Name: measurement of force-sensitive protein dynamics in living cells using a combination of fluorescent techniques
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation carrière (NSF-CMMI-14-54257) ainsi que les subventions accordées par l’American Heart Association (16GRNT30930019) et le National Institutes of Health (R01GM121739-01) décerné à m. Brenton Hoffman et un ressortissant Science Foundation recherche bourse d’études supérieures accordé à Katheryn Rothenberg. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NSF ou NIH.

1. générer des échantillons pour l’imagerie
<ol><li>Stablement express tension capteur construct dans type de cellule souhaité.<ol>
<li>Cloner tension capteur construct dans pRRL vecteur ou autres plasmides d’expression virale. Remarque : Plusieurs outils de clonage moléculaires différents sont disponibles pour réaliser cette étape, y compris l’utilisation des enzymes de restriction, se chevauchent extension et Gibson Assemblée35. Le vecteur pRRL est utilisé dans lenti transd...

La méthode FRAP-frette permet une mesure directe de la dynamique des protéines sensibles à la force une propriété qui a été difficile de sonder directement à l’intérieur de cellules vivantes. La sensibilité de la dynamique des protéines à charge moléculaire est essentielle aux fonctions de la protéine comme un transmetteur de force ou un transducteur. Chargement est nécessaire pour la transmission des deux interne et forces appliqué extérieurement, appelé mechanotransmission et pour la conversion de c...

L’environnement extracellulaire est une source riche d’indices biochimiques et physiques qui régissent le comportement de la cellule. En particulier, la nature physique du microenvironnement peut médier principales fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire, migration et différenciation1,2,3,4. Le dérèglement de la mécanique du microenvironnement est une composante essentielle pour beaucoup de maladies qui n’ont pas encore de traitements adéquats, tels que le cancer5, athérosclérose6et7de la fibrose. Bien comprendre comment les cellules convertissent des stimuli physiques en signaux détectables biochimiquement, un processus appelé mécanotransduction, exige l’élucidation des mécanismes moléculaires médiation transmission de force, dans et hors des cellules et au sein de plusieurs structures subcellulaires.
À l’intérieur des structures subcellulaires, les protéines sont tournent constamment la liaison et la séparation basée sur la force de leurs interactions avec les partenaires8de fixation. Pour les forces à être transmis avec succès à travers une distance physique, il doivent y avoir une chaîne ininterrompue d’interactions protéine-protéine, ce qui signifie que le chiffre d’affaires de la protéine doit être suffisamment lente pour maintenir et transmettre la force à son partenaire de liaison9. Alors que les interactions protéines-protéines sont généralement consistent de plusieurs non-liaisons covalentes entre les domaines de la protéine, l’interaction est souvent conceptualisée comme un État lié qui peut passer à un État indépendant sous différentes conditions10, 11. pour une interaction protéine-protéine donnée, il est possible que la force peut avoir no effet sur la durée de vie de l’interaction, connue comme un « bond idéal », réduire la durée de vie de l’interaction, connue comme un « lien de glissement » ou augmenter la durée de vie de l’interaction , connu comme un « bond de capture »10. Ainsi, il y a une relation entre charge protéique et la dynamique des protéines que nous désignons comme sensibles à la force dynamique.
Vers la compréhension de l’effet de la charge sur la dynamique de liaison, un certain nombre d’expériences très instructifs ont été réalisé au niveau de la molécule unique. À l’aide de protéines isolées, ou fragments de protéines et de techniques de manipulation comme magnétique pincettes, pinces optiques et microscopie à force atomique, ces études ont démontré les interactions protéines sensibles à la force pour plusieurs pertinentes protéines11,12. Les deux intégrines13 et cadhérines14, qui sont des protéines transmembranaires importants pour former des interactions cellule-matrice et les cellules, respectivement, ont montré des altérations dans la dynamique due pour charger. Au sein de la cellule, vinculine est recruté pour les deux talin15 et α-caténine16 en fonction de la force et peut former une liaison de catch avec l’actine17, indiquant un rôle crucial pour la vinculine adhérences focales (FAs) et jonctions adherens (AJs ) sous charge. Études de molécules simples permettant l’isolement des interactions protéine-protéine spécifique et donnent des résultats sans ambiguïté, mais ils ne tiennent pas compte de la complexité de l’environnement cellulaire.
Point de repère expériences ont démontré que plusieurs structures subcellulaires, dont le syndrome et AJs, sont mécanosensibles et pièce Assemblée améliorée en réponse aux charges interne ou externe appliqué18,19, 20,21,22. En outre, plusieurs modèles théoriques ont suggéré que l’Assemblée mécanosensibles pourrait être pilotée par protéines sensibles à la force dynamique23,24,25. Pour examiner ces dynamiques sensibles à la force dans des cellules vivantes, quelques approches indirectes ont été prises. PAF et les techniques connexes fournissent une méthode relativement simple pour mesurer la dynamique des protéines en cellules26,27,28,29. Toutefois, la mesure de la charge de la protéine a été plus limitée. Une approche classique consiste à comparer la dynamique des protéines dans les cellules avec et sans l’exposition à un inhibiteur du cytosquelette utilisé pour réduire l’ensemble cellule contractilité8,30,31. Sur le plan conceptuel, il s’agit d’une comparaison entre une charge élevée et un état de faible charge. Cependant, il n’y a aucune quantification de la charge dans l’ensemble de la protéine dans aucun des États, et il peut y avoir des effets biochimiques involontaires de l’inhibiteur, telle la perte de sites de fixation clés le long d’un filament d’actine F. Une autre approche, spécifique au FAs, a consisté à mesurer l’effort de force totale sur le substrat par la FA à l’aide de la microscopie à force traction approximative charge moléculaire et d’examiner la relation avec la dynamique d’une seule protéine au sein de la FA32. Tandis que cette approche permet la quantification de l’ensemble de la population, il ne fournit pas des informations moléculaires spécifiques. SAF est constitués de plus de 200 protéines différentes, dont beaucoup peuvent supporter la charge33. Ainsi, mesurer l’intensité de la force totale d’une FA potentiellement obscurcit la possibilité de plusieurs voies de transmission de force et fiable, ne fournit pas une mesure de la charge sur une protéine spécifique.
Contrairement aux approches antérieures en mécanobiologie, l’avènement des capteurs de tension axée sur la frette permet directement les cellules de mesure des charges subies par les protéines spécifiques à l’intérieur de vie34,35,,36. Nous présentons ici un protocole qui associe des capteurs de tension axée sur la frette FRAP-mesure de la dynamique des protéines. Nous appelons cette technique FRAP-frette. Cette approche permet la mesure simultanée de la charge protéique et de la dynamique des protéines, ce qui permet l’évaluation de la dynamique des protéines sensibles à la force dans les cellules vivantes (Figure 1). Déjà, la frette-FRAP technique a été appliquée à l’étude de la dynamique de la force-sensibles de l’éditeur de liens mécaniques protéine vinculine37. Capteurs de tension ont été développées pour nombreuses protéines qui sont pertinentes dans une variété de structures subcellulaires. Par exemple, les capteurs ont été développés pour la vinculine34 et talin38,39 FAs, cadhérines et caténines AJs40,41,42, nesprin dans le complexe de LINC nucléaire 43, α-actinine44 et filamine36 dans le cytosquelette et MUC-1 dans le glycocalyx45, entre autres46. De même, le FRAP est qu'une technique couramment utilisée a été utilisée sur les protéines de mécanosensibles dans les adhérences focales8,31, adherens jonctions47, actine cortex26et noyau48. Aller de l’avant, que la frette-FRAP technique devrait être largement applicable à l’un de ces capteurs existants ou nouvellement développé capteurs, permettant les mesures de la dynamique de la force-sensibles dans une grande variété de contextes et de structures subcellulaires. À cette fin, nous fournissons un protocole détaillé, généralisé de mise en oeuvre de la technique de la frette-FRAP applicable dans ces différents systèmes. J’espère que cela permettra une grande variété d’expériences élucider les rôles de diverses protéines de mécanosensibles dans la régulation de transmission de la force et dans la médiation de comportement de la cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x Objective NA1.35</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Dichroic Mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>T450/514rpc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET485/20m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET450/30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Venus Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET514/10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium</td>
			<td>Sapphire</td>
			<td>MC102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA Calibration Slide</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>provided along with FRAPPA unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA System with 515 nm Laser</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed Fluoro Dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide, Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP Pro Software</td>
			<td>SAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LB10-NW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph for Olympus</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Humidification System</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Heater Medium</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150819-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G Envelope Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRRL Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPax2 Packaging Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable Z Stage Warmer</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>403-1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus Emission Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-571/72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of force-sensitive protein dynamics in living cells using a combination of fluorescent techniques

Les cellules détectent et répondent à des stimuli physiques dans leur environnement en convertissant des stimuli mécaniques en signaux biochimiquement détectables dans un processus appelé la mécanotransduction. Une étape cruciale dans la mécanotransduction est la transmission des forces entre les environnements externes et internes. Pour transmettre des forces, il doit y avoir une liaison physique soutenue et ininterrompue, créée par une série d’interactions protéine-protéine. Pour une interaction protéine-protéine donnée, charge mécanique ne peut non plus avoir aucun effet sur l’interaction, entraîner une dissociation plus rapide de l’interaction, ou même stabilise l’interaction. Comprendre comment moléculaire charge dicte de renouvellement des protéines dans les cellules vivantes peut fournir des informations précieuses sur l’état mécanique d’une protéine, à son tour élucider son rôle dans la mécanotransduction. Les techniques existantes pour mesurer la dynamique des protéines sensibles à la force n’ont pas des mesures directes de la charge protéique ou s’appuient sur les mesures effectuées en dehors du contexte cellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la récupération Förster resonance energy transfert-fluorescence après photoblanchiment (FRAP-frette) technique, qui permet la mesure de la dynamique des protéines sensibles à la force dans des cellules vivantes. Cette technique est potentiellement applicable à n’importe quel capteur de tension axée sur la frette, facilitant l’étude de la dynamique des protéines sensibles à la force dans diverses structures subcellulaires et dans différents types de cellules.

FRETTE-FRAP est constitué de la combinaison de deux techniques fluorescents, vous inquiétez pas et PAF. Comme nous nous sommes concentrés sur les effets de la charge de la protéine, nous avons utilisé axée sur la frette tension capteurs34,46. Ces capteurs sont souvent basés sur une tension de détection module composé de deux protéines fluorescentes, tels que mTFP1 et VenusA206K, reliés par un éditeur de liens flagellif...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques at JoVE.com

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanobiologie, telles que la façon dont les forces sont transmises et détectées dans les cellules ainsi qu’entre les cellules et leur environnement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’accès à l’information à l’échelle moléculaire sur la façon dont les protéines réagissent aux forces mécaniques à l’intérieur du contexte natif de la cellule vivante. Bien que cette méthode ait été appliquée spécifiquement à l’étude de la protéine d’adhérence focale vinculine, elle peut également être appliquée à d’autres protéines mécaniquement sensibles, telles que le talin, les cadhérines ou la nésprine.La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car la configuration appropriée d’imagerie est difficile mais nécessaire pour le succès de l’analyse. Commencez cette procédure avec l’expression stable de la construction du capteur de tension dans le type de cellule désiré, tel que détaillé dans le protocole de texte. Pour préparer les substrats pour l’ensemencement cellulaire, achetez quatre plats à fond de verre de 35 millimètres.Travailler dans une hotte de culture cellulaire, dans un tube conique de 15 millilitres, faire quatre millilitres de 10 microgrammes par fibronectine millilitre dans stérile phosphate tamponné solution saline, ou PBS. Inverser doucement le tube une fois pour mélanger et laisser reposer la solution pendant cinq minutes dans le capot de culture cellulaire. Puis pipette un millilitre de solution de fibronectine sur chaque plat à fond de verre.Laissez la solution fibronectine sur la vaisselle pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez la solution fibronectine et rincez une fois avec PBS. Laissez un millilitre de PBS sur la vaisselle jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement.Après avoir compté les cellules, ensemencer 30 000 cellules sur chaque plat en verre enduit de fibronectine avec le média complet approprié pour un volume final de 1,5 millilitres. Laisser les cellules se propager pendant quatre heures après l’ensemencement. À deux heures de propagation, aspirer le média de croissance et rincer une fois avec un média d’imagerie.Laissez 1,5 millilitres du média d’imagerie. Réchauffez le microscope tel que décrit dans le protocole texte avant de commencer l’étalonnage. Pour calibrer le laser FRAP, ouvrez d’abord la fenêtre de configuration laser.Réglez le réglage de l’éclairage aux paramètres d’éclairage FRAP appropriés pour l’exposition au laser à l’échantillon. Réglez ensuite le réglage de l’éclairage aux paramètres d’éclairage appropriés pour l’imagerie uniquement le fluorophore accepteur. Sélectionnez l’objectif de calibrer sous le réglage du système Coordinate.Décochez manuellement cliquez sur les points d’étalonnage et vérifiez les images d’affichage pendant l’étalonnage. Réglez le temps de habit à 10 000 microsecondes et le nombre d’impulsions à 100. Placez maintenant la glissière d’étalonnage, faite de bromure d’éthidium scellée entre une glissière de verre et un glissement de couverture, dans l’adaptateur de scène avec le côté de glissement de couverture vers le bas.Utilisez les paramètres d’éclairage de l’accepteur pour vous concentrer sur la surface de la glissière, identifiable comme le plan focal avec le signal le plus lumineux. De petits défauts dans le revêtement seront visibles pour faciliter la mise au point. Déplacez la glissière vers une zone avec fluorescence uniforme à travers le plan d’imagerie.Cliquez sur Créer le paramètre pour le premier réglage d’étalonnage ou de mise à jour pour les étalonnages ultérieurs. Le logiciel initialisera le processus d’étalonnage, blanchissant et détectant automatiquement la position du point blanchi. Assurer un étalonnage réussi en évaluant l’image finale, qui sera une grille de trois points blanchis par trois qui devraient être répartis uniformément et au point.Enregistrez l’image d’étalonnage pour une référence future. Retirez la glissière d’étalonnage et rangez-la en toute sécurité. L’étalonnage doit être effectué avant de commencer chaque expérience, mais n’a pas besoin d’être effectué entre les échantillons.Préparez la configuration de la microscopie pour l’imagerie cellulaire en direct, de préférence avec un stade chauffé et objectif, ainsi qu’un contrôle du dioxyde de carbone. Laisser équilibrer pendant 20 minutes. Placez maintenant l’un des échantillons générés de cellules exprimant le capteur de tension dans le support du microscope pour l’imagerie.Laisser les cellules s’équilibrer pendant 10 minutes. Pour assurer la santé des cellules imageées, maintenez la température à 37 degrés Celsius dans la chambre d’imagerie. Utilisez une pompe périssaltique pour passer humidifié 5% de dioxyde de carbone sur les échantillons à 15 millilitres par minute pour maintenir le pH.Ouvrez l’outil d’acquisition multidimensionnelle, ou MDA, et installez-le avec les paramètres d’imagerie FRET, y compris les différents ensembles de filtres. Enregistrez ce MDA dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRET_date. Configurez un autre MDA avec les paramètres d’imagerie FRAP, y compris les différents ensembles de filtres, les paramètres Timelapse et le Journal pour pulser le laser après l’acquisition avant l’eau de Javel.Enregistrez ce MDA dans le dossier expérimental avec le nom de MDA_FRAP_date. Dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal, Démarrer l’enregistrement. Ouvrez la fenêtre MDA, chargez l’MDA_FRET_date et appuyez sur Acquérir.Chargez ensuite l’MDA_FRAP_date et appuyez sur Acquérir. À la fin de l’acquisition, dans la barre d’outils en haut de l’écran, sélectionnez Journal, Stop Recording. Enregistrez ce journal dans le dossier expérimental avec le nom de FRETFRAP_date l’ajouter à une barre d’outils pour un accès facile.Fermez la fenêtre MDA. Naviguez dans l’échantillon à l’aide de l’acquisition d’image sous Acquire, Acquire avec un temps d’exposition minimal et un filtre de densité neutre pour identifier les cellules d’intérêt. Réglez l’autofocus continu en naviguant vers les périphériques, Focus.Concentrez-vous manuellement sur l’échantillon jusqu’à atteindre le plan d’imagerie correct. Cliquez sur Définir la mise au point continue et attendre que le système s’ajuste. Une fois que le système s’ajuste, cliquez sur Démarrer la mise au point continue.Ensuite, trouvez une cellule exprimant le capteur de tension avec une localisation claire à une structure d’intérêt et de casser une image. Dessinez une région rectangulaire d’intérêt, ou roi, pour mettre en évidence où blanchir. Stockez cet emplacement roi.Maintenant, initialisez FRETFRAP_date journal, qui commencera l’acquisition d’images FRET, suivie de l’initialisation du timelapse FRAP. Répétez ces étapes jusqu’à ce que 10 à 15 ensembles d’images soient acquis. Ensuite, analysez les données FRET-FRAP telles que détaillées dans le protocole texte.Voici des résultats représentatifs pour l’imagerie FRET du capteur de tension vinculine, après segmentation et masquage pour isoler les adhérences focales. La variation spaciale de la charge de vinculine peut être vue à travers la cellule. L’imagerie et l’analyse frap peuvent être affectées par la stabilité de l’adhérence focale.Une adhérence focale qui se translocalise rapidement pendant la période d’imagerie peut être difficile à suivre avec précision. Souvent, cela est indiqué par une courbe FRAP qui contient des discontinuités et dans ininterprétable. Pour une vinculine de type sauvage, il existe une corrélation inverse entre la charge protéique et le taux de rotation, ce qui indique que la vinculine est stabilisée par la force.L’introduction d’une mutation dans la vinculine pour effectuer sa liaison au talin entraîne un renversement de la corrélation, ce qui indique que la vinculine incapable de lier le talin est déstabilisée par la force. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des échantillons correctement, de s’assurer que les cellules expriment le capteur aux niveaux endogènes et choisissent soigneusement les paramètres d’imagerie. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence, la mesure de la dynamique de l’échelle cellulaire ou des cellules difficiles avec divers inhibiteurs peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme la façon dont la protéine d’intérêt interagit avec d’autres composants subcellulaires pour coordonner la réponse à la force.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d&#39;ions dans les systèmes biologiques

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Biosensors Ratiométrique qui mesurent l&#39;état redox mitochondrial et de l&#39;ATP dans les cellules vivantes de levure

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Production de protéine élastine Hydrogels pour Encapsulation et immunomarquage des cellules en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...