Name: a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door de NIH grant MH101392 (RSL) en steun van de volgende awards en stichtingen: een NARSAD Young Investigator Award, Margaret Ann prijs onderzoeker Fonds, het James Wah Mood Disorders geleerde fonds via de Charles T. Bauer Foundation, Baker Foundation en de Stichting van het Project-Match (RSL).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells.">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution.">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li><li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips.">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li><li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients.">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis.">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li><li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes.">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li><li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array.">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).</li><li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment.">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li><li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure.">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li><li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores.">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences.">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li><li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats.">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li><li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+open:closed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat.">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSmooth:+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions.">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li><li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+obesity:+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease.">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li><li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets,+coronary+heart+disease,+and+stress.">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li><li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition:+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction.">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li><li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=methylKit:+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles.">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes.">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low/binge+from+heavy+alcohol+drinking.">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li></ol>

Het manuscript is onderdeel van de prijs van een wedstrijd van Agilent Technologies.

In deze studie, we ontworpen en geïmplementeerd de Methyl-Seq-platform voor het genoom van de rat. Door aan te tonen het nut ervan met een rat-model van stress, toonden we aan dat de pijpleiding van experimentele en analytische differentieel gemethyleerd regio's tussen twee groepen van de vergelijking kan bieden.
Om te garanderen een succesvolle implementatie van het platform, moeten verschillende kritische stappen in acht worden genomen. Eerste, initiële DNA kwaliteit en kwantiteit heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit en kwantiteit van de definitieve Methyl-Seq-bibliotheek. We gebruikten een Fluorimeter, in plaats van een spectrofotometer, om ervoor te zorgen dat onze DNA meting weerspiegeld de hoeveelheid double-stranded DNA aanwezig. De bioanalyzer werd gebruikt voor het meten van de moleculaire grootte en hoeveelheid van DNA na scheren en na adapter afbinding. Controleren of de moleculaire grootte "shift" tussen deze stappen is cruciaal voor het bevestigen van de aanwezigheid van adapters aan het einde van elk fragment van DNA die adapter-gemedieerde PCR in de opeenvolgende stappen zal ondergaan. De hoeveelheid DNA resterende aan het eind van de adapter afbinding stap is ook belangrijk, sinds ten minste 100 ng van het product van de bibliotheek is die bij deze stap nodig is om voldoende hoeveelheid is beschikbaar na de doelgroep verrijking en Bisulfiet Omzetting stappen. Een definitieve ultragevoelige meting werd uitgevoerd op de geconstrueerde Methyl-Seq-bibliotheek, zodat de bibliotheek correct kan worden verdund voor latere clustering op de volgende-generatie-sequencer. Ten slotte was bisulfiet pyrosequencing werkzaam als een hoogst-kwantitatieve, onafhankelijke methode te beoordelen van de juistheid van de analytische pijpleiding. De uiteindelijke validatie met behulp van de oorspronkelijke monsters en replicatie met behulp van extra dieren zijn cruciale stappen om ervoor te zorgen dat het experiment biologisch belangrijke veranderingen in DNA-methylering kan detecteren.
Wij omvatten ook verschillende richtsnoeren in geval van afwijking van het protocol of als problemen ondervindt. Eerst, is het mogelijk om te verliezen teveel DNA tijdens einde-reparatie, adapter afbinding of magnetische kraal zuivering stappen. Anderzijds beginnen bedragen van DNA zou kleine (< 200 ng) als gevolg van de beperkte weefsel/DNA beschikbaarheid of de implementatie van verschillende verrijking methoden zoals het sorteren van de cel van de fluorescentie geactiveerd. Verhoging van het aantal cyclus tijdens de twee bibliotheek amplificatie stappen mogelijk kunnen compenseren voor het overmatig verlies van DNA of lage DNA bedrag in het gehele protocol bibliotheek bouw beginnen. Echter worden niet meer dan een extra 2-3 cycli aanbevolen, zoals overmatige sjabloon versterking dreigt te leiden tot een toename van het aantal dubbele leest wordt sequenced. Deze dubbele vermeldingen zijn uitgesloten tijdens de uitlijning stap om te voorkomen dat vooringenomenheid in percentage methylering berekeningen. Ten tweede, als de gemiddelde grootte van de DNA niet door meer dan 30 bps toeneemt, controleren om ervoor te zorgen dat de reagentia zijn nieuwe, als de polymerase van DNA van de T4, Klenow, en/of T4 ligase oude. Verkrijgbare vervanging reagentia kunnen worden gebruikt.
Bovendien is het mogelijk dat de voorspelde DMRs pyrosequencing, waar DNA methylering verschillen bestaan niet of zijn aanzienlijk minder dan voorspeld door de analyse niet kunnen valideren. Slechte validatie van kandidaat-regio's is een probleem te vaak voor veel genoom-brede analyses, zoals wanneer pyrosequencing resultaten differentiële methylering niet bevestigen of de effect grootte is veel kleiner dan die voorspeld door de analyse. BSmooth is een analytische pakket dat "glad" de methylering niveaus in een venster van meerdere CpGs. Voor de huidige experiment betrokken BSmooth een DMR waarvan methylering niveaus zijn gevalideerd door bisulfiet pyrosequencing. Er zal waarschijnlijk wel verschillen vastgesteld tussen methylering niveaus voorspeld door BSmooth en geverifieerd door pyrosequencing. De verschillen voortkomen uit de smoothing functie die de gemiddelde methylering waarden in alle van de CpGs binnen een DMR schat, met inbegrip van opeenvolgende CpGs die door meer dan 50% in methylation van DNA afwijken of CpGs waarvan methylation van de waarden werden uitgesloten wegens sub drempel Lees diepte. R-pakketten zoals MethylKit24 kunnen worden gebruikt voor identificatie van kleinere vensters of zelfs één CpGs waarvan methylering niveaus sterk met die gevalideerd door pyrosequencing correleren en CpGs. Uitvoering van de verschillende pakketten en testen hun voorspelde regio's of de CpGs van differentiële methylering door pyrosequencing zorgt robuustheid van gegevens. Als alternatief, originele Methyl-Seq bibliotheken kunnen worden resequenced en toegevoegd aan de gelezen bestanden toe Lees diepte. Aangezien de gehaltebepaling methylering semi-kwantitatieve en gedicteerde door het aantal leest [(# of CpGs) / (# van TpGs + CpGs)], verhoging van de Lees diepte voor een bepaalde CpG de nauwkeurigheid van de waarde van percentage methylering verhoogt. In deze studie vonden wij alleen CpGs waarvan methylation van de waarden werden bepaald door ten minste tien leest en een algehele Lees dekking van 19 x voor elke CpG bereikt.
De rat Methyl-Seq platform is niet zonder haar beperkingen. Hoewel het rendabeler dan bisulfiet geheel-genoom sequencing, is het aanzienlijk duurder dan andere methoden. Niettemin was de grootste deel van de kosten voor de aankoop van rijstroken op de sequencer en niet voor het systeem vastleggen. Afhankelijk van de diepte van Lees nodig met kruis-weefsel vergelijkingen vereisen minder als gevolg van grote (25-70%) verschillen12 in methylation van DNA, kan de kosten worden verminderd door multiplexing meer monsters per rijstrook en met behulp van een hogere capaciteit platform. Ook kost de monsterverwerking meer tijd dan andere methoden. Terwijl gelijkaardig aan andere pulldown benaderingen die gebruikmaken van de volgende generatie sequencing, toevoegen de toegevoegde Bisulfiet Omzetting en zuivering stappen aan de werklast. Globaal, is het Methyl-Seq-platform is een kosteneffectief alternatief voor geheel-genoom sequentiebepaling en cijferreeks basenpaar op meer dan 2,3 miljoen CpGs, dat is aanzienlijk meer dan de vehiculumcontrolegroep door microarray gebaseerde platformen. Tot op heden, de verkrijgbare mens en muis zijn Methyl-Seq platformen gebruikt om het document alcohol-afhankelijke veranderingen in de makaak hersenen25,26, neurologische genen in de muis hersenen9, en de blood-brain doelstellingen van glucocorticoïden10. Verder is maakt de mogelijkheid om zich te richten op specifieke regio's, ongeacht de volgorde erkenning door enzymen van de beperking het een ideaal platform voor cross-soorten vergelijkingen. Voor deze studie ontwierpen we de Methyl-Seq-platform voor de rat, waarvoor vele farmacologische, metabole en gedrags experimenten worden uitgevoerd zonder het voordeel van een genoom-brede methylomic tool. Onze gegevens tonen aan dat het kan worden gebruikt voor het detecteren van DMRs in een rat-model van stress en andere fysiologische parameters zoals algemene plasma CORT niveaus gecorreleerd.
De Methyl-Seq-platform is ideaal voor epigenetische experimenten in dieren met gesequenceerd genomen die wellicht niet genoeg experimenteel bewijsmateriaal documenteren van de regelgevende gebieden. Wanneer dergelijke regio's ter beschikking worden gesteld, kunnen extra gebieden worden speciaal ontworpen en gekoppeld aan de huidige versie. Verder, het platform is ideaal voor vergelijkende genomica, aangezien de verrijking van het doel niet wordt belemmerd door restrictie-enzym erkenning. Bijvoorbeeld, kan de regio van de promotor van een gen van belang worden vastgelegd ongeacht of het een specifieke beperkingsplaats havens. Ook kunnen eventuele regelgevende gebieden, zoals die welke in de muis of mens, die zijn bewaard in het genoom van belang worden vastgelegd.

Voorschotten in high-throughput sequencing hebben geleid tot een schat aan de genomic opeenvolgingen voor zowel model als niet-modelorganismen. De beschikbaarheid van dergelijke sequenties heeft onderzoek in genetica, vergelijkende genomica en transcriptomics vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, beschikbaar genomic opeenvolgingen zijn zeer nuttig voor het uitlijnen van sequencing gegevens van ChIP-Seq experimenten die DNA op basis van zijn associatie met histone modificaties1of bisulfiet sequencing verrijken, welke maatregelen methylation van DNA door opsporen van uracil gevormd uit Bisulfiet Omzetting van unmethylated cytosines2. Echter zijn er vertragingen bij de tenuitvoerlegging van epigenomic-platforms die beschikbaar genomic sequencing gegevens in hun ontwerp als gevolg van een gebrek aan geannoteerde gegevens van soortspecifieke regulerende sequenties die invloed op de genfunctie uitoefenen kunnen opnemen.
In het bijzonder is methylation van DNA een van de meest bestudeerde epigenetische aanpassingen op DNA dat kan hefboomwerking beschikbare genomic gegevens voor het bouwen van een methylomic platform. Een voorbeeld hiervan is een array gebaseerde platform voor de menselijke methylome3, die wijd verbeid in verschillende disciplines van oncologie psychiatrie4,5 gebruikt is. Soortgelijke platforms voor niet-menselijke dierlijke modellen zijn helaas schaars is, aangezien er vrijwel geen gebruikte platforms die hebben geprofiteerd van de genomic volgorde in hun oorspronkelijke ontwerp.
Een gemeenschappelijke methode voor de beoordeling van het methylomic landschap van niet-menselijke dierlijke modellen is verminderde vertegenwoordiging bisulfiet sequencing (RRBS)6. Deze aanpak overwint de kosten van de gehele-genoom bisulfiet sequencing waarmee, terwijl het verstrekken van een uitgebreide methylomic landschap, lagere Lees-diepte dekking als gevolg van de kosten en de beperkte functionele informatie in grote gebieden van de gen-armen van het genoom2 . RRBS houdt de samenvatting van de beperking en grootte-selectie van genomic DNA te verrijken voor zeer GC-rijke reeksen zoals CpG eilanden die vaak worden gevonden in de buurt van gene initiatiefnemers en dacht dat een rol te spelen in gen verordening7. Terwijl de methode RRBS is gebruikt in een aantal belangrijke studies, is haar afhankelijkheid van de enzymen van de beperking niet zonder opvallende uitdagingen en beperkingen. Bijvoorbeeld, is verrijking van GC-rijke sequenties in RRBS volledig afhankelijk van de aanwezigheid van specifieke opeenvolgingen erkend door de restrictie-enzym en de daaropvolgende maat keuze door elektroforese. Dit betekent dat elke genomic gebieden die geen deze beperkingsplaatsen bevatten zijn uitgesloten tijdens de selectie van de grootte. Kruis-soorten vergelijkingen zijn ook uitdagend tenzij de dezelfde beperkingsplaatsen in de dezelfde loci onder de verschillende soorten aanwezig zijn.
Een benadering voor het overwinnen van de beperkingen van RRBS is het gebruik van een methode van de verrijking die van de gepubliceerde genomic sequentie in het ontwerp van het platform profiteert. Het arraygebaseerd menselijke platform gebruikt primer sondes ontworpen tegen specifieke CpGs voor allele-specifieke (CG vs. TG na bisulfiet omzetting) doel gloeien en primer extensie. Haar ontwerp weerspiegelt niet alleen de beschikbare menselijke genomic volgorde, maar experimenteel geverifieerd regelgevende regio's verworven van meerdere lijnen van onderzoek, zoals ENCODE en ENSEMBL8. Ondanks het ruime gebruik ervan in menselijke methylomic onderzoeken bestaat een soortgelijk platform niet voor model dieren. Daarnaast plaatst de indeling arraygebaseerd aanzienlijke beperking op de oppervlakte die beschikbaar is voor de plaatsing van de sonde. In de afgelopen jaren, hebben inspanningen geleverd om te combineren van de doel-specificiteit door vangen sonde ontwerp en de functie van de hoge-doorvoer van volgende-generatie sequencing geboden. Een dergelijke inspanning heeft geleid tot de sequentiebepaling gebaseerde target verrijking-systeem voor de muis-genoom (muis Methyl-Seq), die werd gebruikt als aanduiding van de hersenen-specifieke of glucocorticoide-geïnduceerde verschillen in methylering9,10. Soortgelijke platforms voor andere model en niet-model dieren zijn nodig om epigenomic onderzoek in deze dieren.
Hier tonen we de uitvoering van dit nieuwe platform te analyseren van de methylomic op de rat. De rat heeft gediend als een belangrijke diermodel in farmacologie, metabolisme, neuroendocrinologie en gedrag. Bijvoorbeeld, is er een toenemende behoefte te begrijpen van de onderliggende mechanismen die aanleiding tot drug toxiciteit, overgewicht, stress-respons of drugsverslaving geven. Een high-throughput platform geschikt voor het vastleggen van de wijzigingen van de methylomic die zijn gekoppeld aan deze voorwaarden zou het vergroten van ons begrip van de mechanismen. Sinds het genoom van de rat ontbreekt nog steeds een aantekening voor regelgevende gebieden, we opgenomen niet-redundante initiatiefnemers, CpG eilanden, eiland oevers11, en eerder aangeduid GC-rijke sequenties in de rat Methyl-Seq platform12.
Om te beoordelen succesvol ontwerp en tenuitvoerlegging van het platform SureSelect Target verrijking (generiek Methyl-Seq genoemd) voor de rat genoom, we een rat model van chronische variabele spanning (CVS)13 te identificeren differentieel methylated gebruikt regio's tussen onbeklemtoonde en gestresste dieren. Onze platformontwerp, protocol en uitvoering kunnen nuttig zijn voor onderzoekers die willen een uitgebreide en onbevooroordeelde epigenetische onderzoek in te stellen op een organisme waarvan genomic volgorde is al beschikbaar, maar blijft slecht geannoteerde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Radioimmuno assay (RIA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>7120126</td>
			<td>Corticosterone, 125I labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Pure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre/Illumina</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1102</td>
			<td>Used with 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td>Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>100% Ethanol, molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be capable of 20000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>High sensitivity DNA detection reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G9651A</td>
			<td>Reagents for preparing the Methyl-Seq library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931143</td>
			<td>RNA baits for enrichment of rat targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE, pH 8.0</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>11-05-01-09</td>
			<td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E-series or S-series</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>-</td>
			<td>Isothermal sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA-Binding magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96S Super Magnet</td>
			<td>ALPAQUA</td>
			<td>A001322</td>
			<td>Magnetic plate for purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td>Electrophresis-based bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA110 SpeedVac</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Vacuum Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Streptavidin magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake Tube Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>415110Q</td>
			<td>Nutator Mixer is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5006</td>
			<td>Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hi-Seq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>-</td>
			<td>Next-generation sequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR and Pyrosequencing Primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Variable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark MD96</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>-</td>
			<td>Pyrosequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>70% Ethanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>0.2 M NaOH denature buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Base) from J.T. Baker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-508</td>
			<td>10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>972807</td>
			<td>Reagents required for pyrosequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Annealing Buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Binding Buffer (200 ml)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td>Streptavidin-coated sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q96 HS Plate</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979101</td>
			<td>Pyrosequencing assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td>Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureDesign Website</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSC Genome Browser</td>
			<td>University of California Santa Cruz</td>
			<td>-</td>
			<td>rat Nov 2004 rn4 assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure

Zoals genoom van een breder scala dieren beschikbaar komen, is er een toenemende behoefte aan tools die dynamische Epigenetische veranderingen in deze dierlijke modellen kunt vastleggen. De rat is een bepaald model dier waar een epigenetische instrument veel farmacologische en behavioral studies inzichtelijke mechanistische informatie te verschaffen kan aanvullen. Te dien einde aangepast we de SureSelect Target Capture System (hierna: Methyl-Seq) voor de rat, die DNA methylering niveaus over het genoom van de rat beoordelen kan. Het ontwerp van de rat gericht initiatiefnemers, CpG eilanden eiland oevers en GC-rijke regio's uit alle RefSeq genen.
Ter uitvoering van het platform op een rat-experiment, werden mannelijke Sprague-Dawley ratten blootgesteld aan chronische variabele spanning voor 3 weken, waarna de bloedmonsters werden verzameld voor genomic DNA-extractie. Methyl-Seq bibliotheken werden opgebouwd uit de rat DNA-monsters door scheren, adapter afbinding doel verrijking, Bisulfiet Omzetting en multiplex. Bibliotheken werden sequenced op een volgende-generatie sequencing-platform en de gesequenceerd leest werden geanalyseerd om te achterhalen van DMRs tussen DNA van beklemtoonde en onbeklemtoonde ratten. Top kandidaat DMRs werden onafhankelijk gevalideerd door bisulfiet pyrosequencing te bevestigen de robuustheid van het platform.
Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq-platform een nuttig epigenetische hulpmiddel dat vangen methylering veranderingen bij blootstelling is kan te benadrukken.

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

We beschrijven hier, het protocol en de uitvoering van Methyl-Seq, een epigenomic-platform, met behulp van een rat-model om epigenetische veranderingen die zijn gekoppeld aan chronische stress blootstelling te identificeren. Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq platform is voor het opsporen van methylation van verschillen die uit stress blootstelling bij ratten voortvloeien van.

Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenomics door aan te tonen hoe een op sequencing gebaseerd instrument te ontwerpen en te implementeren om de impact van omgevingsfactoren op DNA-methylatie te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een meer uitgebreide en kwantitatieve methode kan bieden om DNA-methylatieniveaus te beoordelen in vergelijking met arraygebaseerde platforms. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de identificatie van DNA-methylatieveranderingen als gevolg van verschillende soorten fysiologische processen in elk organisme waarvan de sequentiegegevens beschikbaar zijn.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de impact van stress op DNA-methylatie, kan het ook worden toegepast op andere omgevingsfactoren of fysiologische aandoeningen, zoals de blootstelling aan milieutoxicanten in vetrijke voeding en aandoeningen zoals diabetes en hart- en vaatziekten. Na het scheren van DNA en het verifiëren van de grootte via bioanalyzer, voeg 180 microliters van DNA-bindende magnetische kralen aan elk monster, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Pellet de kralen op een magnetische plaat, en verwijder de supernatant.Resuspend de pellet in 200 microliters van 70% ethanol. Gebruik vervolgens een magnetische plaat om de kralen te pelleteren en zoveel mogelijk ethanol te verwijderen. Droog de kralen in een hitteblok op 37 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten.Dan, resuspend de pellet in 44 microliters van nuclease-vrij water, en verzamel ongeveer 42 microliter van de supernatant. Na het ligateren van de adapters en het verifiëren van ligatie via bioanalyzer, breng de monsters over naar lage DNA-bindende microcentrifugebuizen. Gebruik vervolgens een verwarmde vacuümconcentrator om het monstervolume onder de 3,4 microliter te verminderen.Voeg hierna 5,6 microliter methyl-Seq-blokmix toe aan elk monster en broed ze uit in een thermische cycler. Maak De hybridisatiemix van capture library voor volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens 20 microliter van Capture Library Hybridization Mix toe aan elk monster en broed gedurende 16 uur uit op 65 graden Celsius.Bereid tegen het einde van de incubatietijd streptavidin magnetische kralen voor door 50 microliter streptavidin magnetische kralen per monster toe te voegen aan een nieuwe achtputige stripbuis. Was de kralen met 200 microliter methyl-Seq Binding Buffer. Plaats de stripbuis op een magnetische plaat en verwijder de supernatant uit de kralen.Vervolgens, resuspend de kralen in 200 microliters van Methyl-Seq Binding Buffer. Voeg de monsters toe aan de gewassen streptavidin kralen en broed ze 30 minuten op kamertemperatuur op een roterende mixer. Terwijl de monsters mengen, aliquot 200 microliters van Methyl-Seq Wash Buffer Twee in drievoudige putten van een 96-put plaat en pre-warm tot 65 graden Celsius.Na de monsters incubeer, pellet de magnetische kralen met een magnetische plaat en verwijder de supernatant. Dan, resuspend de kralen in 200 microliters van Methyl-Seq Wash Buffer One. Broed de kralen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gebruik een magnetische plaat om de supernatant te verwijderen.Daarna, resuspend de kraal pellet in 200 microliters van voorverwarmde Wash Buffer Two. Vervolgens, incubeer de kralen in een thermische cycler alvorens een magnetische plaat om de kralen pellet. Voeg 20 microliter methyl-Seq Elution Buffer toe aan de gewassen kralen en broed ze 20 minuten op kamertemperatuur.Gebruik een magnetische plaat om de kralen pellet, en breng de supernatant naar een nieuwe strip buis. Voeg eerst 130 microliter bisulfieconversiereagereagereageagentia toe aan het eerder verzamelde supernatant. Verdeel de 150-microliter reacties even in twee putten.Vervolgens, inculbateren van de reacties in een thermische cycler. Gebruik 600 microliters bindingsbuffer om de monsters aan de draaikolommen te binden en de kolommen te wassen met 100 microliter van Wash Buffer. Vervolgens centrifugeren de kolommen, en gooi de flow-through.Voeg hierna 200 microliters van Desulfonatiebuffer toe aan de kolommen. Broed de kolommen 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de kolommen twee keer met 200 microliters van Wash Buffer.Voeg vervolgens 10 microliter elutionbuffer toe aan de kolom. Incubeer bij kamertemperatuur, en centrifuge. Bereid de PCR-reactiemastermix volgens het tekstprotocol voor.Voeg vervolgens 82 microliter van de mastermix toe aan elk monster en ontcubeer de monsters in een thermische cycler. Bereid eerst de PCR Master Mix Two op ijs volgens het tekstprotocol. Voeg vervolgens aan elk monster 25,5 microliter PCR Master Mix Two en vijf microliter commerciële indexeringsprimeren toe en ontcunet de monsters in een thermische cycler.Beoordeel de DNA-concentratie van de monsters met zeer gevoelige DNA-detectiereagentia op een bioanalyzer. De Methyl-Seq bibliotheken worden vervolgens ingediend voor sequencing op de volgende generatie sequencer. Na bisulfite converteren en PCR versterken validatie monsters, bereiden een master mix met Binding Buffer, water, en streptavidin-gecoate sepharose kralen.Voeg vervolgens 75 microliter van de mastermix en vijf microliter van het geneste PCR-product toe aan een 96-putplaat en schud de plaat 15 tot 60 minuten op een plaatshaker. Terwijl de plaat schudt, voeg 12 microliter primer aan de putten van een pyrosequencing testplaat. Na het schudden plaatst u een vacuümgereedschap in een met water gevulde trog en plaats het gereedschap vervolgens met bindende reacties in de plaat.Vervolgens dompel het vacuümgereedschap onder in halfgevulde troggen met 70% ethanol, natriumhydroxide en Tris-acetaatbuffer. Koppel het vacuüm los en plaats het vacuümgereedschap in de HS pyrosequencing-testplaat om de kralen over te brengen. Plaats de plaat op een warmteblok, en incubeer op 80 graden Celsius gedurende twee minuten.Laat ten slotte de plaat vijf minuten afkoelen voordat u met het pyro-programma begint. In dit protocol, analyse van de Methyl-Seq bibliotheken op voorwaarde dat een gerangschikte lijst van gedifferentieerd methylated regio's, of DMRs, tussen gestreste en niet-belaste dieren en een grafisch perceel van de DMRs. Validatie via bisulfite pyrosequencing bleek dat de gestreste dieren alle tentoongesteld hogere methylatieniveaus in alle Cp's dan de onbekwaam dieren.Methylatieniveaus bij CpG 10 werden ook vergeleken met de gemiddelde drie weken durende CORT-niveaus voor elk dier. De resultaten geven aan dat er een bescheiden correlatie is tussen de endocriene en methylatiegegevens. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de toename van de gemiddelde DNA-grootte tussen DNA-afschuif- en adapterligatiestappen te vergelijken en om voldoende bibliotheekhoeveelheid te garanderen voorafgaand aan sequencing.Na deze procedure kunnen andere soortgelijke benaderingen worden toegepast om nieuwe vragen te beantwoorden, zoals de impact van milieutoxicanten op de neuroontwikkeling van ratten. Na de ontwikkeling ervan, deze techniek de middelen voor onderzoekers op het gebied van epigenetica om genoom-brede DNA-methylatie veranderingen in een niet-model of model organismen waar genomische sequenties beschikbaar zijn te verkennen. Vergeet niet dat het werken met de temperatuurgevoelige enzymen opslag op ijs vereist tijdens het gebruik en opslag in de min 20-graden vriezer.De RNA-kralen die worden gebruikt voor het vastleggen van het doel vereisen ontdooien en opslaan op ijs tijdens gebruik en langdurige opslag in de min 80-graden vriezer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Een alomvattende benadering om de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels te analyseren

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Image Analysis to Identify Protein Crystals

Image Analysis to Identify Protein Crystals (Video) | JoVE 

Beeldanalyse om eiwitkristallen te identificeren