Name: measurement of force-sensitive protein dynamics in living cells using a combination of fluorescent techniques
Uploaded: 2018-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques at JoVE.com

Detta arbete stöds av en National Science Foundation karriär Award (NSF-CMMI-14-54257) samt bidrag från American Heart Association (16GRNT30930019) och National Institutes of Health (R01GM121739-01) tilldelas Dr Brenton Hoffman och en nationell Science Foundation Graduate Research Fellowship tilldelas Katheryn Rothenberg. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF eller NIH.

1. generera prover för Imaging
<ol><li>Stabilt express spänningar sensorn construct i önskad celltyp.<ol>
<li>Klona spänningar sensorn konstruktion i pRRL vektor- eller andra virala uttryck plasmid. Obs: Flera olika molekylär kloning verktyg finns att åstadkomma detta steg inklusive användning av restriktionsenzym, överlappar förlängning, och Gibson församlingen35. PRRL vektorn används i lenti viral transduktion och möjliggör en betydande grad av proteinproduktion med hjälp av ...

BANDET-FRAP metoden möjliggör direkt mätning av kraft-känsliga protein dynamics, en egenskap som har varit svårt att direkt söka inuti levande celler. Känsligheten av protein dynamics och molekylär belastning är kritiska till proteinets funktion som en kraft sändare eller givaren. Lastning krävs för överföring av både internt genererade och externt-tillämpad styrkor, kallas mechanotransmission, och för omvandlingen av dessa styrkor till biokemiskt-detectable signaler, som kallas mechanotransduction. Men ...

Den extracellulära miljön är en rik källa till både biokemiska och fysiska ledtrådar som dikterar cell beteende. Särskilt kan den fysiska naturen i närmiljön medla viktiga cellulära funktioner, inklusive celltillväxt, migration och differentiering1,2,3,4. Dysreglering av mekaniken i närmiljön är en kritisk komponent för många sjukdomar som ännu inte har tillräcklig behandlingar, såsom cancer5, åderförkalkning6och fibros7. En fullständig förståelse av hur celler omvandlar fysiska stimuli till biokemiskt-detectable signaler, en process som kallas mechanotransduction, kräver förtydligandet av de molekylära mekanismer som medla kraft överföring, både in och ut ur cellerna och inom flera subcellulära strukturer.
Inuti subcellulära strukturer vänder proteiner ständigt över; bindande och uppdelningen baserat på styrkan i deras interaktioner med bindande partner8. För krafter överförs framgångsrikt över fysiska avstånd, måste det finnas en obruten kedja av protein-protein interaktioner, vilket innebär att en proteinets omsättning måste vara långsam nog att bevara och överföra kraft till dess bindande partner9. Medan protein-protein interaktioner består vanligen av flera icke-kovalenta bindningar mellan protein domäner, konceptualiseras samspelet ofta som en bunden stat som kan övergå till en obunden stat under olika villkor10, 11. för ett visst protein-protein interaktioner, är det möjligt att kraft kan har ingen effekt på livslängden av interaktionen, känd som en ”perfekt bond”, minska livslängden på interaktionen, känd som en ”slip bond”, eller öka livslängden på samspelet , känd som en ”catch bond”10. Således finns det ett intrikat förhållande mellan protein belastning och protein dynamik, som vi kallar kraft-känsliga dynamics.
För att förstå effekten av belastning på bond dynamics, har ett antal mycket informativ experiment utförts på nivån singel-molekyl. Med isolerade proteiner eller fragment av proteiner och manipulation tekniker såsom magnetiska pincetter, optisk pincett och atomic force microscopy, har dessa studier visat kraft-känsliga protein-protein interaktioner för flera relevanta proteiner11,12. Båda integriner13 och cadherins14, som är transmembrana proteiner viktiga för att bilda cell-matrix och cell-cell interaktioner, respektive, har visat förändringar i dynamics på grund för att ladda. I cellen, vinculin rekryteras till båda talin15 och α-catenin16 i en kraft-beroende sätt och kan bilda fångst med aktin17, indikerar en avgörande roll för vinculin på både fokal sammanväxningar (FAs) och adherens föreningspunkter (AJs ) under belastning. Singel-molekyl studier tillåta för isolering av specifika protein-protein interaktioner och ge entydiga resultat, men de hänsyn inte till komplexiteten i den cellulära miljön.
Landmärke experiment visat att flera subcellulära strukturer, inklusive FAs och AJs, är mechanosensitive, och uppvisar förbättrad församlingen svar på internt genererad eller externt appliceras laster18,19, 20,21,22. Flera teoretiska modeller har dessutom föreslagit att mechanosensitive församlingen kunde drivas av kraft-känsliga protein dynamics23,24,25. För att undersöka dessa kraft-känsliga dynamiken inom levande celler, har några indirekta metoder vidtagits. FRAP och relaterade tekniker ger en relativt enkel metod för att mäta protein dynamics i celler26,27,28,29. Mätning av protein belastning har dock varit mer begränsad. En typisk metod är att jämföra protein dynamics i celler med och utan exponering för en cytoskeletal-hämmare används för att minska totala cell kontraktilitet8,30,31. Begreppsmässigt är detta en jämförelse mellan en hög belastning och låg belastning. Dock finns det ingen kvantifiering av belastningen över proteinet i antingen tillstånd, och det kan finnas oavsiktliga biokemiska effekter av hämmaren, sådan förlusten av viktiga bindande platser längs en F-aktin filament. Ett annat tillvägagångssätt, specifika för FAs, har varit att mäta total kraft ansträngning på substraten av FA använder dragkraft force microscopy ungefärliga molekylär belastning och undersöka förhållandet med dynamiken i ett enda protein inom FA32. Medan detta tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av totala kraften, ger den inte molekylärt specifik information. FAs består av över 200 olika proteiner, av vilka många kan bära lasten33. Således mäta total kraft utdata från en FA potentiellt skymmer möjligheten att flera kraft överföring vägar och på ett tillförlitligt sätt ger inte ett mått på belastningen på ett specifikt protein.
Till skillnad från tidigare metoder i Mekanobiologi, tillkomsten av bandet-baserade spänning sensorer kan direkt mätning av laster upplevs av specifika proteiner inuti levande celler34,35,36. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar bandet-baserade spänning sensorer med FRAP-baserade mått av protein dynamics. Vi hänvisar till denna teknik som bandet-FRAP. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig mätning av protein belastning och protein dynamik, vilket möjliggör bedömning av kraft-känsliga protein dynamiken i levande celler (figur 1). BANDET-FRAP tekniken har redan tillämpats till studien av kraft-känsliga dynamiken i de mekaniska linker protein vinculin37. Spänning sensorer har utvecklats för många proteiner som är relevanta i en mängd olika subcellulära strukturer. Till exempel har sensorer utvecklats för vinculin34 och talin38,39 i FAs, cadherins och catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleära LINC komplexa 43, α-actinin44 och filamin36 i cytoskelettet och MUC-1 i de glykokalyx45, bland annat46. Likaså är FRAP en vanligt förekommande teknik har använts på mechanosensitive proteiner inom focal sammanväxningar8,31, adherens föreningspunkter47, aktin cortex26och nucleus48. Framåt, bandet-FRAP tekniken bör vara allmänt tillämpliga på någon av dessa befintliga sensorer eller nyligen utvecklat sensorer, vilket möjliggör mätningar av kraft-känsliga dynamik i en mängd olika subcellulära strukturer och sammanhang. Detta slutet tillhandahåller vi en detaljerad, generaliserad protokoll för att genomföra bandet-FRAP tekniken tillämpas i dessa olika system. Förhoppningsvis kan en mängd olika experiment klarlägga roller olika mechanosensitive proteiner reglerar kraft överföring och medla cell beteende.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x Objective NA1.35</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>H117EIX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Dichroic Mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>T450/514rpc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Emission Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET485/20m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom mTFP1 Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET450/30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Venus Excitation Filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td></td>
			<td>ET514/10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium</td>
			<td>Sapphire</td>
			<td>MC102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, Human</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA Calibration Slide</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>provided along with FRAPPA unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRAPPA System with 515 nm Laser</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed Fluoro Dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293-T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide, Polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP Pro Software</td>
			<td>SAS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LB10-NW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>LS/OF30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph for Olympus</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Humidification System</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>130708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Heater Medium</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150819-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G Envelope Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRRL Vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPax2 Packaging Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stable Z Stage Warmer</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>403-1926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus Emission Filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-571/72</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of force-sensitive protein dynamics in living cells using a combination of fluorescent techniques

Celler känna och reagera på fysiska ledtrådar i deras miljö genom att omvandla mekanisk stimuli till biokemiskt-detectable signaler i en process som kallas mechanotransduction. Ett avgörande steg i mechanotransduction är överföringen av krafter mellan de yttre och inre miljöerna. Att överföra krafter, det måste finnas en ihållande, obruten fysisk koppling som skapas av en serie av protein-protein interaktioner. För ett visst protein-protein interaktioner, mekanisk belastning kan antingen har ingen effekt på samverkan, leda till snabbare disassociation av interaktionen, eller ens stabilisera interaktionen. Förstå hur molekylära belastning dikterar protein omsättningen i levande celler kan ge värdefull information om det mekaniska tillståndet av ett protein, som i sin tur belysa dess roll i mechanotransduction. Befintliga tekniker för att mäta kraft-känsliga protein dynamics antingen saknar direkta mätningar av protein belastning eller förlita sig på de mätningar som utförs utanför det cellulära sammanhanget. Här beskriver vi ett protokoll för Förster resonans energi överföring-fluorescens återhämtning efter fotoblekning (bandet-FRAP) teknik, som möjliggör mätning av kraft-känsliga protein dynamiken inom levande celler. Denna teknik är potentiellt tillämpliga på någon bandet-baserade spänning sensor, att underlätta studiet av kraft-känsliga protein dynamics i mängd subcellulära strukturer och i olika celltyper.

BANDET-FRAP utgörs av kombinationen av två fluorescerande tekniker, FRET och FRAP. Som vi fokuserat på effekterna av protein belastning, använde vi bandet-baserade spänning sensorer34,46. Dessa sensorer är ofta baserade på en spänning avkänning modul bestående av två fluorescerande proteiner, såsom mTFP1 och VenusA206K, ansluten med en flagelliform länkare (figur 1A). När modulen är pla...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques at JoVE.com

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Mätning av kraft-känsliga Protein Dynamics i levande celler med hjälp av en kombination av fluorescerande tekniker

Här presenterar vi ett protokoll för samtidig användning av Förster resonans energi överföring-baserade spänning sensorer för att mäta protein belastning och fluorescens återhämtning efter fotoblekning att mäta protein dynamics möjliggör mätning av kraft-känslig protein dynamiken inom levande celler.

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Denna metod kan svara på viktiga frågor inom området mekanobiologi, till exempel hur krafter överförs och avkänns inom celler samt mellan celler och deras miljö. Den största fördelen med denna teknik är det ger tillgång till den molekylära skalan information om hur proteiner reagerar på mekaniska krafter inuti den inhemska sammanhang i den levande cellen. Även om denna metod har tillämpats specifikt för att studera fokal vidhäftning protein vinculin, det kan också tillämpas på andra mekaniskt känsliga proteiner, såsom talin, kadheriner eller nesprin.Visuell demonstration av denna metod är kritisk, som korrekt imaging setup är svårt men nödvändigt för att lyckas med analysen. Inled detta förfarande med stabilt uttryck för spänningssensorkonstruktionen i önskad celltyp, som detaljerad i textprotokollet. För att förbereda substrat för cellsådd, förvärva fyra 35 millimeter glasbottnad rätter.Arbeta i en cellkultur huva, i en 15 milliliter koniska rör, gör fyra milliliter av 10 mikrogram per milliliter fibronectin i steril fosfat-buffrad saltlösning, eller PBS. Försiktigt invertera röret en gång för att blanda och låt lösningen sitta i fem minuter i cellkulturen huva. Sedan pipettera en milliliter fibronectin lösning på varje glasbottnad skålen.Lämna fibronectinlösningen på disken i en timme i rumstemperatur eller över natten vid fyra grader Celsius. Därefter aspirera fibronectinlösningen och skölj en gång med PBS. Lämna en milliliter PBS på disken tills cellerna är redo för sådd.Efter att ha räknat cellerna, utsäde 30, 000 celler på varje fibronectin-belagda glas skålen med lämpliga kompletta medier för en slutlig volym på 1,5 milliliter. Låt cellerna spridas i fyra timmar efter sådd. Vid två timmars spridning, aspirera tillväxtmedia och skölj en gång med bildbehandlingsmedia.Lämna 1,5 milliliter av bildmediet. Värm upp mikroskopet enligt beskrivningen i textprotokollet innan kalibreringen påbörjas. För att kalibrera FRAP-lasern öppnar du först laserkonfigurationsfönstret.Ställ In Belysningsinställning till lämpliga FRAP Illuminationsinställningar för laserexponering för provet. Ställ sedan In Belysningsinställning till belysningsinställningarna som är lämpliga för avbildning endast av acceptorfluofor. Välj målsättning att kalibrera under Koordinatsysteminställning.Avmarkera Manuellt klicka på kalibreringspunkter och kontrollera Visa bilder under kalibreringen. Ställ in Dwell-tiden på 10, 000 mikrosekond och antalet pulser till 100. Nu placera kalibreringsglid, gjord av ethidiumbromid förseglad mellan en glasglid och en täckglid, in i scenadaptern med locket glida sidan nedåt.Använd inställningarna för acceptorbelysning för att fokusera på bildens yta, identifierbar som fokalplanet med den ljusaste signalen. Små defekter i beläggningen kommer att vara synliga för stöd i fokusering. Flytta bilden till ett område med enhetlig fluorescens över bildplanet.Klicka på Skapa inställning för den första kalibreringen eller Uppdateringsinställningen för efterföljande kalibreringar. Programvaran kommer att initiera kalibreringsprocessen, automatiskt blekning och upptäcka positionen för den blekta punkten. Säkerställa en lyckad kalibrering genom att bedöma den slutliga bilden, som kommer att vara en tre-av-tre rutnät av blekta punkter som bör vara jämnt fördelade och i fokus.Spara kalibreringsbilden för framtida referens. Ta bort kalibreringssglaset och förvara säkert. Kalibrering bör utföras innan varje experiment påbörjas men behöver inte utföras mellan proverna.Förbered mikroskopi setup för live cell imaging, helst med en uppvärmd scen och mål, samt en koldioxid kontroll. Låt jämvikt i 20 minuter. Placera nu ett av de genererade proverna av celler som uttrycker spänningssensorn i mikroskophållaren för avbildning.Låt cellerna jämvikt i 10 minuter. För att säkerställa hälsan hos de avbildade cellerna, bibehåll temperaturen vid 37 grader Celsius i bildbehandlingskammaren. Använd en peristaltisk pump för att passera befuktade 5%koldioxid över proverna på 15 milliliter per minut för att upprätthålla pH.Öppna multidimensionellt förvärv, eller MDA, verktyg och ställa in den med FRET bildframställning parametrar, inklusive de olika filteruppsättningarna. Spara denna MDA till Experimentmappen med namnet på MDA_FRET_date. Ställ in ytterligare en MDA med FRAP-bildparametrarna, inklusive de olika filteruppsättningarna, Timelapse-inställningarna och Journalen för att pulsera lasern efter förvärvet av förblekmedel.Spara denna MDA till Experimentmappen med namnet på MDA_FRAP_date. I verktygsfältet högst upp på skärmen väljer du Journal, Starta inspelning. Öppna MDA-fönstret, ladda MDA_FRET_date och tryck på Acquire.Ladda sedan MDA_FRAP_date och tryck på Acquire. I slutet av förvärvet, i verktygsfältet högst upp på skärmen, väljer du Journal, Stoppa inspelning. Spara den här journalen i experimentmappen med namnet på FRETFRAP_date lägga till den i ett verktygsfält för enkel åtkomst.Stäng MDA-fönstret. Navigera i urvalet med hjälp av bildförvärvet under Acquire, Acquire med minimal exponeringstid och filter för neutral densitet för att identifiera de celler av intresse. Ställ in kontinuerlig autofokus genom att navigera till Enheter, Fokus.Fokusera manuellt på provet tills du når rätt bildplan. Klicka på Ställ in kontinuerligt fokus och vänta på att systemet ska justeras. När systemet har justerats klickar du på Starta kontinuerlig fokusering.Hitta sedan en cell som uttrycker spänningssensorn med tydlig lokalisering till en struktur av intresse och knäppa en bild. Rita en rektangulär region av intresse, eller ROI, för att markera var bleka. Lagra den här ROI-platsen.Nu initierar FRETFRAP_date, som kommer att börja förvärvet av FRET bilder, följt av initiering av FRAP timelapse. Upprepa dessa steg tills 10 till 15 bilduppsättningar förvärvas. Analysera sedan FRET-FRAP-data som detaljerade i textprotokollet.Visas här är representativa resultat för FRET imaging av vinculin spänningssensor, följande segmentering och maskering för att isolera fokala sammanväxningar. Spacial variation av vinculin belastning kan ses över cellen. FRAP bildbehandling och analys kan påverkas av fokal vidhäftning stabilitet.En fokal vidhäftning som translokerar snabbt under bildperioden kan vara svårt att exakt spåra. Ofta indikeras detta av en FRAP-kurva som innehåller diskontinuiteter och i otolkbar. För en vinculin av vildtyp finns det ett omvänt samband mellan proteinbelastning och omsättningshastighet, vilket indikerar att vinculin stabiliseras med våld.Införa en mutation i vinculin att verkställa dess bindning till talin resulterar i en återföring av korrelationen, vilket indikerar att vinculin som är oförmögen att binda talin är destabiliserad med våld. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att förbereda prover ordentligt, se till att cellerna uttrycker sensorn på endogena nivåer och välja bildbehandling parametrar noggrant. Efter detta förfarande, andra metoder som immunofluorescens, mätning av cellulära skala dynamik eller utmanande celler med olika hämmare kan utföras för att besvara ytterligare frågor som hur proteinet av intresse interagerar med andra subcellulära komponenter för att samordna svar till kraft.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levande celler

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Tid och rum Manipulering av små GTPas aktivitet på Subcellulär nivå och Tidsplan sekunder i levande celler

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Propportionell Biosensors som mäter Mitokondriell redoxtillstånd och ATP i Living jästceller

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Använda Syntetisk biologi ingenjör levande celler som har gränssnitt programmerbara material

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Produktionen av Elastin-liknande Protein hydrogeler för inkapsling och immunfärgning av celler i 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...