Name: a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00
Duration: 9 min 6 s
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この研究は、NIH グラント MH101392 (RSL) と次の賞を受賞し基礎からのサポートによって賄われていた: NARSAD 若手研究者賞、マーガレット アン価格調査基金、チャールズ t. バウアー財団は、パン屋でジェームズ ・華気分障害学者基金財団法人、およびプロジェクトの一致財団 (RSL)。

<ol>
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A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low/binge+from+heavy+alcohol+drinking.">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li></ol>

原稿は、アジレント ・ テクノロジーからコンテストの賞金の一部です。

本研究では、設計し、ラットのゲノムのメチル Seq プラットフォームを実装します。ストレスのモデルラットにその有用性を発揮し、実験的・解析的パイプラインが比較の 2 つのグループ間の特異的メチル化領域を提供できる私たちを発揮します。
プラットフォームの実装を成功させるためには、いくつかの重要なステップは、観察する必要があります。最初、初期 DNA の質と量は最終的なメチル Seq ライブラリの量と質に大きな影響を与える。私たちの DNA の測定が現在の二本鎖 DNA の量を反映するために、蛍光光度計、分光光度計よりもむしろを使いました。バイオアナライザーは分子サイズとアダプター結紮後せん断に続く DNA の量を測定していました。「シフト」これらのステップ間の分子のサイズの検証は、以降の手順でアダプターを介した PCR を受ける各 DNA 断片の両端にアダプターの存在を確認することが重要です。DNA アダプター結紮ステップの終わりに残りの数量は、少なくとも 100 からも重要であるライブラリ製品の ng が十分な量がターゲットの濃縮と重亜硫酸塩の変換の手順後に利用できるようにするこの手順で必要です。最終的な高感度測定は、ライブラリを正しく次世代シーケンサーの後続のクラスタ リングのため薄くことができるように構築されたメチル Seq ライブラリで実行されました。最後に、重亜硫酸塩パイロシークエンスは解析パイプラインの精度を評価するために非常に量的な独立したメソッドとして採用されました。元のサンプルおよび付加的な動物を使用して、レプリケーションを使用して最終的な検証は、DNA メチル化の実験が生物学的に重要な変更を検出できるようにする重要なステップです。
我々 もが発生した場合、プロトコルからの逸脱または問題が発生したかどうかいくつかのガイドラインが含まれます。まず、最後修理、アダプター結紮または磁気ビーズ精製工程中にあまりにも多くの DNA を失うことが可能です。また、量の DNA を開始小さなことができる (< 200 ng) 限られた組織/DNA 可用性または蛍光活性化細胞選別などさまざまな濃縮方法の実施のため。DNA の過度の損失を補償することができるまたは低 DNA ライブラリ構築プロトコル全体量を開始 2 つのライブラリの増幅段階でサイクル数を増やすことがあります。ただし、いいえ追加より 2-3 サイクルが推奨、過剰なテンプレートの増幅が配列されている重複読み取りの数の増加につながる可能性があります。これらの重複は、パーセントのメチル化計算でバイアスを防ぐために、アライメント」ステップ時に除外されます。第二に、以上 30 bps によって DNA の平均サイズが向上しない場合、は、試薬の新しい、T4 DNA ポリメラーゼ、Klenow、または T4 リガーゼが古い可能性がありますを確認します。市販の交換用試薬を使用することができます。
また、予測の Dmr がパイロシークエンス、DNA メチル化の違いが存在しないか、分析で予測されたものよりも大幅に少ないが、検証が可能です。候補地域の貧しい人々 の検証もときパイロシークエンス結果がメチル化を確認しないなど、多くのゲノム解析の一般的な問題であるか、効果量は分析によって予測よりもはるかに小さい。BSmooth は、複数の Cpg のウィンドウを横切る 1 つ分析パッケージ「平滑化」のメチル化レベルです。現在の実験では、BSmooth には DMR のメチル化レベルの重亜硫酸塩ピロシーケンスによる検証が関与しています。しかし、おそらくこと BSmooth によって予測されるメチル化レベルとピロシーケンスによるこれらの不一致があります。不一致はすべて持ち、連続の Cpg DNA のメチル化の 50% 以上によって異なる場合がありますまたは Cpg メチル化値を持つために除外されたを含む内の Cpg のメチル化平均値を推定するスムージング機能から生じるサブしきい値には、深さがお読みください。MethylKit24などの R パッケージは、Cpg または単一 Cpg のメチル化レベルが相関関係が強くピロシーケンスによる検証の小さい窓を識別するために使用できます。異なるパッケージを実装する、予測地域や差分のメチル化 Cpg をピロシーケンスによる試験データの信頼性が保証されます。また、元メチル Seq ライブラリを resequenced し、読み取りの深さを増加する読み取りファイルに追加できます。メチル化レベルの定量は読み取りの数によって半定量的決定 [(# of CpGs)/(# TpGs + Cpg)]、与えられた CpG がその % メチル化値の精度を向上させるための読み取りの深さを増やします。本研究では我々 だけ Cpg メチル化値が少なくとも 10 の読み取りによって定められた、各 CpG の 19 x の全体的な読み取り範囲を達成すると見なされます。
ラット メチル Seq プラットフォームは、制限なしです。全ゲノムの重亜硫酸塩の配列よりも費用対効果は、他の方法よりもかなり高価です。それにもかかわらず、費用のほとんどは、キャプチャ システムで、シーケンサーの車線を購入するためだった。クロス組織比較少ない大きい (25-70%) の違い12 DNA メチル化のために必要とする、必要に応じての読み取りの深さに応じてレーンあたりより多くのサンプルを多重化し、大容量プラットフォームを使用してコストを削減することができます。また、サンプル準備は他の方法よりも時間がかかるです。一方、次世代シーケンスを組み込む他のプルダウンのアプローチと同様に、作業負荷に追加された重亜硫酸塩の変換および精製手順を追加します。全体的にみて、メチル Seq プラットフォームは、全ゲノム シーケンスにコスト効果の高い代替手段で、マイクロ アレイ ベースのプラットフォームによって試金されるそれらよりもかなり多くである以上 230 万 Cpg で塩基対の解像度を提供します。までに、市販の人間そしてマウス メチル Seq プラットフォームは、サル脳25,26アルコール依存的変化、マウス脳9、および血液脳神経発達学的遺伝子を文書化に使用されています。グルココルチコイド10のターゲット。更に、制限酵素認識シーケンスに関係なく特定の地域をターゲットにする能力はそれクロス種の比較のための理想的なプラットフォームを作る。本研究では、ゲノム methylomic ツールの恩恵なしを多くの薬理、代謝、および行動実験を行い、ラットに対するメチル Seq プラットフォームを設計しました。我々 のデータは、それがストレスのモデルラットに Dmr を検出する使用ことができますと全体的な血中 CORT など他の生理学的パラメーターの相関を見る。
メチル Seq プラットフォームは、規制地域を文書化する十分な実験的証拠がない可能性がありますシーケンスのゲノムを持つ動物のエピジェネティックな実験に最適です。このような領域が利用できる場合、追加の領域をカスタム設計および現在のバージョンに接続されている可能性があります。さらに、プラットフォームは、豊かなターゲットに制限酵素認識によって拘束されていないので、比較ゲノミクスに最適です。たとえば、特定の制限のサイトを抱いてそれかどうかに関係なく興味の任意の遺伝子のプロモーター領域をキャプチャできます。同様に、マウスまたは関心のゲノム内に保存されます人間で識別されたそれらのような規制領域をキャプチャできます。

高スループット シーケンスの進歩は、豊富なモデルと非モデル生物のゲノムにつながっています。このようなシーケンスのアベイラビリティは、遺伝学、比較ゲノミクス、トランスクリプトミクス研究を促進しています。たとえば、利用可能なゲノム シーケンスが豊かにヒストンの修正1、または重亜硫酸塩の配列との関連に基づく DNA チップ Seq 実験からシーケンサーのデータを整列させるため非常に有用なによる DNA メチル化を測定します。非メチル化シトシン2の重亜硫酸塩の変換から形成されるウラシルを検出します。しかし、遺伝子の機能に影響を与えることができます特異の規制シーケンスの注釈付きデータの不足のためのデザインに使用可能なゲノム シーケンス データを組み込むエピゲノムのプラットフォームの実装で遅延があった。
特に、DNA メチル化は methylomic プラットフォームを構築するため利用可能なゲノムのデータを活用して DNA に最も広く研究のエピジェネティックな修飾の 1 つであります。1 つのような例は精神医学4,5腫瘍から様々 な分野で用いられている人間のメチローム3に、アレイ ・ ベースのプラットフォームです。残念なことに、ヒト以外の動物のモデルの類似のプラットフォームが不足している、事実上ない広く使われているプラットフォームを活用しているゲノムのシーケンスの最初の設計があります。
ヒト以外の動物モデルの methylomic 風景を評価する一般的な方法は、縮約表現の重亜硫酸塩の配列 (RRBS)6です。このアプローチは、包括的な methylomic 風景を提供しながらコストと2 ゲノムの大規模な遺伝子貧しい地域で限られた機能情報のため下位の読み取りの深さカバレッジを提供する重亜硫酸塩全ゲノム シーケンスのコストを克服します。.RRBS は制限のダイジェストと一般的遺伝子プロモーター付近、遺伝子調節7に役割を果たすと考え CpG の島など高い GC 豊富なシーケンスの豊かにするゲノム DNA のサイズ選択に含まれます。RRBS 法は重要な研究の数で使用されています、制限酵素への依存はない注目すべき課題と制限なし。例えば、RRBS の GC 豊富なシーケンスの濃縮は電気泳動によって制限酵素とその後のサイズ選択によって認識特定シーケンスの存在に完全に依存。これはサイズの選択中にこれらの制限のサイトが含まれていない任意のゲノム領域を除外することを意味します。また、異種間の比較は、同じ制限のサイトが異なる種の間で同じ遺伝子座で存在しない限りに挑戦しています。
RRBS の限界を克服する方法の 1 つは、プラットフォームの設計、公開されたゲノム シーケンスの活用強化方法を使用することです。アレイ ・ ベースの人間プラットフォームは、対立遺伝子特定 (重亜硫酸塩の変換後 TG 対 CG) ターゲット焼鈍およびプライマー拡張機能の特定の Cpg に対するプライマー プローブを使用します。そのデザインだけでなく利用できる人間のゲノム シーケンス、エンコードと ENSEMBL8など、お問い合わせの複数行から取得した実験的検証規制地域を反映します。その広い使用にもかかわらず人間の methylomic の調査で、モデル動物に類似したプラットフォームが存在しません。さらに、アレイ ・ ベースの形式は、プローブ配置可能な表面積の大きな制約を配置します。過去数年間、キャプチャ プローブ設計と次世代シーケンシングの高スループット機能によって与えられるターゲット特異性を結合する努力をしました。このような努力は、メチル化9,10脳固有または糖質コルチコイド誘発性の違いを識別するために使用されたマウスのゲノム (マウス メチル Seq) のシーケンス ベースのターゲット濃縮システムになりました。他モデルと非モデル動物の類似のプラットフォームは、これらの動物のエピゲノム研究を容易にするために必要です。
ここでは、ラットの methylomic 分析を実施するこの新しいプラットフォームの実装を示す.ラットは薬理学、代謝、神経内分泌学、および動作に重要な動物モデルを務めています。たとえば、薬物毒性、肥満、ストレス応答、または薬物中毒を生じさせる基になるメカニズムを理解がますます必要があります。これらの条件に関連付けられている methylomic の変更をキャプチャできる高速プラットフォームのメカニズムの私達の理解を増加させます。ラットのゲノムはまだ規制地域の注釈を欠いている、以来、私たちは非冗長のプロモーター、CpG の島、島の海岸11を組み込むし、以前ラット メチル Seq プラットフォーム12に GC 豊富なシーケンスを識別しました。
特異的メチル化する慢性変動応力 (CVS)13のラットモデルを用いて、ラットのゲノムの SureSelect ターゲット濃縮 (総称、メチル Seq) プラットフォームの成功の設計と実装を評価するには強勢と強調した動物との間の領域。当社のプラットフォームの設計、プロトコル、および実装は、生物ゲノム シーケンスですでに入手可能ですが、不十分な注釈付きのままの包括的かつ公平なエピジェネティックな調査を実施する必要がある研究者の役に立つかもしれません。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Radioimmuno assay (RIA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>7120126</td>
			<td>Corticosterone, 125I labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Pure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre/Illumina</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1102</td>
			<td>Used with 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td>Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>100% Ethanol, molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be capable of 20000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>High sensitivity DNA detection reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G9651A</td>
			<td>Reagents for preparing the Methyl-Seq library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931143</td>
			<td>RNA baits for enrichment of rat targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE, pH 8.0</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>11-05-01-09</td>
			<td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E-series or S-series</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>-</td>
			<td>Isothermal sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA-Binding magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96S Super Magnet</td>
			<td>ALPAQUA</td>
			<td>A001322</td>
			<td>Magnetic plate for purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td>Electrophresis-based bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA110 SpeedVac</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Vacuum Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Streptavidin magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake Tube Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>415110Q</td>
			<td>Nutator Mixer is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5006</td>
			<td>Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hi-Seq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>-</td>
			<td>Next-generation sequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR and Pyrosequencing Primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Variable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark MD96</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>-</td>
			<td>Pyrosequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>70% Ethanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>0.2 M NaOH denature buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Base) from J.T. Baker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-508</td>
			<td>10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>972807</td>
			<td>Reagents required for pyrosequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Annealing Buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Binding Buffer (200 ml)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td>Streptavidin-coated sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q96 HS Plate</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979101</td>
			<td>Pyrosequencing assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td>Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureDesign Website</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSC Genome Browser</td>
			<td>University of California Santa Cruz</td>
			<td>-</td>
			<td>rat Nov 2004 rn4 assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure

幅広い動物のゲノムが利用可能になると、これらの動物モデルにおけるエピジェネティックな変化を捉えることができますツールのニーズがあります。ラットは、エピジェネティックなツールが洞察力の力学的情報を提供する多くの薬理学的・行動研究を補完することが 1 つの特定のモデル動物であります。このため、ラット、ラット遺伝子 DNA のメチル化レベルを評価するため SureSelect ターゲットをキャプチャ システム (メチル Seq と呼ばれる) を適応しました。ラットの設計では、プロモーター、CpG の島、島の海岸、すべて RefSeq 遺伝子から GC の豊富な地域を対象としました。
ラット実験プラットフォームを実装するには、男性スプレイグ ラットは 3 週間、その後採血したゲノム DNA の抽出の後の慢性的な可変ストレスにさらされました。メチル Seq ライブラリは、剪断、アダプター結紮、ターゲット濃縮、重亜硫酸塩の変換、多重化によりラットの DNA のサンプルから構築されました。次世代シーケンシング プラットフォームのライブラリ結果し、応力負荷及び無負荷ラットの DNA の間 Dmr を識別するためにシーケンスされた読み取りを行った。プラットフォームの堅牢性を確認するための重亜硫酸塩ピロシーケンスによる最有力候補 Dmr が独立して検証。
結果は、ラット メチル Seq プラットフォームがストレスにさらされることによってメチル化変化をキャプチャすることができます便利なエピジェネティックなツールであることを示します。

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A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

ここでは、プロトコルとメチル Seq エピゲノムのプラットフォームでは、慢性的なストレス暴露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットのモデルを使用しての実装について述べる。結果は、ラット メチル Seq プラットフォームのラットにおけるストレス暴露から生じる可能性のメチル化の相違点を検出できることを示します。

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

この方法は、DNAメチル化に対する環境要因の影響を評価するためのシーケンシングベースのツールを設計および実装する方法を示すことによって、エピゲノミクス分野の主要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、アレイベースのプラットフォームと比較して、DNAメチル化レベルを評価するためのより包括的で定量的な方法を提供できることです。この技術の意味合いは、配列データが利用可能な生物の生理学的プロセスの異なるタイプによるDNAメチル化変化の同定にまで及ぶ。この方法は、ストレスがDNAメチル化に及ぼす影響に関する洞察を提供することができますが、高脂肪食や糖尿病や心血管疾患などの条件における環境毒性物質への暴露など、他の環境要因や生理学的条件にも適用できます。DNAを剪断し、生体分析装置を介してサイズを確認した後、各サンプルに180マイクロリットルのDNA結合磁気ビーズを加え、室温で5分間インキュベートします。磁石のプレートにビーズをペレットし、上清を取り除きます。70%エタノールの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。次に、ビーズをペレット化する磁性板を使用し、できるだけ多くのエタノールを除去する。ビーズを37°Cのヒートブロックで3~5分間乾燥させます。次いで、44マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でペレットを再懸濁し、約42マイクロリットルの上清を回収する。アダプターを連結し、バイオアナライザーを介してライゲーションを検証した後、サンプルを低DNA結合マイクロ遠心チューブに移します。次に、加熱真空濃縮器を使用して、サンプルの体積を3.4マイクロリットル以下に減らします。この後、各サンプルにメチルセクブロックミックスの5.6マイクロリットルを加え、サーマルサイクラーにインキュベートします。テキスト プロトコルに従ってキャプチャ ライブラリのハイブリダイゼーション ミックスを準備します。次に、各サンプルに20マイクロリットルのキャプチャライブラリハイブリダイゼーションミックスを加え、摂氏65度で16時間インキュベートします。インキュベーション期間の終わりに向かって、新しい8ウェルストリップチューブにサンプルあたり50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることによってストレプトアビジン磁気ビーズを調製します。200マイクロリットルのメチルセク結合バッファーでビーズを洗浄します。ストリップチューブを磁性プレートに置き、ビーズから上澄み地を取り除きます。その後、メチルセク結合バッファーの 200 マイクロリットルでビーズを再懸濁します。洗浄されたストレプトアビジンビーズにサンプルを加え、回転ミキサーで室温で30分間インキュベートします。サンプルが混合している間、アリコート200マイクロリットルのメチルセクウォッシュバッファ2は、96ウェルプレートの三重の井戸に、摂氏65度に予熱します。サンプルインキュベート後、磁気ビーズを磁気プレートでペレットにし、上清を除去します。その後、メチルセクウォッシュバッファー1の200マイクロリットルにビーズを再懸濁します。ビーズを室温で15分間インキュベートし、磁気プレートを使用して上清を除去します。この後、ビーズペレットを200マイクロリットルの事前に温めたウォッシュバッファー2に再懸濁します。次に、ビーズをペレットにする磁気プレートを使用する前に、サーマルサイクラーにビーズをインキュベートします。洗浄されたビーズにメチルセク溶出バッファーの 20 マイクロリットルを加え、室温で 20 分間インキュベートします。ビーズをペレットにマグネットプレートを使用し、上清を新しいストリップチューブに移します。まず、130マイクロリットルのバイサルファイト変換試薬を、以前に採取した上清に加える。150マイクロリットルの反応を均等に2つの井戸に分けます。次に、サーマルサイクラー中の反応をインキュベートする。600マイクロリットルの結合バッファーを使用してサンプルをスピンカラムに結合し、100マイクロリットルのウォッシュバッファーでカラムを洗浄します。次に、列を遠心分離し、フロースルーを破棄します。この後、200マイクロリットルのデサルフォネーションバッファーをカラムに追加します。カラムを室温で15~20分間インキュベートします。200マイクロリットルのウォッシュバッファーで2回コラムを洗います。次に、10マイクロリットルの溶出バッファーをカラムに加えます。室温でインキュベートし、遠心分離機を使用します。テキストプロトコルに従って PCR 反応マスターミックスを準備します。次に、各サンプルに82マイクロリットルのマスターミックスを加え、サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。まず、テキストプロトコルに従って、氷の上にPCRマスターミックス2を準備します。次に、各サンプルに、25.5マイクロリットルのPCRマスターミックス2と5マイクロリットルの市販インデックスプライマーを加え、サンプルをサーマルサイクラーにインキュベートします。バイオアナライザー上で高感度DNA検出試薬を用いてサンプルのDNA濃度を評価します。次に、メチル・セク・ライブラリーは、次世代シーケンサーのシーケンシングのために提出されます。バイサルファイト変換およびPCR増幅検証サンプルの後、結合バッファー、水、ストレプトアビジンコーティングセファローズビーズとのマスターミックスを調製します。その後、マスターミックス75マイクロリットルと入れ子になったPCR製品の5マイクロリットルを96ウェルプレートに加え、プレートシェーカーでプレートを15~60分間振ります。プレートが揺れる間、ピロシケンシングアッセイプレートの井戸に12マイクロリットルのプライマーを加えます。振盪後、水で満たされたトラフに真空工具を入れ、そのツールを結合反応でプレートに入れます。次に、70%エタノール、水酸化ナトリウム、およびトリス酢酸緩衝液を含む半充填トラフに真空工具を沈下します。真空を取り外し、HSピロシケンシングアッセイプレートに真空工具を入れ、ビーズを移送します。熱ブロックの上にプレートを置き、2分間摂氏80度でインキュベートします。最後に、プレートを5分間冷却してから、パイロプログラムを開始します。このプロトコルでは、メチル-Seqライブラリの分析は、ストレス動物とストレスを受けていない動物とDDRのグラフィカルプロットの間の微分メチル化領域(DDR)のランク付けリストを提供しました。CpG 10のメチル化レベルも、各動物の平均3週間のCORTレベルと比較した。結果は、内分泌とメチル化データの間に適度な相関関係があることを示している。この手順を試みる間、DNAの剪断とアダプターのライゲーションステップ間の平均DNAサイズの増加を比較し、シーケンシング前に十分なライブラリ量を確保することを忘れないでください。この手順に従って、環境毒性物質がラット神経発達に及ぼす影響などの新しい質問に答えるために、他の同様のアプローチを実装することができる。その開発後、この技術はエピジェネティクスの分野の研究者がゲノム配列が利用可能な非モデルまたはモデル生物のゲノム全体のDNAメチル化変化を探求する手段を提供した。温度感受性酵素を使用するには、使用中に氷の上に貯蔵し、マイナス20度の冷凍庫に保管する必要があることを忘れないでください。ターゲットキャプチャに使用されるRNAビーズは、使用中の氷の上で解凍と保存を必要とし、マイナス80度冷凍庫に長期保存する必要があります。

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ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットメチル Seq プラットフォーム