Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

De auteurs bedank de GI en lever aangeboren immuun programma's voor monetaire steun voor dit project. B.A.J.T. wordt ook gefinancierd door R01 AI121209.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus.
1. voorbereiding van de materialen
<ol><li>Maak een oplossing van 5 mg/mL van DNase ik in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Maak een mengsel van de spijsvertering door 5.000 U/mL collagenase IV aan Klik op de EHAA media toe te voegen.</li>
	<li>Verwarm het mengsel van...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

Het algemene belang van LECs in immuun homeostase en verordening gekomen onlangs tot lichte25. Veel van de gepubliceerde lymfatische literatuur focust op de huid en lymfklieren; echter, lymfatische worden aangetroffen in het lichaam26 , en dus ons begrip van hun belang in verschillende organen nodig is. Hier laten we een methode waarin de LECS-server in de lever kunnen worden bestudeerd op basis van cel-door-cel om hun gelijktijdige uitdrukking van verschillende oppervlakte...

De rol van lymfevaten en de LECS-server in de lever niet goed wordt begrepen. Terwijl lymfevaten zijn te in de portal triade van de lever1 vinden en uit te tijdens ziekte2 breiden, is weinig begrepen met betrekking tot de functie en het fenotype van de LECS-server binnen de lever. Met de ontdekking van de markeringen die zijn gevonden voornamelijk op de LECS-server3, vult het belang van deze cellen binnen verschillende weefsel niches in de homeostase en ziekte een belangrijke leemte in ons begrip. LECS-server hebben een belangrijke rol bij het handhaven van perifere tolerantie in de lymfeklier en gemetastaseerde tumoren door direct interactief werken met T cellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in de lymfeklier protectieve immuniteit via hun interacties met15,16van de14,van de trekkende dendritische cellen kunnen bevorderen. Daarom zijn er meerdere functies voor LECs die specifiek zijn voor de weefsels en interacties waarin ze aanwezig zijn. Maar is weinig begrepen over hoe de LECS-server interactie met immune cellen in het weefsel of hoe LECs functioneren in verschillende orgaansystemen; Dus, LECs evalueren op basis van per cel binnen de lever of andere organen kan leiden tot vooruitgang in hoe LECs program weefsel-specifieke immuniteit. Terwijl veel van de literatuur die zich op de LECS-server in de lever richt microscopie gebruikt om te visualiseren LECS-server met behulp van één of twee markeringen en morfologie17, is heel weinig gedaan om de LECS-server specifiek te evalueren op basis van cel voor cel met behulp van stroom cytometry, hoewel een studie verschillen tussen sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSECs) en LECs18evalueren. Kunnend analyseren LEC populaties in de lever door stroom cytometry voorziet de grondige studie van LEC fenotype tijdens normale homeostase of ziekte.
Om te beoordelen LECs door stroom cytometry, zijn meerdere oppervlakte markeringen nodig. Typisch, LECs worden gevisualiseerd door de expressie van prospero-gerelateerde homeobox 1 (Prox-1), de lymfatische vaartuig endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) of de vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) met behulp van microscopie. In de lever is de uitdrukking van deze markers echter niet beperkt tot de LECS-server. ProX-1 is wijd van hepatocyten tijdens lever ontwikkeling, regeneratie en letsel19, en LYVE1 en VEGFR3 worden geuit door de endotheliale cellen van de lever sinusvormige18. In de lymfeklier, LECs worden geïdentificeerd met behulp van stroom cytometry als clusters van differentiatie (CD) CD45 - CD31 + en podoplanin + (PDPN)16. Deze aanpak is echter ook minimale LECs in de lever te isoleren omdat CD45 - CD31 + cellen endotheliale cellen vangen zal, en de overheersende bevolking van vasculaire endotheliale cellen in de lever LSECs zijn. Zo nodig andere markeringen zijn te onderscheiden van de zeldzame LEC-bevolking uit de overvloedige LSEC populatie. Zowel CD16/32 (uitgedrukt door volwassen LSECs18) en CD146 (een gemeenschappelijke vasculaire endothelial cel markering die wordt hoofdzakelijk binnen de lever sinusoïdes uitgedrukt door endotheliale cellen van de lever sinusvormige20 met weinig tot geen expressie door lymfatisch endotheliale cellen21) werden kandidaat-markeringen.
Daarom geoptimaliseerd we een methode voor het opsporen en visualiseren van de LECS-server in de lever met behulp van de bovenstaande markeringen, CD45, CD31, CD146, CD16/32 en PDPN voor stroom cytometry. We beschrijven het gebruik van collagenase IV, DNase 1 en mechanische scheiding voor leverweefsel vertering in de schorsing van een eencellige. Ook beschrijven we het gebruik van iodixanol dichtheid verloop voor de isolatie van niet-parenchymal cellen (NPC) en te elimineren cellulaire puin. Ten slotte, met behulp van meerdere markeringen, we de optimale stroom cytometry gating strategie te identificeren van de LECS-server van de lever met PDPN als overheersende markering bepalen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

Binnen de lever, lymfevaten binnen de portal triad worden gevonden, en hun beschreven functie is om de interstitiële vloeistof van de lever naar de lymfeklieren waar cellulaire puin en antigenen kunnen worden onderzocht. Wij zijn zeer geïnteresseerd in het begrip van hoe de lymfatische therapieën kan worden betrokken bij de ontsteking en immuun cel functie binnen de lever. Echter zeer weinig is gepubliceerd tot oprichting van de spijsvertering protocollen voor de isolatie van lymfatische endotheliale cellen van de lever of de specifieke markeringen die kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de lever (LECs) LECS-server op basis van de per cel. Daarom geoptimaliseerd we een methode voor de spijsvertering en de kleuring van de lever om te evalueren van de LEC-bevolking in de lever. Wij zijn ervan overtuigd dat de hier geschetste methode nuttig voor de identificatie en de isolatie van de LECS-server uit de lever zijn zal en ons begrip van hoe de LECS-server op de lever communicatie reageren zal versterken.

Studies analyseren lever lymfatische hebben hoofdzakelijk immunohistochemistry gebruikt aan het kwantificeren van de frequentie en de diameter van de lymfevaten in de lever. Echter, deze methode niet mogelijk voor de evaluatie van de LECS-server op basis van de cel-door-cel of voor de expressie van meerdere markeringen, cytokines, chemokines of transcriptiefactoren. Dus we vroegen of lever LECs kon worden geïsoleerd uit de lever en geëvalueerd aan de hand van stroom cytometry. Vorige we...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in lymfe- en levervelden, zoals hoe lymfatische endotheelcellen, of LECs, reageren op specifieke stimuli en hoe dat bijdraagt aan ziektepathogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we leverlymfatische endotheelcelfenotype en functie per cel kunnen evalueren en kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen na celsordeing. Hoewel deze methode inzicht kan geven in leverlymfatische biologie, kan het ook worden gebruikt om lymfe- endotheelcellen uit verschillende weefsels te evalueren, zoals huid- en borstklier.Het aantonen van de procedure zal Jeffrey Finlon zijn, een professionele onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Om een eencellige suspensie van geïsoleerde levercellen voor te bereiden, begin met het besproeien van de muis met zeventig procent ethanol en het vastzetten van de poten naar een dissectiebord. Gebruik dissectie schaar om de huid te snijden ongeveer een centimeter boven de anus en gebruik getande tangen om de huid weg te tillen van het lichaam.Steek de schaartips tussen de huid en het buikvlies en open de schaar om de weefsels te scheiden voordat u de huidincisie tot aan de nek voortzet. Zet de huid vast aan de dissectiebord onder elke voorpoot en boven elke achterpoot en trek de buikvlieszak omhoog om de incisie naar de nek uit te breiden. Pak de lobben van de lever en snijd net onder het borstbeen om dissectie rond de lever mogelijk te maken.Breng het orgel vervolgens over in vier milliliter van Click's EHAA-medium. Gebruik de scalpel om de lever te snijden in ongeveer een millimeter diameter stukken en verteren de stukken in vijfhonderd microliter van vers bereide spijsvertering oplossing en vijfhonderd microliter van DNase 1. Na vijftien minuten op zevenendertig graden Celsius, gebruik maken van een vijfhonderd milliliter pipet om de weefsels grondig te mengen en de container terug te keren naar de couveuse voor nog eens vijftien minuten.Breng aan het einde van de incubatie het verteerde monster over via een honderd micron zeef in een conische buis van vijftig milliliter en gebruik de zuiger van een spuit van één milliliter om de resterende stukken weefsel voorzichtig door het gaas te drukken. Was het filter met vijf milliliter isolatiebuffer en druk het resterende weefsel voorzichtig door de zeef. Verzamel de geïsoleerde levercellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in vier milliliter rode bloedcellysebuffer.Na vijf minuten bij kamertemperatuur, was de cellen in tien milliliter isolatiebuffer en tel de cellen op de hemocytometer om het volledige leveraantal te bepalen. Stel de pellet opnieuw op in vijf milliliter van twintig procent iodixanol en overlay de celsuspensie met één milliliter PBS. Scheid de cellen door dichtheidgradiëntscheiding en oogst de laag tussen de PBS en de iodixanol.Dan filteren de cellen door een honderd micrometer zeef in een nieuwe vijftig milliliter conische buis. Was de cellen in tien milliliter verse isolatiebuffer en schort de resulterende pellet opnieuw op in vijfhonderd microliter PBS, aangevuld met twee procent foetaal runderserum, of FBS. Na het tellen, aliquot ongeveer vijf keer tien tot de zesde niet-parenchymale cellen in elke controle en experimentele put van een zesennegentig put plaat voor centrifugatie en opnieuw op te schorten de pellets in negentig microliter van PBS plus FBS per goed.Voeg de juiste experimentele en controle primaire antilichaam cocktails aan elke put en vlek alle putten met een geschikte levensvatbaarheid marker. De belangrijkste stap in deze procedure is de juiste titratie van de antilichamen en het gebruik van ice type controles en fluorescentie-1 controles om de kleuring te valideren. Na dertig minuten bij vier graden Celsius, centrifuge wassen de cellen met honderd microliter van PBS plus FBS per goed en breng de cellen van elke put in individuele vijf milliliter ronde stroom cytomemetrie buizen naar een vierhonderd microliter eindvolume van PBS plus FBS per buis.Gebruik vervolgens een klein volume cellen om de laser- en compensatieinstellingen op de stroomcytometer aan te passen en alle gebeurtenissen voor elke buis te lezen. Wanneer alle buizen zijn gelezen, importeer de gegevens in een geschikt analyseprogramma voor stroomtristometrie. Poort op levende cellen op basis van de levensvatbaarheid marker kleurstof waar negatieve expressie wordt beschouwd als live.Poort op de levende cellen op basis van de grootte en granulariteit van de cellen, evenals hun levensvatbaarheid marker kleurstof expressie, gevolgd door gating op de CD45 negatieve CD31 positieve cel populatie met behulp van de juiste isotype controle en fluorescentie-1 gegevens om de positieve en negatieve populaties te bepalen. Dan poort de CD45 negatieve CD31 positieve cellen volgens hun CD16/32 en podoplanin uitdrukking om identificatie van de CD45 negatieve CD31 positief, CD16/32 negatieve podoplanine positieve lymfotische endotheelcelpopulaties, en CD45 negatieve CD31 positief, CD16/32 positieve podoplanin negatieve leverholte endotlier cel populaties. Nadrukkelijke endotheelcellen drukken lymfevat en endotheelhyaluronan één uit, maar niet CD146.Lever geïsoleerde CD31 positieve CD16/32 positieve cellen geïsoleerd zoals aangetoond zijn ook CD146 positief en podoplanin positief, terwijl de CD31 positieve CD16/32 negatieve cellen zijn voornamelijk CD146 negatief en ofwel podoplanin positief of negatief. Positiviteit werd bepaald op basis van fluorescentie-1 kleuring. De leverlymfefatische endotheelcellen zijn CD146 negatief en PDPN positief.Noch de vasculaire endotheel noch murine lever macrofagen uitdrukken podoplanin. Podoplanin kleuring kan ook worden gebruikt om cholangiocyten te onderscheiden van lymfevaten op basis van de verschillende nucleaire structuren van de galwegen en door cytokeratine 7 kleuring. Aangezien alleen lymfe-endotheelcellen co-express vasculaire endotheelgroeifactor receptor 3 en Prospero homeobox eiwit 1 in de lever, deze markers kunnen verder worden gebruikt om de zuiverheid van de gesorteerde lever lymfotische endotheelcel populatie te bevestigen.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om snel te werken en cellen in ijs te houden. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals het sorteren van LEC-populaties om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals transcriptieprofilering van LED's. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van leverspecifieke lymfatische biologie om te onderzoeken hoe lymfatische gevolgen heeft voor leverziekte bij muizen en mensen.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode het moeilijk hebben omdat lymfe-endotheelcellen een zeldzame, geleidelijke populatie in een lever zijn en de methode snel moet worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...