Name: a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure
Uploaded: 2018-10-24T14:45:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

Это исследование финансировалось NIH Грант MH101392 (RSL) и поддержка со стороны следующих награды и фонды: NARSAD молодой следователь премии, Маргарет Энн Цена следователь фонд, Фонд Джеймса Wah настроение расстройств ученый через Фонд Чарльз т. Бауэр, Бейкер Фонд и фонд проекта матч (RSL).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+DNA+methylation+maps+of+pluripotent+and+differentiated+cells.">Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells.</a> Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+DNA+methylation+array+with+single+CpG+site+resolution.">High density DNA methylation array with single CpG site resolution.</a> Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).</li><li>Naumov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+DNA+methylation+in+colorectal+cancer+using+Infinium+HumanMethylation450+BeadChips.">Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips.</a> Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).</li><li>Wockner, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+DNA+methylation+analysis+of+human+brain+tissue+from+schizophrenia+patients.">Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients.</a> Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+representation+bisulfite+sequencing+for+comparative+high-resolution+DNA+methylation+analysis.">Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).</li><li>Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bisulfite+sequencing+in+mammalian+genomes.">High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes.</a> Methods. 48 (3), 226-232 (2009).</li><li>Slieker, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+systematic+annotation+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+using+the+Illumina+450k+array.">Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).</li><li>Hing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+targeted+capture+Methyl-Seq+platform+for+the+mouse+genome+identifies+novel+tissue-specific+DNA+methylation+patterns+of+genes+involved+in+neurodevelopment.">Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment.</a> Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).</li><li>Seifuddin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Methyl-Seq+analysis+of+blood-brain+targets+of+glucocorticoid+exposure.">Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure.</a> Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).</li><li>Irizarry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+colon+cancer+methylome+shows+similar+hypo-+and+hypermethylation+at+conserved+tissue-specific+CpG+island+shores.">The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores.</a> Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+CHARM+DNA+methylation+platform+for+the+rat+genome+reveals+novel+brain+region-specific+differences.">Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences.</a> Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).</li><li>Jankord, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+vulnerability+during+adolescent+development+in+rats.">Stress vulnerability during adolescent development in rats.</a> Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).</li><li>Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+open:closed+arm+entries+in+an+elevated+plus-maze+as+a+measure+of+anxiety+in+the+rat.">Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).</li><li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bismark:+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications.">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BSmooth:+from+whole+genome+bisulfite+sequencing+reads+to+differentially+methylated+regions.">BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions.</a> Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+corticosterone+exposure+increases+expression+and+decreases+deoxyribonucleic+acid+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice.</a> Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).</li><li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+measure+of+glucocorticoid+load+provided+by+DNA+methylation+of+Fkbp5+in+mice.">A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice.</a> Psychopharmacology. , (2011).</li><li>Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+obesity:+the+role+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+axis+in+metabolic+disease.">Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).</li><li>Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets,+coronary+heart+disease,+and+stress.">Platelets, coronary heart disease, and stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).</li><li>McKlveen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Stress+Increases+Prefrontal+Inhibition:+A+Mechanism+for+Stress-Induced+Prefrontal+Dysfunction.">Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction.</a> Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).</li><li>Akalin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=methylKit:+a+comprehensive+R+package+for+the+analysis+of+genome-wide+DNA+methylation+profiles.">methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles.</a> Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-dose-dependent+DNA+methylation+and+expression+in+the+nucleus+accumbens+identifies+coordinated+regulation+of+synaptic+genes.">Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes.</a> Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).</li><li>Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+nucleus+accumbens+identifies+DNA+methylation+signals+differentiating+low/binge+from+heavy+alcohol+drinking.">Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking.</a> Alcohol. 60, 103-113 (2017).</li></ol>

Рукопись является частью конкурса приз от Agilent Technologies.

В этом исследовании мы разработаны и осуществлены метил-Seq платформы геном крысы. Демонстрируя его полезность с мышиной модели стресса, мы продемонстрировали, что экспериментальные и аналитических трубопровода может обеспечить дифференциально метилированной регионов между двумя группами сравнения.
Для обеспечения успешного осуществления платформы, несколько критических шагов необходимо соблюдать. Во-первых, первоначальный ДНК качество и количество имеет значительное влияние на качество и количество окончательного метил-Seq библиотеки. Мы использовали флуориметр, вместо того чтобы спектрофотометр, для обеспечения отражения количество двуцепочечной ДНК настоящее нашей ДНК измерения. Bioanalyzer был использован для измерения молекулярного размера и количества ДНК после стрижки и после перевязки адаптер. Проверка молекулярного размера «сдвиг» между этими шагами важно подтвердить наличие адаптеров на концах каждого фрагмента ДНК, которая будет проходить адаптер опосредованной ПЦР в последующих шагах. Количество ДНК, оставшиеся в конце шага лигирование адаптер также имеет важное значение, поскольку по крайней мере 100 нг библиотека продукта необходима на этом этапе для обеспечения достаточного количества доступен после целевой обогащения и бисульфит Преобразование шаги. Окончательный расчет высок чувствительности была проведена сконструированный метил-Seq библиотеки так, что библиотека может быть разбавлен должным образом для последующего кластеризации по sequencer следующего поколения. Наконец бисульфит пиросеквенирования работал как высоко количественных, независимый метод для оценки точности аналитических трубопровода. Окончательной проверки, используя оригинальные образцы и репликации с использованием дополнительных животных являются важнейшие шаги, чтобы обеспечить, что эксперимент может обнаруживать биологически значительные изменения в метилирование ДНК.
Мы также включать ряд руководящих принципов в случае отклонения от протокола или если возникают проблемы. Во-первых это можно потерять слишком много ДНК при конце ремонт, адаптер перевязки или магнитный шарик очистки шагов. Кроме того, начиная количество ДНК может быть небольшим (< 200 нг) из-за наличия ограниченных ткани/ДНК или осуществление различных методов обогащения, например сортировки клеток активированных флуоресцированием. Увеличение числа цикла в течение двух библиотека амплификации шаги могут быть способны компенсировать чрезмерное потерю ДНК или низкий начиная сумма ДНК во всем протокол строительство библиотеки. Однако не более чем еще 2-3 циклов рекомендуется, как чрезмерное шаблон усиления может привести к увеличению числа дубликатов читает время виртуализации. Эти дубликаты исключаются во время шага выравнивания для предотвращения смещения в расчетах процент метилирования. Во-вторых если средний размер ДНК не увеличится более чем 30 bps, убедитесь, что реагенты являются новыми, как T4 ДНК-полимеразы, фрагменты, и/или T4 лигаза могут быть старые. Может быть использован коммерчески доступных замена реагентов.
Кроме того вполне возможно, что предсказал ЗВД может не пройти проверку на пиросеквенирования, где различия метилирование ДНК не существуют или значительно меньше, чем те, которые предсказывали анализа. Плохой проверки кандидата регионов проблема слишком общие для многих генома общесистемного анализа, например когда пиросеквенирования результаты не подтверждают дифференциального метилирования или размер эффекта намного меньше, чем предсказано анализа. BSmooth это один аналитический пакет «сглаживает» уровень метилирования через окно несколько стандартов клинической практики. Для текущего эксперимента BSmooth замешан DMR, чей уровень метилирования были подтверждены бисульфита пиросеквенирования. Однако скорее всего будет расхождения между уровень метилирования предсказано BSmooth и те подтверждены пиросеквенирования. Эти расхождения обусловлены функцию сглаживания, которая оценкам средняя метилирования значения во всех СКП в пределах РРЛ, в том числе последовательных стандартов клинической практики, которая в метилирование ДНК могут отличаться более чем на 50% или СКП, значения которых метилирования были исключены из-за подпороговые читать глубины. R-пакеты, такие как MethylKit24 может использоваться для выявления небольших окон СКП или даже одной СКП, чей уровень метилирования сильно коррелируют с те подтверждены пиросеквенирования. Реализация различных пакетов и тестирования их предсказал регионов или СКП дифференциальной метилирования пиросеквенирования обеспечит надежность данных. Кроме того оригинальные метил-Seq библиотеки можно resequenced и чтения файлов для увеличения глубины чтения. Поскольку определение уровней метилирования полуколичественного и продиктовано на количество прочтений [(# of CpGs) / (# ТПГС + СКП)], увеличивая чтения глубины для данного CpG будет увеличить точность его значения процентов метилирования. В этом исследовании мы рассматривали только СКП метилирования, значения которых были определены по крайней мере десять читает и достичь общего чтения освещение 19 x для каждого CpG.
Метил-Seq платформа крыса — не без его ограничения. Хотя это более экономически эффективным, чем последовательность всего генома бисульфита, это значительно дороже, чем другие методы. Тем не менее большая часть стоимости был для покупки полос на программы sequencer, а не для захвата системы. В зависимости от чтения глубины, необходимых, с кросс ткани сравнения, требующие меньше из-за большой (25-70%) различия12 в метилирование ДНК стоимость может быть уменьшена мультиплексирования более выборок на полосу и с использованием платформы большей емкости. Кроме того Подготовка образца является более длительным, чем другие методы. Похож на другие пулдаун подходы, которые включают секвенирование нового поколения, добавлен бисульфита преобразования и очистки шагов добавить рабочую нагрузку. В целом метил-Seq платформа является экономически эффективные альтернативы всего генома и обеспечивает разрешение базы пара на более 2,3 миллионов СКП, который значительно больше, чем те Анализ microarray дна-платформ. На сегодняшний день, коммерчески доступных человека и мыши метил-Seq платформ были использованы для документирования алкогольной зависимостью изменений в макаки мозга25,26, психомоторного развития генов в мыши мозга9и кровоснабжение мозга цели глюкокортикоидов10. Кроме того способность целевым конкретных регионов, независимо от последовательности признание энзимов ограничения делает его идеальной платформой для кросс видов сравнений. Для этого исследования мы разработали платформу метил-Seq для крыс, для которого многих фармакологических, метаболизм и поведенческих эксперименты выполняются без использования инструмента генома всей methylomic. Наши данные показывают, что он может использоваться для обнаружения ЗВД в мышиной модели стресса и коррелируют других физиологических параметров, таких как общий плазменный CORT уровнях.
Метил-Seq платформа идеально подходит для эпигенетических экспериментов в животных с последовательности геномов, которые не могут иметь достаточно экспериментальных доказательств, документирование регулирования регионов. Когда такие регионы доступны, дополнительные регионы могут специально и прилагается к текущей версии. Кроме того платформа идеально подходит для сравнительной геномики, поскольку цели обогащения не ограничивается энзима ограничения распознавания. Например промоутер региона любой ген может быть захвачен независимо от ли он укрывает сайта конкретного ограничения. Аналогично любые нормативные регионах, таких как те, которые определены в мыши или людей, которые сохраняются в геноме интерес может быть захвачен.

Достижения в высокопроизводительного секвенирования привели к богатству genomic последовательностей для модели и номера модели организмов. Наличие таких последовательностей способствовала исследованиям в области генетики, сравнительной геномики и transcriptomics. К примеру, доступные genomic последовательностей являются весьма полезными для выравнивания последовательности данных от чип-Seq экспериментов, которые обогащают ДНК, на основе своей ассоциации с гистонов модификации1, или гидросульфит последовательности, которая измеряет метилирования дна путем Обнаружение урацила формируется из преобразование бисульфита unmethylated cytosines2. Однако имели место задержки в осуществлении epigenomic платформ, которые включают имеющиеся геномные последовательности данных в их конструкции из-за отсутствия аннотированный данных вегетационных регулирования последовательностей, которые могут влиять на функции гена.
В частности метилирование ДНК является одним из наиболее широко изучены эпигеномные изменения на ДНК, которая может использовать имеющиеся геномных данных для создания methylomic платформы. Одним из таких примеров является платформой на основе массива для человека methylome3, которая широко используется в различных дисциплинах по психиатрии4,5от онкологии. К сожалению подобные платформы для не человеком животных моделей являются скудными, как есть практически не широко используемых платформ, которые воспользовались геномные последовательности в их первоначальный дизайн.
Общий метод для оценки methylomic пейзаж не человеком животных моделей — уменьшенная бисульфита виртуализации (RRBS)6. Этот подход преодолевает Стоимость секвенирования бисульфита всего генома, что, обеспечивая всеобъемлющую methylomic пейзаж, обеспечивает чтение глубина охвата ниже из-за стоимости и ограниченной функциональной информации в крупных ген бедных районах генома2 . RRBS предполагает ограничение дайджест и выбор размера геномной ДНК для обогащения для высоко GC-богатых последовательностей как острова CpG, которые обычно вблизи генным стимуляторам и думал играть определенную роль в ген регулирование7. В то время как в ряде важных исследований был использован метод RRBS, ее опора на энзимов ограничения — не без известные проблемы и ограничения. К примеру обогащение GC-богатых последовательностей в RRBS полностью зависит от наличия специфических последовательностей, признанные энзима ограничения и последующая размер выбор электрофорезом. Это означает, что любой геномной районы, которые не содержат эти места ограничения исключаются во время выбора размера. Кроме того кросс видов сравнения являются сложными, если же места ограничения нет в же локусов среди различных видов.
Один из подходов к преодолению ограничений RRBS заключается в использовании метод обогащения, который использует опубликованные геномные последовательности в разработке платформы. На основе массива человека платформа использует грунтовка зонды, направленных против конкретных СКП для Аллел Специфически (CG против TG после преобразования бисульфит) целевой отжига и грунтовка расширения. Его дизайн отражает не только доступные человека геномные последовательности, но и экспериментально проверены регулирования регионов приобретены из нескольких строк запроса, таких как кодирование и ENSEMBL8. Несмотря на его широкое применение в человека methylomic исследования подобные платформы для модели животных не существует. Кроме того формат на основе массива места значительные ограничения на площадь поверхности для размещения зонд. В последние несколько лет были предприняты усилия, чтобы объединить цели специфика обеспечиваемой захвата зонд дизайн и высок объём особенность секвенирование нового поколения. Такие усилия привела к системе обогащения на основе последовательности целевого объекта для генома мыши (мыши метил-Seq), которая была использована для выявления мозга конкретные или глюкокортикоидов индуцированной различия в метилирования9,10. Подобных платформ для других моделей и животных-модели необходимы для облегчения epigenomic исследований в этих животных.
Здесь мы демонстрируем осуществления этот роман платформы для проведения methylomic анализа на крысу. Крыса служил важным животной модели в фармакологии, метаболизм, Нейроэндокринологии и поведение. Например существует возрастает необходимость понимания основных механизмов, которые приводят к токсичности препарата, ожирение, стресс ответ или наркомании. Высок объём платформы, способной захвата methylomic изменения, связанные с этими условиями будет увеличить наше понимание механизмов. Поскольку геном крысы по-прежнему не хватает Аннотация для регулирования регионов, мы включены нерезервном промоутеров, острова CpG, Остров Шорс11и ранее определены ГК богатыми последовательности в крыса метил-Seq платформа12.
Чтобы оценить успешной разработки и осуществления SureSelect цели обогащения (обобщенно называют метил-Seq) платформы для геном крысы, мы использовали крыс модель13 переменных хронического стресса (CVS) для выявления дифференциально метилированной регионах между безударных и подчеркнул животных. Наш дизайн платформы, протокол и осуществления могут быть полезны для следователей, которые хотят провести всеобъемлющее и объективное эпигеномные расследование на организм которых геномные последовательности уже доступна, но по-прежнему плохо аннотированный.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Radioimmuno assay (RIA)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>7120126</td>
			<td>Corticosterone, 125I labeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Pure DNA Purification Kit</td>
			<td>Epicentre/Illumina</td>
			<td>MC85200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2510-1102</td>
			<td>Used with 1.5 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-812</td>
			<td>Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>100% Ethanol, molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>Must be capable of 20000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>High sensitivity DNA detection reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G9651A</td>
			<td>Reagents for preparing the Methyl-Seq library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>931143</td>
			<td>RNA baits for enrichment of rat targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE, pH 8.0</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>11-05-01-09</td>
			<td>10 mM TE, 0.1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E-series or S-series</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>-</td>
			<td>Isothermal sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-029-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 Well-Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>DNA-Binding magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96S Super Magnet</td>
			<td>ALPAQUA</td>
			<td>A001322</td>
			<td>Magnetic plate for purification steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2200 TapeStation</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td>Electrophresis-based bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents High Sensitivity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA110 SpeedVac</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Vacuum Concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Streptavidin magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labquake Tube Rotator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>415110Q</td>
			<td>Nutator Mixer is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5006</td>
			<td>Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hi-Seq 2500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>-</td>
			<td>Next-generation sequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR and Pyrosequencing Primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td>Variable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0267L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyromark MD96</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>-</td>
			<td>Pyrosequencing machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>70% Ethanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>0.2 M NaOH denature buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Base) from J.T. Baker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-004-508</td>
			<td>10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>972807</td>
			<td>Reagents required for pyrosequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Annealing Buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Binding Buffer (200 ml)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5113-01</td>
			<td>Streptavidin-coated sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark Q96 HS Plate</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>979101</td>
			<td>Pyrosequencing assay plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td>Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureDesign Website</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSC Genome Browser</td>
			<td>University of California Santa Cruz</td>
			<td>-</td>
			<td>rat Nov 2004 rn4 assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Methyl-Seq Protocol</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rat methyl-seq platform to identify epigenetic changes associated with stress exposure

Как геномов более широкий спектр животных становятся доступными, существует растущая потребность для инструментов, которые могут захватить динамические эпигеномные изменения в этих моделях животных. Крыса является одной конкретной модели животных, где эпигеномные инструмент может дополнять многих фармакологических и поведенческих исследований обеспечить глубокий механистический информации. С этой целью мы адаптировали SureSelect целевой захвата системы (упоминаемый как метил-Seq) для крысы, которые могут оценить уровень метилирования ДНК через геном крысы. Крыса дизайн ориентированных промоутеров, острова CpG, Остров Шорс и GC-богатые регионы от всех RefSeq генов.
Для осуществления платформы на эксперимент крыса, крысах Sprague-Dawley были подвержены хронический стресс переменной за 3 недели, после чего были собраны образцы крови для экстракции геномной ДНК. Метил-Seq библиотеки были построены из образцов ДНК крыса стрижка, адаптер перевязки, цели обогащения, преобразование бисульфита и мультиплексирования. Библиотеки были виртуализировать на платформе виртуализации нового поколения и последовательного читает были проанализированы для определения ЗВД между ДНК безударных и подчеркнул крыс. Топ кандидата ЗВД были независимо проверены бисульфита пиросеквенирования для подтверждения надежности платформы.
Результаты показывают, что крыса метил-Seq платформа является полезным эпигеномные инструментом, который может захватить метилирования изменений, вызванных воздействием подчеркнуть.

Watch this Scientific Journal Video about A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure at JoVE.com

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Здесь мы описываем протокола и осуществления метил-Seq, epigenomic платформы, с помощью мышиной модели для идентификации эпигеномные изменения, связанные с воздействием хронического стресса. Результаты показывают, что метил-Seq платформа крыса способен обнаруживать метилирования различия, которые возникают от воздействия стресса у крыс.

Крыса метил Seq платформа для выявления эпигеномные изменения, связанные с воздействием стресса

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигеномики, демонстрируя, как разработать и внедрить инструмент на основе секвенирования для оценки влияния экологических факторов на метилирование ДНК. Основным преимуществом этого метода является то, что он может обеспечить более всеобъемлющий и количественный метод оценки уровней метилирования ДНК по сравнению с платформами на основе массива. Последствия этого метода распространяются на выявление изменений метилирования ДНК из-за различных типов физиологических процессов в любом организме, чьи данные последовательности доступны.Хотя этот метод может дать представление о влиянии стресса на метилирование ДНК, он также может быть применен к другим факторам окружающей среды или физиологических условий, таких как воздействие экологических токсикантов в диете с высоким содержанием жира и условиях, таких как диабет и сердечно-сосудистые заболевания. После стрижки ДНК и проверки размера с помощью биоанализера, добавьте 180 микролитров ДНК-связывающих магнитных бусин к каждому образцу и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Пеллет бисер на магнитной пластине, и удалить супернатант.Повторное потребление гранул в 200 микролитров 70% этанола. Затем используйте магнитную пластину, чтобы гранулы бисера, и удалить как можно больше этанола, как это возможно. Высушите бисер в тепловом блоке при температуре 37 градусов по Цельсию в течение трех-пяти минут.Затем, повторное течение гранулы в 44 микролитров нуклеазы свободной воды, и собрать около 42 микролитров супернатанта. После перевязки адаптеров и проверки перевязки с помощью биоанализа, перенесите образцы в низкоуглеродные микроцентрифугные трубки. Затем используйте концентратор с подогревом вакуума, чтобы уменьшить объем выборки ниже 3,4 микролитров.После этого добавьте в каждый образец 5,6 микролитров метил-сек блока Mix и инкубировать их в тепловой циклер. Подготовьтесь к гибридизации библиотеки захвата в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте 20 микролитров capture Library Hybridization Mix к каждому образцу и инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 16 часов.Ближе к концу инкубационого периода подготовьте стрептавидин магнитные бусы, добавив 50 микролитров стрептавидина магнитных бусин на образец в новую восьми-хорошо полоса трубки. Вымойте бисер с 200 микролитров метил-Seq Связывание буфера. Поместите трубку полосы на магнитную пластину, и удалить супернатант из бисера.Затем, повторного использования бисера в 200 микролитров метил-Seq Связывание буфера. Добавьте образцы в промытые бусины стрептавидина и инкубировать их при комнатной температуре в течение 30 минут на вращающемся миксере. В то время как образцы смешиваются, aliquot 200 микролитров метил-Seq Wash Buffer Two в тройной скважины 96-хорошо пластины и предварительно теплой до 65 градусов по Цельсию.После инкубации образцов гранулируют магнитные бусины магнитной пластиной и удаляют супернатант. Затем, resuspend шарики в 200 микролитров метил-Seq Мыть Buffer One. Инкубировать бисер в течение 15 минут при комнатной температуре, и использовать магнитную пластину, чтобы удалить супернатант.После этого, resuspend шарик гранулы в 200 микролитров предварительно разогретой мыть буфера два. Затем инкубировать бисер в тепловой циклер, прежде чем использовать магнитную пластину для гранулы бисера. Добавьте 20 микролитров метил-сек Elution Buffer в вымытые бусины и инкубировать их при комнатной температуре в течение 20 минут.Используйте магнитную пластину, чтобы гранулы бисера, и передать supernatant в новую трубку полосы. Во-первых, добавьте 130 микролитров реагента преобразования бисульфита в ранее собранный супернатант. Разделите 150-микролитровые реакции поровну на две скважины.Затем инкубировать реакции в тепловой циклер. Используйте 600 микролитров Binding Buffer, чтобы связать образцы с спин-столбцами и промыть столбцы 100 микролитров Wash Buffer. Затем центрифуга колонны, и отказаться от потока через.После этого добавьте в столбцы 200 микролитров буфера desulphonation. Инкубировать колонны в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Вымойте колонны дважды с 200 микролитров Wash Buffer.Затем добавьте в столбец 10 микролитров Elution Buffer. Инкубировать при комнатной температуре и центрифуге. Подготовь мастер-микс реакции ПЦР в соответствии с текстовым протоколом.Затем добавьте 82 микролитров мастер-микста к каждому образцу и инкубировать образцы в тепловой циклер. Во-первых, подготовить PCR Master Mix Two на льду в соответствии с текстовым протоколом. Затем к каждому образцу добавьте 25,5 микролитров ПЦР Master Mix Two и пять микролитров коммерческих индексных грунтовок и инкубировать образцы в тепловой циклер.Оцените концентрацию ДНК образцов с высокочувствительностью реагентов обнаружения ДНК на биоанализе. Библиотеки Methyl-Seq затем представлены для секвенирования на секвенсоре следующего поколения. После преобразования бисульфита и усиления ПЦР образцов проверки, подготовить мастер смесь с связыванием буфера, воды и стрептавидина покрытием сефхарозы.Затем добавьте 75 микролитров мастер-микста и пять микролитров вложенного продукта ПЦР в пластину 96-колодец и встряхните тарелку на шейкере тарелки в течение 15-60 минут. В то время как пластина трясется, добавьте 12 микролитров грунтовки в колодцы пирозеккунтной анализной пластины. После встряхивания поместите вакуумный инструмент в корыто, наполненное водой, затем поместите инструмент в тарелку с связывающими реакциями.Затем погрузите вакуумный инструмент в полуполные желоба, содержащие 70% этанола, гидроксида натрия и буфера Трис-ацетата. Отключите вакуум, и поместите вакуумный инструмент в HS pyrosequencing анализ пластины для передачи бисера. Поместите тарелку на тепловой блок и инкубировать при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух минут.Наконец, дайте пластине остыть в течение пяти минут до начала программы пиро. В этом протоколе, анализ библиотек Methyl-Seq обеспечил выстроенный в ряд список дифференциально метилированных зон, или DMRs, между подчеркнутыми и unstressed животными и графическим графиком DMRs. Проверка через bisulfite pyrosequencing показала что подчеркнутые животные все exhibited более высокие уровни метилирования через все CpGs чем unstressed животные.Уровни метилирования в CpG 10 также были сопоставлены со средними трехнедельных уровнями КОРТ для каждого животного. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует скромная корреляция между данными эндокринной системы и метилирования. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сравнить увеличение среднего размера ДНК между ДНК стрижки и адаптер перевязки шаги и обеспечить достаточное количество библиотеки до секвенирования.Следуя этой процедуре, другие аналогичные подходы могут быть реализованы для того, чтобы ответить на новые вопросы, такие как воздействие экологических токсикантов на крысиную нейроразвитие. После своего развития, этот метод предоставил средства для исследователей в области эпигенетики для изучения генома всей изменения метилирования ДНК в любой не-модели или модели организмов, где геномные последовательности доступны. Не забывайте, что работа с чувствительными к температуре ферментами требует хранения на льду во время использования и хранения в морозильной камере минус 20 градусов.РНК-бусины, используемые для улавливания цели, требуют оттаивания и хранения на льду при использовании и длительного хранения в морозильной камере минус 80 градусов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Изоляция гистона от ткани листьев сорго для Top Down Масс Спектрометрия Профилирование потенциальных эпигенетических маркеров

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Платформа инкубатора с Movable XY этап: Новая платформа для реализации в ячейке быстрой фотохимической окисления белков

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: быстрый, непредвзятый флуоресцентный метод обнаружения изменений плотности синапсов

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

Масс-спектрометрический подход к идентификации фосфопротеинфосфатаз и их интеракторов

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

A Fibrinolytic Enzyme-Based Method to Study Cerebral Thrombus Cell Components

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots (Video) | JoVE

Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

Image Analysis to Identify Protein Crystals

Image Analysis to Identify Protein Crystals (Video) | JoVE 

Анализ изображений для идентификации белковых кристаллов