Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01 GM104010. Merci pour l'aide à la microscopie de fluorescence à Vytas Bindokas et Christine Labno à l'installation de base de microscopie intégrée, qui est soutenu par le Nih-financé Cancer Center Support Grant P30 CA014599.

1. Préparation
<ol><li>Faire non fluorescent minimal NSD moyen2. L'absence de riboflavine devrait réduire la fluorescence verte intracellulaire de fond et la phototoxicité associée.</li>
	<li>Cultivez la souche de levure pendant la nuit à 23 oC jusqu'à la phase logarithmique en 5 mL de NSD dans un flacon déconcerté de 50 ml avec une bonne aération. Environ 3-4 h avant l'analyse, diluer la culture de levure dans NSD frais de sorte que l'OD600 final sera 0.5-0.8 au moment de l'imagerie.</li...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

La formation image confocale 4D des organites de levure exige l'adage soigneux des paramètres multiples. La principale préoccupation est le blanchiment et la phototoxicité. Un film 4D typique consiste à collecter des milliers de sections optiques, de sorte que l'éclairage laser doit être maintenu aussi bas que possible. Les étiquettes de protéines fluorescentes Tandem peuvent être utilisées pour stimuler le signal sans augmenter l'expression de la protéine étiquetée16,<sup ...

Les compartiments du système endomembrane sont en constante évolution, et leur caractérisation complète nécessite une imagerie cellulaire vivante. Décrit ici est un protocole qui emploie la microscopie confocale 4D (time-lapse 3D) pour visualiser les compartiments fluorescents étiquetés dans les levures en herbe. La méthode a été développée pour suivre la dynamique des compartiments sécréteurs dans Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Ce protocole se concentre sur S. cerevisiae, qui a un Golgi non empilé dans lequel les cisternae individuelles sont optiquement résolvables4. L'organisation inhabituelle de Golgi dans S. cerevisiae a permis la démonstration par microscopie 4D qu'une cisterna de Golgi étiquette d'abord avec les protéines tôt résidentes de Golgi, et perd alors ces protéines tout en acquérant les protéines golgi tardives résidantes3 ,5. Cette transition peut être visualisée en créant une souche dans laquelle la protéine Golgi Vrg4 est étiquetée avec gFP tandis que la protéine Golgi tardive Sec7 est étiquetée avec une protéine fluorescente rouge monomeric. Lorsque les cisternae individuelles sont suivies, la maturation est observée comme une conversion vert-rouge3. Ce type d'analyse peut fournir des informations précieuses sur la localisation des protéines et l'identité du compartiment. Par exemple, deux protéines avec des heures d'arrivée et de départ légèrement décalées peuvent parfois sembler étiqueter différents compartiments dans des images statiques, mais peuvent être vues dans des films 4D pour étiqueter le même compartiment à différents points de temps6,7 . Ainsi, la microscopie 4D révèle des phénomènes qui ne seraient pas évidents autrement.
La microscopie 4D informative des compartiments à levures peut être réalisée avec des procédures et un équipement appropriés2. Dans la mesure du possible, le marquage des protéines fluorescentes est effectué par remplacement génétique8 pour éviter les artefacts surexpression. Parce que les structures intracellulaires sont souvent très dynamiques, la formation image 4D est nécessaire pour s'assurer qu'une structure est suivie de façon fiable au fil du temps. Le protocole décrit ici utilise un microscope confocal à balayage laser équipé de détecteurs de haute sensibilité. Avec cet appareil, le volume cellulaire entier de S. cerevisiae peut être imagepar microscopie confocale approximativement tous les 1-3 s, avec 2 intervalles de s étant typiques. Les données peuvent être recueillies jusqu'à 5-15 min en fonction des densités d'étiquetage des fluorophores et de leurs propriétés photophysiques. Le principal obstacle est de minimiser le photoblanchiment. À cette fin, les intensités laser sont maintenues aussi bas que possible, la vitesse de balayage confocal e est maximisée, et les paramètres optiques sont configurés pour l'image à la limite Nyquist afin de capturer les informations pertinentes tout en évitant l'exposition excessive à la lumière. Ces paramètres sont également censés soulager la phototoxicité, un facteur qui est souvent négligé lors de l'imagerie cellulaire en direct9,10,11. Les données bruyantes qui en résultent sont traitées avec des algorithmes de correction de l'eau de Javel et de déconvolution pour faciliter la quantification des intensités de fluorescence.
Même avec des films 4D de haute qualité, l'analyse est délicate parce que les compartiments à levures ont tendance à être nombreux, hétérogènes et mobiles. En raison des limites intrinsèques de la microscopie confocale et des réglages non optimaux requis pour une imagerie 4D prolongée, les structures fluorescentes qui sont proches les unes des autres sont difficiles à résoudre. Ce problème peut être contourné en se concentrant sur le petit nombre de structures fluorescentes qui restent optiquement résolvables pendant toute la durée de la période d'étiquetage, en supposant que ces structures sont représentatives de l'ensemble de la population d'étiquettes Compartiments. Les compartiments fluorescents qui peuvent être suivis de façon fiable sont identifiés en visionnant des films de piles Z projetées et en créant une série de montages dans lesquels les sections optiques pour chaque point de temps sont disposées sur un écran d'ordinateur. Cette analyse utilise des plugins ImageJ12 personnalisés, qui permettent de suivre une structure individuelle de manière isolée.
Des méthodes récentes ont couvert l'utilisation de protéines fluorescentes dans la levure13 ainsi que la théorie et la pratique de l'imagerie confocale 4D des cellules de levure2. Ce protocole se concentre sur les principaux aspects pratiques d'une expérience d'imagerie 4D. Il comprend quelques améliorations aux procédures précédemment décrites, ainsi que des versions mises à jour du code plugin ImageJ et de la documentation. L'exemple montré se concentre sur la dynamique Golgi, mais ce protocole est tout aussi approprié pour l'imagerie d'autres compartiments à levures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

L'objectif de ce protocole est de caractériser la façon dont les compartiments membranaires se forment et se transforment en cellules vivantes de levure en herbe. Beaucoup de compartiments intracellulaires dans la levure sont dynamiques, et une compréhension complète de leurs propriétés exige l'imagerie de time-lapse. La microscopie multicolore de fluorescence confocale 4D est une méthode puissante pour suivre le comportement et la composition d'un compartiment intracellulaire sur une échelle de temps de 5-15 min. L'analyse rigoureuse de la dynamique des compartiments nécessite la capture de milliers d'optiques Sections. Pour atteindre cet objectif, le blanchiment photo et la phototoxicité sont réduits au minimum en scannant rapidement à très faible puissance laser, et les dimensions de pixel et les intervalles Z-step sont réglés aux plus grandes valeurs qui sont compatibles avec l'échantillonnage de l'image à pleine résolution. Les ensembles de données 4D qui en résultent sont bruyants mais peuvent être lissés par la déconvolution. Même avec des données de haute qualité, la phase d'analyse est difficile parce que les structures intracellulaires sont souvent nombreuses, hétérogènes et mobiles. Pour répondre à ce besoin, des plugins ImageJ personnalisés ont été écrits pour mettre en réseau des données 4D sur un écran d'ordinateur, identifier les structures d'intérêt, modifier les données pour isoler les structures individuelles, quantifier les cours de temps de fluorescence et faire des films des piles Z projetées. Les films 4D sont particulièrement utiles pour distinguer les compartiments stables des compartiments transitoires qui se retournent par maturation. De tels films peuvent également être utilisés pour caractériser des événements tels que la fusion de compartiments, et pour tester les effets de mutations spécifiques ou d'autres perturbations.

L'exemple donné ici documente et quantifie la maturation de deux levures Golgi cisternae telles que visualisées par microscopie confocale 4D double couleur3. Une cellule de levure contient sur l'ordre de 10-15 Golgi cisternae, dont chacun mûrit sur un cours de temps d'environ 2-4 min. Maturation peut être visualisé en taguant le marqueur Golgi tôt Vrg4 avec GFP et en taguant le marqueur Golgi tardif Sec7 avec un fluorescent rouge comme mCherry ou mScarlet. Un...

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4D Microscopy of Yeast

Microscopie 4D de levure

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Cette méthode suit les structures des cellules de levure en trois dimensions pendant de nombreuses minutes, ce qui nous permet d’étudier la dynamique des organites et compartiments intracellulaires. L’imagerie 4D nous permet de tirer des conclusions fiables sur la dynamique intracellulaire, en particulier pour les structures ou les marqueurs qui peuvent être transitoires. La démonstration de la procédure sera Natalie Johnson, un postdoc de mon laboratoire.Commencez par cultiver une culture nocturne de la souche de levure d’intérêt dans cinq millilitres de synthétique non fluorescent défini, ou NSD, moyen, dans un flacon déconcerté de 15 millilitres avec une bonne aération, à 23 degrés Celsius. Trois à quatre heures avant l’analyse, diluer la culture de levure de phase logarithmique dans le milieu NSD frais, de sorte que la densité optique finale à 600 nanomètres, ou OD600, sera de 0,5 à 0,8 au moment de l’imagerie. Au moins une heure avant que la culture soit prête, centrifugez un aliquot d’un concanavalin de deux millilitres par millilitre Une solution pendant cinq minutes à pleine vitesse, pour granuler tous les particules, et ajouter 250 microlitres du supernatant dans un plat propre de microscopie de fond de verre de 35 millimètres.Après 15 minutes, laver le plat deux à trois fois avec deux millilitres d’eau distillée par lavage, en ajoutant 250 microlitres de la culture de levure au plat enduit de Concanavalin après qu’il soit séché. Attendez 10 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer, avant de laver doucement le plat deux à trois fois de plus avec deux millilitres de milieu NSD frais. Couvrez ensuite les cellules de deux millilitres de NSD frais.Pour imager les cellules de levure, sélectionnez une lentille d’immersion d’huile 63X avec une ouverture numérique d’au moins 1,4 sur un microscope à lumière confoccale. Ici, un objectif 100X peut également être utilisé au lieu d’un objectif 63X. Ensuite, placez le plat sur la lentille objective, repéré avec de l’huile d’immersion.Dans le menu dropdown de l’onglet Mode Acquisition, sélectionnez xyzt. Sous l’onglet XY, formater la taille du cadre à 256 largeur par 128 hauteur. Utilisez la vitesse maximale de balayage, qui est généralement de l’ordre de huit kilohertz.Activez la numérisation bidirectionnelle X si elle est disponible, et ajustez le facteur de zoom à neuf, ce qui se traduira par une taille de pixel d’environ 80 nanomètres. Si un objectif 100X est utilisé, ajustez le facteur de zoom en conséquence pour maintenir une taille de pixel d’environ 80 nanomètres. Réglez ensuite l’accumulation de ligne à quatre ou six.Réglez le sténopé à 1,2 unités Airy, et allumez le laser de lumière blanche, si disponible. Réglez ensuite la longueur d’onde d’excitation et la puissance laser en pourcentage pour chaque canal de fluorescence. Si disponible, activer l’utilisation du mode de comptage des photons sous l’onglet configuration en désélectionnant le temps d’intégration maximum.Pour chaque canal de fluorescence, assignez un détecteur de haute sensibilité, réglez la plage de longueur d’onde des émissions et activez le mode de comptage des photons, s’il est disponible. Réglez la fenêtre de gouttillon de temps à 0,6 à 10 nanosecondes pour chaque canal de fluorescence, pour éviter de capturer la lumière réfléchie du plat en verre. Ensuite, activez l’imagerie par champ lumineux et sélectionnez un détecteur de faible sensibilité pour la collecte de données.Activez le mode d’imagerie en direct et activez le gain dans le canal de champ lumineux jusqu’à ce que les cellules soient clairement visibles. Si vous êtes en mode comptage photon, modifiez la plage de valeurs grises du manuel à l’automatique pour afficher le signal fluorescent. Réglez la pile Z pour l’image de l’ensemble du volume des cellules de levure et spécifiez la directionnalité de l’imagerie de telle sorte que vers le bas se déplace vers le glissement de couverture.Réglez l’intervalle z-step à 0,25 à 0,35 micromètres pour obtenir environ 20 à 25 sections optiques par pile Z, et allumez le flux Galvo s’il est disponible. Pour un film typique, réglez l’intervalle de temps entre z-stacks à deux secondes, et réglez la durée du film à cinq à 10 minutes. Ensuite, enregistrez le film sous forme de fichier LIF.Pour la déconvolution des films, lancez un logiciel de déconvolution approprié qui utilise l’algorithme classique d’estimation maximale de probabilité et ouvrez la série de données. Sélectionnez l’assistant de déconvolution et l’éditeur de paramètres pour confirmer que les paramètres d’imagerie sont détectés et correctement affichés. Modifiez la valeur de l’indice réfractif moyen d’intégration à 1,4 pour rapprocher le cytoplasme de levure.Utilisez ensuite l’éditeur pour estimer la position du bordereau de couverture. Sélectionnez Définir tous vérifiés et cliquez sur Accepter, et sélectionnez Saisir l’assistant. Cliquez sur la flèche suivante pour contourner la sélection des fonctions de propagation de point et les étapes de pré-traitement de recadrage, et passez par l’assistant de déconvolution pour chaque canal de fluorescence.Sélectionnez la fonction de cartographie verticale logarithmique de calcul et inspectez le profil d’intensité de fluorescence des données brutes. Définissez le manuel comme mode pour l’estimation d’arrière-plan, entrez une valeur d’arrière-plan et cliquez sur Accepter. Laissez la valeur maximale des itérations à 40 et entrez un rapport signal/bruit estimé.Ensuite, éteignez la correction d’eau de Javel, et cliquez sur Deconvolve. Sélectionnez Accepter le canal suivant dans la fenêtre de résultat de déconvolution, si le bruit est suffisamment enlevé sans éliminer la fluorescence authentique des structures sombres. Une fois que tous les canaux fluorescents ont été déconstructurés de manière satisfaisante, cliquez sur Tout fait et arrangez d’abord le canal rouge, suivi des canaux verts, bleus et lumineux, pour un montage ultérieur dans ImageJ.Enregistrez ensuite la séquence d’image sous forme de fichier TIF de huit bits et sélectionnez un fichier par canal et un étirement de contraste comme mode de conversion. Pour la correction de l’eau de Javel, importez les séquences d’images déconcentrales en ImageJ et cliquez sur Image, Hyperstacks et Stack en Hyperstack pour convertir les images en hyperstack. Sélectionnez xyzct dans le menu dropdown et entrez le nombre de canaux, de tranches Z-stack et de délais.Pour corriger les canaux de fluorescence pour le blanchiment photo, sélectionnez Image, Couleur, Canaux fractionnants, et pour les canaux fluorescents, sélectionnez Plugins, EMBLtools, Bleach Correction et Exponential Fit. Sélectionnez ensuite les canaux image, couleur et fusion pour fusionner le champ lumineux et les canaux de fluorescence corrigés à l’eau de Javel en hyperstack, et enregistrer l’hyperstack corrigé déconcentré et blanchi pour la génération et le montage de films suivants sous forme de fichier TIF de huit bits. Pour convertir l’ensemble de données corrigées déconcentrales et blanchies en montage à l’échelle, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Make Montage Series, et sélectionnez l’hyperstack de huit bits pertinent.Cliquez sur Ouvrir et OK pour accepter que toutes les tranches seront utilisées pour créer le montage, et cliquez à nouveau sur OK pour accepter la valeur suggérée du facteur d’échelle. Enregistrez le montage original sous forme de fichier TIF de huit bits et sélectionnez Plugins, IJ_Plugins, Montage Series à Hyperstack et OK, pour créer une hyperstack 4D à partir du montage original qui inclut tous les délais. Pour générer le film projeté moyen d’origine, sélectionnez d’abord Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack et OK, pour accepter les paramètres par défaut ZProjection.Enregistrez le film projeté en moyenne sous la forme d’un fichier TIF de huit bits et inspectez le film pour identifier les structures individuelles qui peuvent être suivies pendant toute la durée de leur période d’étiquetage. L’identification d’une structure qui peut être suivie de manière fiable pendant toute la durée du film, et l’isolement de cette structure pour analyse, sont les étapes les plus critiques de la procédure. Suivez ensuite les instructions dans le guide utilisateur plugin, pour isoler les structures d’intérêt en éditant le montage.Créez une hyperstack 4D à partir du montage édité pour la période, y compris les structures d’intérêt, et enregistrez l’hyperstack édité. Pour quantifier l’intensité de fluorescence au fil du temps pour la structure isolée de l’hyperstack 4D édité, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Analysez le film édité, entrez l’intervalle de temps entre les piles Z et cliquez sur OK. Pour créer un film final de la structure isolée, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Project Hyperstack, spécifiez les tranches Z-stack qui doivent être incluses, sélectionnez Intensité moyenne comme type de projection et cliquez sur OK. Pour créer une hyperstack 4D avec les données d’origine sur les données modifiées, sélectionnez plugins, IJ_Plugins, Fusionnez deux hyperstacks et placez-les d’abord au-dessus de la deuxième place. Pour générer un film à partir de l’hyperstack 4D avec les données d’origine sur les données modifiées, sélectionnez Plugins, IJ_Plugins et Project Hyperstack, spécifiez les tranches Z-stack qui doivent être incluses, sélectionnez Intensité moyenne comme type de projection et cliquez sur OK. Ici, la première image d’une projection z-stack de données brutes peut être comparée aux mêmes données décontrales et corrigées de l’eau de Javel.Ces images du même film déconseillé et corrigé à l’eau de Javel montrent deux cisternae qui ont été analysées, qui d’abord l’étiquette avec la protéine verte de glycosylation de résistance de Vanadate 4 ou le marqueur de Vrg4, et plus tard avec le marqueur rouge de protéine de transport de gène de Sécrétion 7 ou sec7. Ce montage, créé à partir d’une hyperstack déconseillée et corrigée à l’eau de Javel, montre toutes les sections optiques à un seul moment avant et après l’édition, pour permettre l’isolement du signal de l’une des cisternae choisies. Dans ce chiffre, plusieurs images du film final des piles Z projetées sont montrées avec les projections originales en haut de la figure et des projections éditées en bas.Quantification des signaux fluorescents verts et rouges de la cisternae Golgi choisie révèle que le marqueur vert Vrg4 arrive et persiste pendant environ 80 secondes, après quoi, le marqueur rouge Sec7 arrive et persiste pendant environ 60 secondes, avec un bref chevauchement entre les deux marqueurs. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’identifier les structures qui peuvent être suivies sans ambiguïté tout au long de leur vie. Le même type d’analyse peut être effectué après avoir fait une mutation ou un autre type de perturbation spécifique.Cette technique a ouvert la voie à l’étude du comportement dynamique des citernes Golgi et des sites de sortie de réticulum endoplasmique utilisant la levure comme système modèle.

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