Name: a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק-NIH MH101392 (RSL) וכן תמיכה פרסים וקרנות הבאים: פרס החוקר הצעיר NARSAD, מרגרט אן מחיר החוקר קרן, ג'יימס ווה רוח הפרעות מלומד הקרן באמצעות קרן באוור טי צ'ארלס, בייקר קרן, קרן התאמה הפרוייקט (RSL).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells.">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution.">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li><li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips.">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li><li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients.">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis.">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li><li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes.">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li><li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array.">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).</li><li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment.">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li><li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure.">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li><li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores.">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences.">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li><li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats.">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li><li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+open:closed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat.">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSmooth:+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions.">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li><li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+obesity:+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease.">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li><li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets,+coronary+heart+disease,+and+stress.">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li><li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition:+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction.">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li><li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=methylKit:+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles.">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes.">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low/binge+from+heavy+alcohol+drinking.">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li></ol>

כתב היד הוא חלק בפרס בתחרות של Agilent טכנולוגיות.

במחקר זה, אנחנו תוכננה ומומשה הפלטפורמה מתיל-Seq הגנום חולדה. על ידי הפגנת השירות שלה עם דגם עכברוש של מתח, אנחנו הראו כי הצינור ניסיוני אנליטיים יכול לספק אזורים מפוגל באופן שונה בין שתי קבוצות השוואה.
כדי להבטיח יישום מוצלח של הפלטפורמה, מספר שלבים קריטיים צריך להיות שנצפו. DNA לאיכות וכמות הראשון, הראשונית יש השפעה משמעותית על האיכות והכמות של הספרייה מתיל-Seq הסופי. השתמשנו fluorometer, במקום ספקטרופוטומטרים, כדי להבטיח מדידה הדנ א שלנו לידי ביטוי כמות כפולה גדילי DNA הנוכחי. Bioanalyzer שימש כדי למדוד את כמות ה-DNA בעקבות הטיה ואחרי מתאם מצדו וגודל מולקולרי. אימות גודל מולקולרי "מפנה" בין השלבים חיוני לאשר הנוכחות של מתאמי בקצוות של כל קטע DNA זה יעבור בתיווך מתאם ה-PCR בשלבים הבאים. כמות ה-DNA שנותרו בסוף השלב מצדו מתאם הוא גם חשוב, מאז לפחות 100 ננוגרם של המוצר הספרייה יש צורך בשלב זה כדי להבטיח כמות מספקת זמין לאחר השלבים ההמרה היעד עושר ולא ביסולפאט. מדידה רגישות גבוהה הסופי בוצע על הספרייה מתיל-Seq נבנה כך בספרייה יכולה לדלל כראוי עבור קיבוץ באשכולות הבאים על הרצפים הדור הבא. לבסוף, ביסולפאט pyrosequencing הועסק שיטה כמותית מאוד עצמאית כדי להעריך את הדיוק של הצינור אנליטית. האימות הסופי באמצעות דגימות המקורי שכפול באמצעות בעלי חיים נוספים הם צעדים חיוניים כדי להבטיח כי הניסוי ניתן לזהות שינויים משמעותיים מבחינה ביולוגית מתילציה DNA.
אנו כוללים גם מספר כללים מנחים במקרה של סטייה מהפרוטוקול או אם אתה נתקל בבעיות. קודם כל, זה אפשרי לאבד יותר מדי דנ א במהלך סוף-תיקון, מתאם מצדו או חרוז מגנטית טיהור צעדים. לחלופין, החל כמויות של הדנ א יכול להיות קטן (< 200 ng) עקב זמינות רקמות מוגבל/ה-DNA או יישום של שיטות שונות העשרה כגון קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא. הגדלת מספר מחזור במהלך השלבים הגברה שני ספריה עשוי להיות מסוגל לפצות על אובדן מוגזם של ה-DNA או נמוך החל כמות ה-DNA לאורך כל פרוטוקול בניית ספריה. עם זאת, לא יותר מאשר נוספים 2-3 מחזורי מומלצים, כמו תבנית מופרז הגברה זה עלול לגרום לעלייה במספר קריאות כפולים להיות רציף. כפילויות אלה לא יכללו במהלך השלב היישור כדי למנוע הטיה בחישובים מתילציה אחוז. שנית, אם הגודל הממוצע של ה-DNA אינו מעלה על ידי יותר מ 30 bps, בדוק כדי לוודא כי ריאגנטים הם חדשים, כמו T4 DNA פולימראז, Klenow, ו/או T4 ליגאז עשוי להיות זקן. החלפת זמינים מסחרית ריאגנטים יכול לשמש.
בנוסף, קיימת אפשרות כי DMRs החזוי אולי לא אמת על-ידי pyrosequencing, שבו הבדלים מתילציה DNA שאינם קיימים או באופן משמעותי פחות מאשר אלה חזה על ידי ניתוח. אימות המסכן של המועמד אזורים היא בעיה נפוצה גם עבור ניתוחים הגנום כולו רבים, כגון מתי pyrosequencing תוצאות לא לאשר מתילציה דיפרנציאלית או גודל האפקט הוא הרבה יותר קטן מאשר זה חזה על ידי הניתוח. BSmooth הוא אחד אנליטית חבילת הזה "מחליק" רמת מתילציה על פני חלון של מספר סחורות ארוזות לצרכן. לניסוי הנוכחי, BSmooth מעורבים DMR רמות מתילציה של מי היו אומת על-ידי ביסולפאט pyrosequencing. עם זאת, ככל הנראה יהיו סתירות בין רמות מתילציה שמנבאת BSmooth ואלה אומתו pyrosequencing. הסתירות נובעים פונקציית החלקת שמעריך את הערכים מתילציה הממוצע על-פני כל סחורות ארוזות לצרכן בתוך DMR, כולל רצופים סחורות ארוזות לצרכן זה עשוי להשתנות מתילציה DNA על ידי יותר מ- 50% או סחורות ארוזות לצרכן ערכיו מתילציה שוחררנו תופיפצה סף תת לקרוא לעומק. R-חבילות כגון MethylKit24 יכול לשמש כדי לזהות חלונות קטנים יותר של סחורות ארוזות לצרכן או אפילו יחיד סחורות ארוזות לצרכן אשר רמות מתילציה לתאם חריפה עם אלה על-ידי pyrosequencing. הטמעת חבילות שונות ובדיקות החזוי אזורים או סחורות ארוזות לצרכן של מתילציה דיפרנציאלי שלהם על-ידי pyrosequencing יבטיח החוסן של נתונים. לחלופין, ספריות מתיל-Seq המקורי יכול להיות מיון מחדש והוסיף בקבצי קריאה כדי להגדיל את עומק קריאה. מאז קביעת רמות מתילציה הם כמותיים למחצה ו מוכתב על ידי מספר הקריאות [(# of CpGs) / (# של TpGs + סחורות ארוזות לצרכן)], הגדלת העומק קריאה עבור CpG נתון יגדיל את הדיוק של ערכו מתילציה אחוז. במחקר זה, שקלנו רק סחורות ארוזות לצרכן ערכיו מתילציה נקבעו על ידי קורא לפחות עשרה והצלחתי קריאה הכולל סיקור 19 x עבור כל CpG.
פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש אינה ללא המגבלות. אמנם זה עלות יותר אפקטיבי מאשר רצף הגנום כולו ביסולפאט, זה משמעותית יקר יותר מאשר שיטות אחרות. למרות זאת, מרבית מהעלות היה עבור רכישת נתיבים על הרצפים (sequencer) ולא על מערכת לכידת. בהתאם העומק קריאה הצורך, עם השוואות בין רקמות הדורשים פחות בשל הבדלים גדולים (25 – 70%)12 ב מתילציה DNA, העלות יכול להיות מופחת על ידי ריבוב יותר דוגמאות לכל ליין באמצעות פלטפורמה קיבולת גבוהה יותר. בנוסף, הכנת הדוגמא היא אורכת זמן רב יותר משיטות אחרות. בעוד בדומה גישות אחרות הנפתח המשלבים הדור הבא רצפי, השלבים ההמרה טיהור וניקוי נוסף ביסולפאט להוסיף עומס העבודה. בסך הכל, פלטפורמת מתיל-Seq היא חלופה חסכונית רצף הגנום כולו, ומספק בסיס-זוג ברזולוציה ב. סחורות ארוזות, יותר מ- 2.3 מיליון לצרכן-וזה הרבה יותר מאשר אלה לבדיקה על ידי פלטפורמות מבוססת microarray. עד כה, את האדם זמין מסחרית ועכבר מתיל-Seq פלטפורמות שימשו כדי לתעד את השינויים תלויי-אלכוהול מקוק המוח25,26, גנים התפתחותיות במוח העכבר9, ו דם-מוח מטרות glucocorticoids10. עוד יותר, היכולת למקד אזורים ספציפיים בין רצף זיהוי על ידי אנזימי הגבלה הופך אותו לפלטפורמה אידיאלית השוואות בין-המינים. במחקר זה, תיכננו הפלטפורמה מתיל-Seq העכברוש, אשר תרופתי מטבולית, התנהגותית נסיוניות מבוצעות ללא הסיוע של כלי methylomic הגנום כולו. הנתונים שלנו מראים כי זה יכול לשמש כדי לזהות DMRs במודל של עכברים של מתח, בקורלציה פיסיולוגיים אחרים כגון רמות קורט פלזמה הכללית.
פלטפורמת מתיל-Seq הינו אידיאלי עבור epigenetic ניסויים בבעלי חיים עם הגנום ברצף זה ייתכן שאין מספיק ראיות לתעד אזורים רגולטוריות. כאשר אזורים כאלה נעשים זמינים, אזורים נוספים עשויים להיות אישית מעוצבת, המצורפות לגירסה הנוכחית. יתר על כן, פלטפורמת הינו אידיאלי עבור גנומיקה השוואתי, מאז העשרת היעד אינה מאולצת על ידי אנזים הגבלה זיהוי. למשל, האזור המקדם של הגן בכל עניין ניתן ללכוד ללא קשר אם זה בנמלים אתר הגבלה ספציפית. באופן דומה, ניתן ללכוד כל האזורים תקינה, כגון אלה שזוהו העכבר או בני אדם, אשר נשמרים הגנום של עניין.

ההתקדמות תפוקה גבוהה רצף הובילו שפע של רצף גנומית עבור דגם והן הלא-דגם אורגניזמים. הזמינות של רצפים כאלה הנחתה את מחקר גנטיקה, גנומיקה השוואתי ו transcriptomics. למשל, רצפים זמינים גנומית שימושיים מאוד עבור יישור נתונים רצף ניסויים שבב-Seq המעשירים DNA בהתבסס על שיוך היסטון שינויים1, או רצף ביסולפאט, אשר מודד מתילציה DNA על-ידי זיהוי אורציל נוצר ביסולפאט המרה של unmethylated cytosines2. עם זאת, היו עיכובים ביישום של פלטפורמות epigenomic משלבות נתונים זמינים רצף גנטי בעיצוב שלהם עקב מחסור בנתוני מוערת של רצפי תקינה ספציפית אשר יכולים להשפיע על תפקוד הגן.
בפרט, מתילציה DNA הוא אחד השינויים epigenetic למדה נרחב ביותר על ה-DNA זה יכול למנף נתונים זמינים גנומית לבניית פלטפורמת methylomic. דוגמה אחת כזו הוא פלטפורמה מבוססת על מערך אנושי methylome3, אשר כבר בשימוש נרחב בתחומים שונים מאונקולוגיה פסיכיאטריה4,5. למרבה הצער, פלטפורמות דומות עבור מודלים בבעלי חיים שאינם בני אדם הם נדירים, שכן ישנם כמעט לא בשימוש נרחב פלטפורמות אשר מנצלים רצף גנומית בעיצוב הראשונית שלהם.
שיטה נפוצה כדי להעריך את הנוף methylomic של מודלים בעלי חיים שאינם בני אדם הוא ייצוג מופחת ביסולפאט רצף (RRBS)6. גישה זו גוברת על העלות של רצף הגנום כולו ביסולפאט זה, תוך מתן נוף מקיף methylomic, מעניק כיסוי לקריאה-עומק נמוך יותר בשל עלות ומידע מוגבל תפקודית באזורים גדולים של ג'ין עלוב של הגנום2 . RRBS כרוך תקציר הגבלת גודל-מבחר של הדנ א כדי להעשיר עבור מאוד עשיר GC רצפים כגון איי CpG נפוץ נמצאו ליד הגן היזמים, חשב לשחק תפקיד בג'ין בתקנה7. ואילו בשיטה RRBS כבר בשימוש מספר מחקרים חשובים, הסתמכותו על אנזימי הגבלה אינה ללא האתגרים הבולטים ומגבלות. למשל, העשרה של רצפי GC-עשיר RRBS תלויה לחלוטין הנוכחות של רצפים ספציפיים מזוהה על-ידי אנזים הגבלה ובחירת גודל הבאים על ידי אלקטרופורזה. משמעות הדבר היא כי כל האזורים גנומית שאינן מכילות באתרים מגבלת אלה אינם נכללים בעת בחירת גודל. בנוסף, השוואות בין-המינים מאתגרת אלא אם באתרים מגבלת באותו קיימים לוקוסים אותו בין מינים שונים.
גישה אחת כדי להתגבר על המגבלות של RRBS היא להשתמש בשיטת העשרה מנצל רצף גנומית שפורסמו בעיצוב של הפלטפורמה. הפלטפורמה המבוססת על מערך אנושי משתמש הגששים פריימר מתוכנן נגד סחורות ארוזות לצרכן ספציפי להארכת אלל ספציפי (CG לעומת TG לאחר ההמרה ביסולפאט) המטרה חישול, פריימר. העיצוב משקף את רצף גנומית האנושי זמין, לא רק אזורים תקינה תבדוק-השפעול שנרכש שורות מרובות של חקירה, כמו קידוד ו- ENSEMBL8. למרות השימוש רחב בחקירות methylomic האנושי, פלטפורמה דומה אינו קיים מודל בעלי חיים. בנוסף, תבנית המבוססת על מערך המקומות אילוץ משמעותית על שטח זמין עבור מיקום המכשיר. מספר השנים האחרונות, נעשו מאמצים כדי לשלב למטרה-הייחודית המוענקת על ידי לכידת המכשיר ועיצוב התכונה תפוקה גבוהה של הדור הבא רצפי. כזה הביא במערכת העשרה היעד המבוסס על רצף הגנום העכבר (עכבר מתיל-Seq), אשר שימש כדי לזהות הבדלים ספציפיים במוח או glucocorticoid-induced מתילציה9,10. פלטפורמות דומות אחרות דגם וחיות -דגם נחוצים כדי להקל על epigenomic מחקר בבעלי חיים אלה.
. הנה, נדגים את היישום של פלטפורמה חדשנית זו לערוך ניתוח methylomic על החולדה. העכברוש שימש מודל חיה חשוב פרמקולוגיה, חילוף החומרים, neuroendocrinology, ובאופן הפעולה. לדוגמה, יש צורך להגדיל כדי להבין את המנגנונים שבבסיס כי להצמיח רעילות התרופה, השמנת יתר, תגובת המתח או התמכרות לסמים. פלטפורמה תפוקה גבוהה מסוגלת ללכוד methylomic שינויים הקשורים עם התנאים הללו יגביר את ההבנה שלנו של המנגנונים. מאז הגנום העכברוש חסר עדיין ביאור לאזורים רגולטוריות, אנחנו היזמים לא יתיר, האיים CpG, חופי האי11והחלה זוהו בעבר GC-עשיר רצפים לתוך העכברוש מתיל-Seq פלטפורמה12.
כדי להעריך עיצוב מוצלח ויישום של הפלטפורמה SureSelect היעד העשרה (המכונה כללי מתיל-Seq) הגנום עכברוש, אנחנו מועסקים מודל עכברוש של מתח כרוני משתנה (CVS)13 כדי לזהות באופן שונה מפוגל אזורים בין בעלי חיים unstressed, ולחוצה. פלטפורמה העיצוב שלנו, פרוטוקול, והיישום עשויה להיות שימושית עבור חוקרים מי עשוי לרצות לנהל חקירה epigenetic מוטים ומקיף על אורגניזם רצף גנומית של מי שכבר זמין אך נשאר גרוע המבואר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Radioimmuno assay (RIA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>7120126</td>
			<td>Corticosterone, 125I labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Pure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre/Illumina</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1102</td>
			<td>Used with 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td>Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>100% Ethanol, molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be capable of 20000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>High sensitivity DNA detection reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G9651A</td>
			<td>Reagents for preparing the Methyl-Seq library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931143</td>
			<td>RNA baits for enrichment of rat targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE, pH 8.0</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>11-05-01-09</td>
			<td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E-series or S-series</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>-</td>
			<td>Isothermal sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA-Binding magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96S Super Magnet</td>
			<td>ALPAQUA</td>
			<td>A001322</td>
			<td>Magnetic plate for purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td>Electrophresis-based bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA110 SpeedVac</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Vacuum Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Streptavidin magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake Tube Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>415110Q</td>
			<td>Nutator Mixer is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5006</td>
			<td>Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hi-Seq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>-</td>
			<td>Next-generation sequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR and Pyrosequencing Primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Variable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark MD96</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>-</td>
			<td>Pyrosequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>70% Ethanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>0.2 M NaOH denature buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Base) from J.T. Baker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-508</td>
			<td>10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>972807</td>
			<td>Reagents required for pyrosequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Annealing Buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Binding Buffer (200 ml)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td>Streptavidin-coated sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q96 HS Plate</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979101</td>
			<td>Pyrosequencing assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td>Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureDesign Website</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSC Genome Browser</td>
			<td>University of California Santa Cruz</td>
			<td>-</td>
			<td>rat Nov 2004 rn4 assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure

כפי הגנומים של מגוון רחב יותר של בעלי חיים הופכים לזמינים, אין צורך להגדיל עבור כלים יכול ללכוד שינויים epigenetic דינמיים במודלים של בעלי חיים אלה. העכברוש הוא חיה אחת בדגם המסוים שבו כלי epigenetic יוכלו להשלים לימודי תרופתי והתנהגותיות רבות לספק מידע מכניסטית תובנה. לשם כך, שינינו SureSelect ללכוד מערכת היעד (המכונה מתיל-Seq) את העכברוש, אשר יכול להעריך רמות מתילציה DNA ברחבי הגנום חולדה. העיצוב עכברוש לפלח היזמים, האיים CpG, חופי האי ואזורי GC-עשיר של כל הגנים RefSeq.
כדי ליישם את הפלטפורמה על ניסוי עכברים, חולדות ספראג Dawley זכר נחשפו מתח כרוני משתנה במשך שלושה שבועות, אחרי אשר נאספו דגימות דם להפקת DNA גנומי. מתיל-Seq ספריות נבנו בין דגימות DNA חולדה על ידי הטיה, מתאם מצדו, היעד העשרה, ביסולפאט המרה ריבוב. ספריות היו וסודרו על פלטפורמת הדור הבא רצפי וניתח הקריאות ברצף היו לזהות את DMRs בין ה-DNA של חולדות לחוץ, unstressed. המועמדים המובילים DMRs היו לאימות באופן עצמאי על-ידי ביסולפאט pyrosequencing לאשר את היציבות של פלטפורמת.
תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא כלי שימושי epigenetic ניתן ללכוד מתילציה שינויים המושרה על ידי חשיפה ללחץ.

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת יישומו של מתיל-Seq, פלטפורמה epigenomic, באמצעות מודל עכברוש לזיהוי שינויים epigenetic הקשורים בחשיפה מתח כרוני. תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא מסוגל זיהוי הבדלים מתילציה הנובעים מחשיפה ללחץ אצל חולדות.

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנומיקה על ידי הדגמת כיצד לתכנן וליישם כלי מבוסס רצף כדי להעריך את ההשפעה של גורמים סביבתיים על מתילציה DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לספק שיטה מקיפה וכמותית יותר להערכת רמות מתילציה של DNA בהשוואה לפלטפורמות מבוססות מערך. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת זיהוי של שינויים מתילציה DNA בשל סוגים שונים של תהליכים פיזיולוגיים בכל אורגניזם שנתוני הרצף שלהם זמינים.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ההשפעה של מתח על מתילציה DNA, זה יכול להיות מיושם גם על גורמים סביבתיים אחרים או תנאים פיזיולוגיים, כגון חשיפה רעילים סביבתיים בתזונה עתירת שומן ותנאים כגון סוכרת ומחלות לב וכלי דם. לאחר גירוז DNA ואימות הגודל באמצעות bioanalyzer, להוסיף 180 microliters של חרוזים מגנטיים מחייב DNA לכל מדגם, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. גלולה את חרוזים על צלחת מגנטית, ולהסיר את supernatant.תן שימוש חוזר לכדור ב-200 מיקרוליטרים של 70%אתנול. לאחר מכן, להשתמש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים, ולהסיר אתנול רב ככל האפשר. יבש את חרוזים בבלוק חום ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות.לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה ב 44 microliters של מים ללא גרעין, ולאסוף כ 42 microliters של supernatant. לאחר קשירה של המתאמים ואימות קשירה באמצעות bioanalyzer, להעביר את הדגימות צינורות microcentrifuge מחייב DNA נמוך. לאחר מכן, השתמש ברכז ואקום מחומם כדי להפחית את נפח המדגם מתחת ל-3.4 מיקרוליטר.לאחר מכן, להוסיף 5.6 microliters של מתיל-Seq בלוק לערבב לכל מדגם, ודגירה אותם במחזור תרמי. הכן שילוב הכלאה של ספריית לכידה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מיקס ההכלאה של ספריית הלכידה לכל מדגם, והדגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.לקראת סוף תקופת הדגירה, הכינו חרוזים מגנטיים סטרפטבידין על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין לכל מדגם לצינור רצועה חדש בן שמונה בארות. לשטוף את חרוזים עם 200 microliters של מאגר כריכת מתיל-Seq. מניחים את צינור הרצועה על צלחת מגנטית, ומסירים את העל-טבעי מהחרוזים.לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-200 מיקרוליטרים של מאגר כריכת מתיל-סק. מוסיפים את הדגימות לחדדי סטרפטבידין השטופים, ודגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על מערבל מסתובב. בעוד הדגימות לערבב, aliquot 200 microliters של מתיל-Seq לשטוף Buffer שתיים לתוך בארות טריליקט של צלחת 96 היטב מראש חם ל 65 מעלות צלזיוס.לאחר הדגימות דגירה, גלולה חרוזים מגנטיים עם צלחת מגנטית ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-200 מיקרוליטרים של מאגר כביסה של מתיל-סק 1. דוגרים את החמרוזים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשתמש בצלחת מגנטית כדי להסיר את העל-טבעי.לאחר מכן, תן שימוש חוזר גלולת חרוזים ב 200 microliters של מאגר לשטוף מחומם מראש 2. לאחר מכן, הדגירה את חרוזים במחזור תרמי לפני השימוש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון מתיל-סק לחדדים השטופים, והאדמו אותם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.השתמש בצלחת מגנטית כדי גלולה את חרוזים, ולהעביר את supernatant לצינור רצועה חדש. ראשית, להוסיף 130 microliters של reagent המרה ביסולפית כדי supernatant שנאסף בעבר. חלק את התגובות של 150 מיקרוליטר באופן שווה לשתי בארות.לאחר מכן, הדגירה את התגובות במחזור תרמי. השתמש 600 microliters של מאגר כריכה כדי לאגד את הדגימות לעמודי ספין, ולשטוף את העמודים עם 100 microliters של מאגר לשטוף. לאחר מכן, צנטריפוגה העמודות, ולזרוק את הזרימה דרך.לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר דסולפוניזציה לעמודות. הדגירה את העמודים במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את העמודים פעמיים עם 200 microliters של חופר לשטוף.לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לעמודה. דגירה בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה. הכן את שילוב תבנית הבסיס לתגובת PCR בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, הוסיפו 82 מיקרוליטרים של תערובת האב לכל דגימה, והדגירה את הדגימות במחזור התרמי. ראשית, להכין את PCR מאסטר לערבב 2 על הקרח על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לכל מדגם, להוסיף 25.5 microliters של PCR מאסטר לערבב שני וחמישה microliters של פריימרים אינדקס מסחרי, ותדגיר את הדגימות במחזור תרמי.להעריך את ריכוז ה-DNA של הדגימות עם רייגנטים גילוי DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer. ספריות מתיל-Seq נשלחות לאחר מכן לרצף ברצף הדור הבא. לאחר המרת ביסולפיט ודגימות אימות הגברה של PCR, הכינו תערובת ראשית עם חיץ כריכה, מים וחרוזי ספרוז מצופים סטרפטוודין.לאחר מכן, הוסיפו 75 מיקרוליטרים של תערובת האב וחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR מקונן לצלחת של 96 בארות, ונערו את הצלחת על שייקר צלחת במשך 15 עד 60 דקות. בזמן שהצלחת רועדת, מוסיפים 12 מיקרוליטרים של פריימר ל הבאר של צלחת בדיקה פירוזקווינקינג. לאחר הרעידות, מניחים כלי ואקום באבוס מלא במים, ואז מניחים את הכלי בצלחת עם תגובות מחייבות.לאחר מכן, הטביעו את כלי הוואקום באבוסים מלאים למחצה המכילים 70% אתנול, נתרן הידרוקסידי ומאגר טריס-אצטט. נתק את הוואקום, והצב את כלי הוואקום בצלחת ההסקה של HS כדי להעביר את חרוזים. מניחים את הצלחת על בלוק חום, ודגירה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.לבסוף, לאפשר את הצלחת להתקרר במשך חמש דקות לפני תחילת תוכנית pyro. בפרוטוקול זה, ניתוח של ספריות מתיל-Seq סיפק רשימה מדורגת של אזורים מתילציה דיפרנציאלית, או DMRs, בין בעלי חיים לחוצים ובלתי מעורערים לבין חלקה גרפית של DMRs. אימות באמצעות pyrosequencing ביסולפי הראה כי בעלי החיים הדגיש כל הציגו רמות מתילציה גבוהות יותר על פני כל CpGs מאשר בעלי החיים unstressed.רמות מתילציה ב- CpG 10 הושוו גם לרמות ה- CORT הממוצעות של שלושה שבועות עבור כל בעל חיים. התוצאות מצביעות על כך שיש מתאם צנוע בין הנתונים האנדוקרינית ומתילציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשוות את הגידול בגודל ה- DNA הממוצע בין גיזום DNA לבין שלבי רצועות מתאם ולהבטיח כמות ספריה מספקת לפני רצף.בעקבות הליך זה, גישות דומות אחרות ניתן ליישם על מנת לענות על שאלות חדשניות, כגון ההשפעה של רעילים סביבתיים על נוירו-פיתוח עכברוש. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סיפקה לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור שינויים במתילציה של דנ"א כלל-גנומי בכל אורגניזמים שאינם מודלים או מודלים שבהם רצפים גנומיים זמינים. אל תשכחו שעבודה עם האנזימים הרגישים לטמפרטורה דורשת אחסון על קרח בזמן השימוש והאחסון במקפיא של מינוס 20 מעלות.גם קדזי ה-RNA המשמשים ללכידת מטרה דורשים הפשרה ואחסון על קרח בזמן השימוש והאחסון לטווח ארוך במקפיא במינוס 80 מעלות.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Image Analysis to Identify Protein Crystals

Image Analysis to Identify Protein Crystals (Video) | JoVE 

ניתוח תמונה לזיהוי גבישי חלבון