Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Die Autoren möchten den GI und Leber angeborene Immune Programme für finanzielle Unterstützung dieses Projektes danken. B.A.J.T. wird auch von R01 AI121209 finanziert.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
<ol><li>Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien.</li>
	<li>Wärmen Sie die Verdauung Mi...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

Die allgemeine Bedeutung der LECs immun Homöostase und Verordnung ist vor kurzem zum leichten25gekommen. Ein Großteil der veröffentlichten lymphatischen Literatur konzentriert sich auf Haut und Lymphknoten; Allerdings Lymphgefäße findet man überall in den Körper-26 und unser Verständnis ihrer Bedeutung in verschiedenen Organen ist also erforderlich. Hier zeigen wir eine Methode in der LECs in der Leber untersucht werden können auf eine Zelle für Zelle Basis ihren ...

Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber1 und Krankheit2auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs3gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie17LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs18bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.
Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen19, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen18ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 - CD31 + und Podoplanin + (PDPN)16. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 - CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs18) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen20 mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen21) wurden Kandidaten Marker.
Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

In der Leber Lymphgefäße befinden sich innerhalb des Portals Dreiklang, und ihre beschriebene Funktion soll interstitielle Flüssigkeit aus der Leber, die Lymphknoten zu entfernen, wo Zelltrümmer und Antigene befragt werden. Wir sind sehr daran interessiert, zu verstehen wie das lymphatische Gefäßsystem in Entzündung und Immunzelle Funktion innerhalb der Leber beteiligt sein könnten. Jedoch sehr wenig veröffentlicht wurden zur Gründung Verdauung Protokolle für die Isolierung von lymphatische Endothelzellen (LECs) aus der Leber oder spezifischer Marker, die verwendet werden, um die Leber zu bewerten LECs pro Zelle. Daher haben wir eine Methode für die Verdauung und das Beflecken der Leber für die Beurteilung die LEC-Bevölkerung in der Leber optimiert. Wir sind zuversichtlich, dass die hier beschriebene Methode nützlich für die Identifizierung und Isolierung von LECs aus der Leber ist und stärkt unser Verständnis wie LECs auf die Leber Mikroumgebung reagieren.

Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vor...

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Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in Lymph- und Leberfeldern zu beantworten, wie z. B. wie lymphatische Endothelzellen oder LECs auf bestimmte Reize reagieren und wie dies zur Pathogenese bei Krankheiten beiträgt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir den phänotyp und die Funktion der Leberlymphe-Endothelzell-Phänotyp und -funktion pro Zelle bewerten und nach der Zellsortierung für Down-Stream-Anwendungen eingesetzt werden können. Obwohl diese Methode Einblick in die Leberlymphbiologie geben kann, kann es auch verwendet werden, um lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Geweben, wie Haut und Brustdrüse zu bewerten.Demonstriert wird das Verfahren von Jeffrey Finlon, einem professionellen wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor. Um eine einzellige Suspension aus isolierten Leberzellen vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Maus mit siebzig Prozent Ethanol zu besprühen und die Pfoten an einer Sezierplatte zu sichern. Verwenden Sie eine Sezierschere, um die Haut etwa einen Zentimeter über dem Anus zu schneiden und die Haut mit Zahnzangen vom Körper wegzuheben.Legen Sie die Scherenspitzen zwischen der Haut und dem Peritoneum ein und öffnen Sie die Schere, um das Gewebe zu trennen, bevor Sie den Hautschnitt bis zum Hals fortsetzen. Befestigen Sie die Haut an der Sezierplatte unter jedem Vorderglied und über jedem Hinterglied, und ziehen Sie den Peritonealsack nach oben, um den Schnitt in Richtung des Halses zu verlängern. Greifen Sie die Lappen der Leber und schneiden Sie direkt unter dem Brustbein, um eine Zerlegung um die Leber zu ermöglichen.Dann übertragen Sie das Organ in vier Milliliter von Clicks EHAA-Medium. Verwenden Sie das Skalpell, um die Leber in etwa einen Millimeter Durchmesser Stücke zu schneiden und verdauen Sie die Stücke in fünfhundert Mikroliter frisch zubereitete Verdauungslösung und fünfhundert Mikroliter DNase 1. Nach fünfzehn Minuten bei siebenunddreißig Grad Celsius, verwenden Sie eine fünfhundert Milliliter Pipette, um das Gewebe gründlich zu mischen und den Behälter für weitere 15 Minuten in den Inkubator zurück.Am Ende der Inkubation die verdaute Probe durch ein hundert Mikron Sieb in ein fünfzig Milliliter konisches Rohr übertragen und den Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze verwenden, um die restlichen Gewebestücke vorsichtig durch das Netz zu drücken. Waschen Sie den Filter mit fünf MilliliterN Isolationspuffer und drücken Sie das verbleibende Gewebe vorsichtig durch das Sieb. Sammeln Sie die isolierten Leberzellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in vier Millilitern roter Blutkörperchen Lysepuffer wieder auf.Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen in zehn Milliliter Isolationspuffer waschen und die Zellen auf dem Hämozytometer zählen, um die volle Leberzahl zu bestimmen. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter n.20 Prozent Iodixanol wieder auf und überlagern Sie die Zellsuspension mit einem Milliliter PBS. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradiententrennung und ernten Sie die Schicht zwischen dem PBS und dem Iodixanol.Dann filtern Sie die Zellen durch ein hundert Mikrometer Sieb in eine neue fünfzig Milliliter konische Röhre. Waschen Sie die Zellen in zehn Milliliter nfrischem Isolationspuffer und setzen Sie das resultierende Pellet in fünfhundert Mikroliter PBS wieder auf, ergänzt durch zweiprozentige fetale Rinderserum oder FBS. Nach dem Zählen, aliquot etwa fünf mal zehn bis die sechste nicht-parenchymale Zellen in jeder Kontrolle und experimentellen Brunnen einer neunundneunzig Brunnenplatte für zentrifugation und re-suspend die Pellets in neunzig Mikroliter PBS plus FBS pro Brunnen.Fügen Sie die entsprechenden experimentellen und kontrollierenden Primärantikörper-Cocktails zu jedem Brunnen hinzu und färben Sie alle Brunnen mit einem geeigneten Lebensfähigkeitsmarker. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die richtige Titration der Antikörper und die Verwendung von Eistyp-Kontrollen und Fluoreszenz-1-Kontrollen, um die Färbung zu validieren. Nach dreißig Minuten bei vier Grad Celsius waschen Zentrifuge die Zellen mit hundert Mikroliter PBS plus FBS pro Brunnen und übertragen die Zellen von jedem Bohrplatz in einzelne Fünf-Milliliter-Rund-Boden-Flow-Zytometrie-Röhren auf ein vierhundert Mikroliter Endvolumen von PBS plus FBS pro Tube.Verwenden Sie dann ein kleines Volumen von Zellen, um die Laser- und Kompensationseinstellungen auf dem Durchflusszytometer anzupassen und alle Ereignisse für jede Röhre zu lesen. Wenn alle Rohre gelesen wurden, importieren Sie die Daten in ein entsprechendes Analyseprogramm für die Durchflusszytometrie. Gate auf lebenden Zellen basierend auf der Lebensfähigkeit Marker Farbstoff, wo negative Expression als lebend betrachtet wird.Gate auf den lebenden Zellen basierend auf der Größe und Granularität der Zellen sowie ihrer Lebensfähigkeit Marker Farbstoffexpression, gefolgt von Gating auf der CD45 negative CD31 positive Zellpopulation mit der entsprechenden Isotyp-Kontrolle und Fluoreszenz-1-Daten, um die positiven und negativen Populationen zu bestimmen. Dann gate die CD45 negative CD31 positive Zellen nach ihrer CD16/32 und Podoplanin-Expression, um die Identifizierung der CD45 negative CD31 positive, CD16/32 negative Podoplanin positive lymphatische endotheliale, und CD45 negative CD31 positive, CD16/32 positive Podoplanin negative Leber sinusoidal endotheliale Zellpopulationen zu ermöglichen. Emphatische Endothelzellen drücken lymphatische Gefäß und endotheliale Hyaluronan ein, aber nicht CD146.Leberisolierte CD31-positive CD16/32-positive, wie gezeigte cd146-positive und podoplanin-positive, während die CD31-positiven CD16/32-Negativzellen in erster Linie CD146-negativ und entweder podoplaninpositiv oder negativ sind. Die Positivität wurde auf der Grundlage der Fluoreszenz-1-Färbung bestimmt. Die Leberlymphatische Endothelzellen sind CD146 negativ und PDPN-positiv.Weder das vaskuläre Endothel noch die murinen Lebermakrophagen drücken Podoplanin aus. Podoplanin Färbung kann auch verwendet werden, um Cholangiozyten von Lymphgefäßen basierend auf den unterschiedlichen kerntechnischen Strukturen der Gallengänge sowie durch Cytokeratin 7 Färbung zu unterscheiden. Da nur lymphatische Endothelzellen den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor 3 und das Prospero-Homeobox-Protein 1 in der Leber ko-expressieren, können diese Marker weiter verwendet werden, um die Reinheit der sortierten leberlymphen Endothelzellpopulation zu bestätigen.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell zu arbeiten und Zellen auf Eis zu halten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Flusssortierung von LEC-Populationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. transkriptionelle Profilerstellung von LECs. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der leberspezifischen Lymphbiologie, um zu erforschen, wie Lymphatik Lebererkrankungen bei Mäusen und Menschen beeinflusst.Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird kämpfen, weil lymphatische Endothelzellen sind eine seltene, allmähliche Bevölkerung in einer Leber und die Methode muss schnell durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

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Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

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The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

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In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...