne i 200 mikroliter af Methyl-Seq Bindende Buffer. Tilsæt prøverne til de vaskede streptavidin perler, og inkuber dem ved stuetemperatur i 30 minutter på en roterende mixer. Mens prøverne blandes, aliquot 200 mikroliter af Methyl-Seq Wash Buffer To i tre eksemplarer brønde af en 96-brønd plade og pre-varm til 65 grader Celsius.Efter prøverne inkuberes, pellets de magnetiske perler med en magnetisk plade og fjern supernatanten. Derefter resuspenderede perlerne i 200 mikroliter af Methyl-Seq Wash Buffer One. Inkuber perlerne i 15 minutter ved stuetemperatur, og brug en magnetisk plade til at fjerne supernatanten.Derefter skal perlepilleen resuspenderes i 200 mikroliter af forvarmte Wash Buffer Two. Derefter inkubere perlerne i en termisk cycler, før du bruger en magnetisk plade til at pellet perlerne. Tilsæt 20 mikroliter methyl-seq Elution Buffer til de vaskede perler, og inkuber dem ved stuetemperatur i 20 minutter.Brug en magnetisk plade til at pellet perlerne, og overføre supernatant til en ny strimmel rør. Først tilsættes 130 mikroliter bisulfit konvertering reagens til den tidligere indsamlede supernatant. Del de 150-mikroliter reaktioner ligeligt i to brønde.Derefter inkuberes reaktionerne i en termisk cycler. Brug 600 mikroliter bindingsbuffer til at binde prøverne til spinkolonnerne, og vask kolonnerne med 100 mikroliter vaskebuffer. Derefter skal du centrifuge kolonnerne og kassere flow-through.Derefter skal du tilføje 200 mikroliter Desulphonation Buffer til kolonnerne. Skuber kolonnerne i 15 til 20 minutter ved stuetemperatur. Vask kolonnerne to gange med 200 mikroliter vaskebuffer.Tilføj derefter 10 mikroliter Elution Buffer til kolonnen. Inkubere ved stuetemperatur, og centrifuge. Forbered PCR-reaktionsmasterblandingen i henhold til tekstprotokollen.Derefter tilsættes 82 mikroliter af master mix til hver prøve, og inkubere prøverne i en termisk cycler. Først skal du forberede PCR Master Mix Two på is i henhold til tekstprotokollen. Derefter tilsættes 25,5 mikroliter PCR Master Mix To og fem mikroliter af kommercielle indekseringsprimere, og prøverne inkuberes i en termisk cycler.Vurder DNA-koncentrationen af prøverne med højfølsomt DNA-detektionsreagenser på en bioanalyser. Methyl-Seq-bibliotekerne sendes derefter til sekvensering på den næste generation af sequencer. Efter bisulfit konvertering og PCR forstærke validering prøver, forberede en master mix med Bindende Buffer, vand, og streptavidin-belagt sepharose perler.Derefter tilsættes 75 mikroliter af master mix og fem mikroliter af det indlejrede PCR produkt til en 96-brønd plade, og ryst pladen på en plade shaker i 15 til 60 minutter. Mens pladen ryster, tilsættes 12 mikroliter af primer til brøndene i en pyrosequencing assay plade. Efter omrystning skal du placere et vakuumværktøj i et trug fyldt med vand og derefter placere værktøjet i pladen med bindende reaktioner.Dernæst nedsænkes vakuumværktøjet i halvt fyldte trug, der indeholder 70%ethanol, natriumhydroxid og Tris-acetat buffer. Afbryd vakuum, og placer vakuumværktøjet i HS pyrosequencing-analysepladen for at overføre perlerne. Placer pladen på en varmeblok, og inkuberes ved 80 grader Celsius i to minutter.Endelig skal du lade pladen køle af i fem minutter, før pyroprogrammet påbegyndes. I denne protokol gav en analyse af Methyl-Seq-bibliotekerne en rangeret liste over differentierede methylerede områder, eller DR'er, mellem stressede og ustressede dyr og et grafisk plot af DMR.Validering via bisulfit pyrosequencing viste, at de stressede dyr alle udviste højere methyleringsniveauer på tværs af alle CPG'er end de ikke-stressede dyr.Methyleringsniveauerne ved CpG 10 blev også sammenlignet med de gennemsnitlige tre ugers KORT-niveauer for hvert dyr. Resultaterne viser, at der er en beskeden sammenhæng mellem de endokrine data og methyleringsdata. Under forsøg på denne procedure, er det vigtigt at huske at sammenligne stigningen i den gennemsnitlige DNA-størrelse mellem DNA klipning og adapter ligation trin og for at sikre tilstrækkelig bibliotek mængde før sekvensering.Efter denne procedure kan andre lignende tilgange gennemføres for at besvare nye spørgsmål, såsom miljøgiftestoffers indvirkning på rotteneuroudvikling. Efter sin udvikling, denne teknik gav mulighed for forskere inden for epigenetik til at udforske genom-dækkende DNA methylering ændringer i enhver ikke-model eller model organismer, hvor genomiske sekvenser er tilgængelige. Glem ikke, at arbejde med de temperaturfølsomme enzymer kræver opbevaring på is, mens du er i brug og opbevaring i minus 20-graders fryser.RNA perler, der anvendes til målfangst, kræver optøning og opbevaring på is, mens de er i brug, og langtidsopbevaring i minus 80 graders fryser.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplex isotermisk forstærkning baseret diagnostiske Platform til at opdage Zika, Chikungunya og Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering af Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Massespektrometri Profilering af potentielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Platforminkubator med bevægelig XY-fase: En ny platform til implementering af in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En hurtig, upartisk fluorescerende metode til at detektere ændringer i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

En massespektrometribaseret tilgang til identifikation af fosfoproteinphosphataser og deres interaktionorer

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

En omfattende tilgang til analyse af cellekomponenterne i cerebrale blodpropper

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Image Analysis to Identify Protein Crystals

Image Analysis to Identify Protein Crystals (Video) | JoVE 

Billedanalyse til identifikation af proteinkrystaller