Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر بمعهد جوته والكبد برامج المناعة الفطرية للدعم النقدي لهذا المشروع. كما يمول B.A.J.T. R01 AI121209.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كولورادو انشوتز حرم الجامعة الطبية.
1-إعداد المواد
<ol><li>جعل حلاً 5 ملغ/مل من الدناز أنا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).</li>
	<li>جعل الخليط الهضم بإضافة 5,000 يو/مليلتر من كولاجيناز ...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

عموما أهمية لاو في منأى عن التوازن والتنظيم أصبح مؤخرا الخفيفة25. الكثير من الكتابات المنشورة على اللمفاوية يركز على الجلد والعقد الليمفاوية؛ بيد أن اللمفاوي موجودة في جميع أنحاء الجسم26 وهكذا، هناك حاجة إلى فهمنا لأهميتها في مختلف الأجهزة. هنا نعرض طريقة التي يم?...

دور الأوعية اللمفاوية ولاو في الكبد ليست مفهومة جيدا. بينما توجد داخل الثالوث المدخل من الكبد1 الأوعية اللمفاوية وتوسيع أثناء المرض2، سوى القليل جداً من المفهوم فيما يتعلق بوظيفة والنمط الظاهري للموظفين المدنيين المحليين داخل الكبد. مع اكتشاف علامات موجودة أساسا في لاو3، أهمية هذه الخلايا داخل المنافذ أنسجة مختلفة في التوازن والمرض سوف تملأ فجوة كبيرة في فهمنا. لاو بدور رئيسي في الحفاظ على التسامح المحيطية في العقدة الليمفاوية وأورام المنتشر بالتفاعل مباشرة مع تي الخلايا4،،من56،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يمكن تعزيز لاو في العقدة الليمفاوية حصانة وقائية عن طريق تفاعلها مع الخلايا الجذعية المهاجرة14،،من1516. ولذلك، هناك أدوار متعددة للأو التي قد تكون محددة للأنسجة والتفاعلات التي يتواجدون فيها. ومع ذلك، سوى القليل جداً من المفهوم حول كيفية تفاعل لاو مع الخلايا المناعية في الأنسجة أو الكيفية التي تعمل بها لاو في أنظمة الجهاز المختلفة؛ وهكذا، تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس كل خلية داخل الكبد أو الأجهزة الأخرى قد يؤدي إلى التقدم في كيفية برنامج لاو الحصانة الخاصة بالانسجة. بينما الكثير من المؤلفات التي تركز على LECs في الكبد يستخدم الفحص المجهري لتصور لاو استخدام واحد أو اثنين من علامات ومورفولوجيا17، أنجز القليل جداً على وجه التحديد تقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية باستخدام التدفق الخلوي، على الرغم من أن إحدى الدراسات تقييم الاختلافات بين خلايا الكبد بطانية جيبية () ولاو18. التمكن من تحليل السكان LEC في الكبد من خلال التدفق الخلوي يسمح للدراسة المتعمقة للنمط الظاهري LEC أثناء التوازن الطبيعي أو المرض.
هناك حاجة لتقييم الموظفين المدنيين المحليين عن طريق التدفق الخلوي، عدة علامات السطحية. عادة، يتم تصور لاو بالتعبير عن ذات الصلة بروسبيرو هوميوبوكس 1 (Prox-1) أو السفينة اللمفاوية hyaluronan بطانية مستقبلات 1 (LYVE1) أو مستقبلات عامل نمو غشائي الأوعية الدموية 3 (VEGFR3) باستخدام الفحص المجهري. ومع ذلك، في الكبد، والتعبير عن هذه العلامات غير مقيد إلى لاو. وأعرب Prox-1 هو على نطاق واسع بخلايا الكبد خلال التنمية الكبد والتجدد، وإصابة19والتعبير عن LYVE1 و VEGFR3 ب الكبد خلايا بطانية جيبية18. في العقدة الليمفاوية، حددت لاو استخدام التدفق الخلوي كمجموعات من التمايز (CD) CD45-و CD31 + وبودوبلانين + (بدبن)16. بيد أن هذا النهج ضئيل جداً لعزل لاو في الكبد منذ CD45-CD31 + الخلايا سيتم التقاط خلايا بطانية, والسكان الغالبة للخلايا البطانية الوعائية في الكبد لسيكس. وهكذا، علامات أخرى ضرورية للتمييز بين السكان LEC نادرة من السكان لسيك وفيرة. CD16/32 (معبراً عنها بالنضج لسيكس18) و CD146 (مشترك خلايا بطانية وعائية علامة التي يغلب عليها الطابع أبداها الكبد خلايا بطانية جيبية20 مع قليل من لا تعبير اللمفاوية داخل الكبدية الكبد خلايا بطانية21) كانت علامات المرشح.
ولذلك، نحن الأمثل طريقة لعزل وتصور لاو في الكبد استخدام أعلاه علامات، CD45، CD31، CD146، CD16/32، وبدبن للتدفق الخلوي. يصف لنا استخدام كولاجيناز الرابع، 1 الدناز، وفصل الميكانيكية لهضم أنسجة الكبد في تعليق خلية واحدة. كما يصف لنا استخدام التدرج الكثافة إيوديكسانول لعزل الخلايا غير متني (المجلس الوطني) وإزالة الحطام الخلوية. وأخيراً، استخدام علامات متعددة، علينا أن نحدد استراتيجية النابضة الخلوي التدفق الأمثل لتحديد الموظفين المدنيين المحليين من الكبد مع بدبن كعلامة الغالبة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

داخل الكبد، والأوعية اللمفاوية توجد داخل الثالوث المدخل، ووظيفتها وصف لإزالة السائل الخلالي من الكبد إلى الغدد الليمفاوية حيث يمكن مسح الحطام الخلوية ومولدات المضادات. ونحن مهتمون للغاية في فهم كيف يمكن أن تشترك المفرج اللمفاوي في التهاب ووظيفة الخلايا المناعية داخل الكبد. إلا أن القليل جداً قد تم نشر وضع بروتوكولات الهضم لعزل خلايا بطانية اللمفاوي (LECs) من الكبد أو علامات محددة التي يمكن استخدامها لتقييم الكبد لاو على أساس كل خلية. ولذلك، نحن الأمثل وسيلة الهضم وتلطيخ الكبد بغية تقييم السكان LEC في الكبد. ونحن واثقون من أن الطريقة المبينة هنا ستكون مفيدة لتحديد وعزل لاو عن الكبد، وسيتم تعزيز فهمنا لكيفية التجاوب لاو المكروية الكبد.

واستخدمت دراسات تحليل الكبد اللمفاوي أساسا إيمونوهيستوتشيميستري إلى كوانتيتاتي بالتردد وقطر الأوعية اللمفية في الكبد. ومع ذلك، لا يسمح هذا الأسلوب لتقييم الموظفين المدنيين المحليين على أساس خلية بخلية أو للتعبير عن عدة علامات، السيتوكينات، المستقطبات، أو عوامل النسخ...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

والهدف من هذا البروتوكول تحديد الخلية اللمفاوية غشائي السكان داخل الكبد باستخدام علامات وصف. فنحن نستخدم كولاجيناز الرابع والدناز وتنميق رقيقة من الأنسجة، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، لتحديد عدد سكانها متميزة من خلايا بطانية اللمفاوية.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقول اللمفاوية والكبد، مثل كيفية استجابة الخلايا البطانية اللمفاوية، أو LECs، لمحفزات محددة وكيف تساهم في الإصابة بالأمراض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا يمكن أن تقييم الكبد الكبد الخلايا البطانية الظاهرية والوظائف على أساس الخلية الواحدة، ويمكن استخدامها لتطبيقات أسفل تيار بعد فرز الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في علم الأحياء اللمفاوية في الكبد، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتقييم الخلايا البطانية اللمفاوية من الأنسجة المختلفة، مثل الجلد والغدة الثديية.(سيُظهر الإجراء أن (جيفري فينلون مساعد أبحاث محترف من مختبري لإعداد تعليق وحيد الخلية من خلايا الكبد المعزولة، تبدأ برش أسفل الماوس مع الإيثانول 70 في المئة، وتأمين الكفوف إلى لوحة تشريح. استخدام مقص تشريح لقطع الجلد حوالي سنتيمتر واحد فوق فتحة الشرج واستخدام ملقط مسنن لرفع الجلد بعيدا عن الجسم.أدخل النصائح المقصية بين الجلد والصوانيم وافتح المقص لفصل الأنسجة قبل مواصلة شق الجلد حتى الرقبة. تأمين الجلد إلى لوحة التشريح تحت كل forelimb وفوق كل hindlimb، وسحب كيس البريتونية صعودا لتمديد شق نحو الرقبة. فهم فصوص الكبد وقطع فقط تحت القص للسماح تشريح حول الكبد.ثم نقل الجهاز إلى أربعة ملليلتر من كليك في EHAA المتوسطة. استخدام مشرط لقطع الكبد إلى ما يقرب من قطعة قطرها ملليمتر واحد وهضم القطع في خمسمائة ميكرولترات من حل الهضم الطازجة وإعداد وخمسمائة ميكرولترات من DNase 1. بعد خمسة عشر دقيقة في سبع وثلاثين درجة مئوية، واستخدام الأنابيب 500 ملليلتر لخلط الأنسجة جيدا وإعادة الحاوية إلى الحاضنة لمدة خمس عشرة دقيقة أخرى.في نهاية الحضانة، نقل العينة المهضوبة من خلال مصفاة مائة ميكرون في أنبوب مخروطي خمسين ملليلتر واستخدام المكبس من حقنة ملليلتر واحدة للضغط بلطف على القطع المتبقية من الأنسجة من خلال شبكة. اغسل الفلتر بخمس ملليلترات من عازلة العزل واضغط بلطف على أي أنسجة متبقية من خلال المصفاة. جمع خلايا الكبد المعزولة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا في عشرة ملليلتر من العازلة العزل وعد الخلايا على قياس الهيموسيت لتحديد عدد الكبد الكامل. إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من iodixanol 20 في المئة وتراكب تعليق الخلية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا بواسطة كثافة فصل التدرج والحصاد طبقة بين برنامج تلفزيوني واليوديكسول.ثم تصفية الخلايا من خلال مصفاة ميكرومتر مائة في أنبوب مخروطي جديد خمسين ملليلتر. غسل الخلايا في عشرة ملليلتر من العازلة العزلة الطازجة وإعادة تعليق بيليه الناتجة في خمسمائة microliters من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع مصل الأبقار الجنينية بنسبة 2 في المئة، أو FBS. بعد العد، aliquot ما يقرب من خمس مرات عشرة إلى الخلايا السادسة غير parenchymal في كل عنصر تحكم وبئر تجريبية من ستة وتسعين لوحة جيدا للطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في تسعين ميكرولترس من برنامج تلفزيوني زائد FBS في البئر.أضف كوكتيلات الأجسام المضادة الأولية التجريبية والتحكم فيها إلى كل بئر وتلطيخ جميع الآبار مع علامة صلاحية مناسبة. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو المعايرة السليمة للأجسام المضادة واستخدام الضوابط نوع الجليد وضوابط fluorescence-1 للتحقق من تلطيخ. بعد ثلاثين دقيقة في أربع درجات مئوية، وغسل أجهزة الطرد المركزي الخلايا مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS في البئر ونقل الخلايا من كل بئر إلى الفردية خمسة ملليلتر تدفق أنبوب أنبوب cytometry جولة القاع إلى حجم نهائي 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني زائد FBS لكل أنبوب.ثم، استخدام حجم صغير من الخلايا لضبط إعدادات الليزر والتعويض على جهاز قياس التدفق وقراءة كل الأحداث لكل أنبوب. عندما تم قراءة جميع الأنابيب، استيراد البيانات إلى تدفق تدفق مناسب تحليل برنامج. بوابة على الخلايا الحية على أساس صبغة علامة البقاء حيث يعتبر التعبير السلبي يعيش.بوابة على الخلايا الحية على أساس حجم و حبيبية من الخلايا وكذلك على صلاحية علامة صبغ التعبير، تليها الغاء على CD45 السلبية CD31 السكان الخلايا الإيجابية باستخدام التحكم في ايزوتيبي المناسبة والبيانات fluorescence-1 لتحديد السكان الإيجابية والسلبية. ثم بوابة الخلايا السلبية CD31 CD31 السلبية وفقا لD16/32 والتعبير podoplanin للسماح بتحديد CD31 السلبية CD31، CD16/32 السلبية podoplaninجابية endothelial الليمفاوية، وDD45 سلبية CD31 إيجابية، CD16/32 إيجابية podoplanin الكبد السلبية الجيوب الأنفية السلمية مجموعات الخلايا البطانية. الخلايا البطانية مؤكدة التعبير عن الأوعية اللمفاوية والهالورونان البطانية واحد, ولكن ليس CD146.الكبد المعزول CD31 إيجابية CD16/32 الخلايا الإيجابية المعزولة كما هو موضح هي أيضا CD146 إيجابية وpodoplanin إيجابية، في حين أن CD31 إيجابية CD16/32 الخلايا السلبية هي في المقام الأول CD146 سلبية وإما podoplanin إيجابية أو سلبية. تم تحديد الإيجابية على أساس تلطيخ الفلوريسين-1. خلايا البطاخيل اللمفاوية الكبد هي CD146 السلبية وPDPN إيجابية.لا بطانة الأوعية الدموية ولا الضامة الكبد مورين التعبير عن podoplanin. يمكن أيضا أن تستخدم تلطيخ Podoplanin لتمييز cholangiocytes من الأوعية اللمفاوية على أساس الهياكل النووية المتميزة من القنوات الصفراوية وكذلك من قبل السيتوكيراتين 7 تلطيخ. كما الخلايا البطانية اللمفاوية فقط شارك في التعبير عن عامل النمو البطانية الوعائية مستقبلات 3 وبروسبيرو بروتين homeobox 1 في الكبد, ويمكن استخدام هذه العلامات كذلك لتأكيد نقاء الكبد فرز الخلايا البطانية اللمفاوية.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تعمل بسرعة والحفاظ على الخلايا على الجليد. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل فرز تدفق مجموعات LEC للإجابة على أسئلة إضافية، مثل التنميط النسخي لنصوص LECs. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا اللمفاوية الخاصة بالكبد لاستكشاف كيفية تأثير اللمفاويات على أمراض الكبد في الفئران والبشر.عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن الخلايا البطانية اللمفاوية هي نادرة، والسكان التدريجي في الكبد والطريقة التي تحتاج إلى أن يتم تنفيذها بسرعة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...