Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

המחברים רוצה להודות GI של תוכניות החיסון מולדים בכבד לתמיכה כספית של פרויקט זה. B.A.J.T. גם ממומן על ידי R01 AI121209.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של הקמפוס הרפואי של Anschutz אוניברסיטת קולורדו.
1. הכנת החומרים
<ol><li>להפוך את פתרון 5 מ"ג/מ"ל של DNase. אני בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>להכין תערובת העיכול על-ידי הוספת 5,000 U/mL של collagenas...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

החשיבות הכללית של LECs הומאוסטזיס המערכת החיסונית, רגולציה לאחרונה הובא אור25. רוב הספרים שפורסמו הלימפה מתמקד העור ואת בלוטות הלימפה; עם זאת, lymphatics פזורים ברחבי הגוף26 ו, לכן, נדרש הבנתנו את החשיבות של איברים שונים. הנה אנחנו מראים שיטה שבה ניתן יהיה ללמוד LECs בכבד על ?...

התפקיד של כלי הלימפה LECs בכבד אינה מובנת היטב. בעוד כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים הפורטל של הכבד1 ולהתרחב במהלך המחלה2, מעט מאוד מובנת לגבי תפקוד ו פנוטיפ של LECs בתוך הכבד. עם גילוי סמנים הנמצאים בעיקר על LECs3, ימלא החשיבות של תאים אלה בתוך גומחות רקמות שונות בהומאוסטזיס ומחלות פער משמעותי בהבנה שלנו. LECs יש תפקיד מרכזי בשמירה על סובלנות היקפיים הצומת לימפה, גידולים גרורות באמצעות אינטראקציה ישירה עם T תאים4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs הצומת לימפה יכול לקדם חיסון הגנתי דרך האינטראקציות שלהם עם נדידת תאים דנדריטים14,15,16. לכן, ישנם תפקידים מרובים LECs אשר עשויים להיות ספציפיים ברקמות ואינטראקציות שבו הם נמצאים. עם זאת, מעט מאוד מובנת על איך LECs אינטראקציה עם תאים חיסוניים בתוך הרקמה או איך LECs פועלים מערכות איברים שונים; לפיכך, הערכת LECs על בסיס לכל תא בתוך הכבד או איברים אחרים עשויים להוביל ההתקדמות איך LECs תוכנית חסינות רקמות ספציפיות. אף רוב הספרים המתמקד LECs בכבד מיקרוסקופ כדי להמחיש LECs שימוש אחד או שני סמנים ומורפולוגיה17, מעט מאוד נעשה להעריך באופן ספציפי LECs על בסיס תא על-ידי התא באמצעות cytometry זרימה, מחקר אחד בכל זאת להעריך את ההבדלים בין תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSECs) LECs18. היכולת לנתח לץ אוכלוסיות בכבד על ידי cytometry זרימה מאפשר מחקר מעמיק של פנוטיפ לץ במהלך הומאוסטזיס נורמלי או מחלה.
כדי להעריך את LECs על ידי cytometry זרימה, נדרשים מספר סמני פני השטח. בדרך כלל, LECs הם דמיינו ידי הביטוי של גנים homeobox הקשורות פרוספרו 1 (Prox-1), קולטן חומצה היאלורונית אנדותל כלי הלימפה 1 (LYVE1) או צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 3 (VEGFR3) באמצעות מיקרוסקופ. עם זאת, בכבד, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת LECs. Prox-1 מבוטא באופן נרחב על-ידי hepatocytes במהלך פיתוח בכבד, התחדשות, פציעה19, LYVE1 ו- VEGFR3 באים לידי ביטוי על ידי תאי אנדותל כבד sinusoidal18. הצומת לימפה, LECs מזוהים באמצעות cytometry זרימה כמו אשכולות של בידול (CD) CD45 - CD31 +, podoplanin + (PDPN)16. עם זאת, גישה זו היא יותר מידי מינימלית כדי לבודד LECs בכבד מאז CD45 - CD31 + תאים ללכוד תאי אנדותל, האוכלוסייה הדומיננטית של תאי אנדותל כלי הדם בכבד הם LSECs. לפיכך, סמנים אחרים נדרשים כדי להבחין בין האוכלוסייה לץ נדיר מהאוכלוסייה LSEC שופע. CD16/32 (לידי ביטוי LSECs בוגר18) והן CD146 (נפוץ תא אנדותל כלי הדם סמן זה יוכפל לאחר המרתו לידי בתוך sinusoids הכבד תאי אנדותל sinusoidal הכבד20 עם מעט שום הבעה על ידי הלימפה תאי אנדותל21) היו הסמנים המועמד.
לכן, אנחנו אופטימיזציה שיטה אנליטית והצגה של LECs בכבד באמצעות את לעיל סמנים CD45, CD31, CD146, CD16/32, PDPN עבור cytometry זרימה. אנו מתארים את השימוש collagenase הרביעי DNase 1, ההפרדה המכני לעיכול רקמת הכבד להשעיה תא בודד. אנו מתארים גם את השימוש iodixanol דחיסות צבע עבור הבידוד של תאים שאינם parenchymal (NPC), כדי לסלק פסולת הסלולר. לבסוף, באמצעות מספר סמני, נוכל לקבוע האסטרטגיה המגביל ביותר cytometry זרימה אופטימלית לזהות LECs מן הכבד עם PDPN כמו דה מרקר הדומיננטית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

בתוך הכבד, כלי הלימפה נמצאים בתוך הטראיידים פורטל, תפקידם המתואר הוא להסיר את נוזל בין-תאי הכבד אל קשרי הלימפה איפה להיות סקר פסולת הסלולר ו אנטיגנים. . אנחנו מאוד מעוניינים להבין כיצד להערכת הלימפה מעורבים דלקת ותפקוד תא החיסון בתוך הכבד. עם זאת, מעט מאוד שפורסם הקמת מערכת העיכול פרוטוקולים עבור בידודו של תאי אנדותל הלימפה (LECs) של הכבד או סמני ספציפי יכול לשמש כדי להעריך את הכבד LECs על בסיס לכל תא. לכן, אנחנו אופטימיזציה לפעולת העיכול, מכתים של הכבד על מנת להעריך את האוכלוסייה לץ בכבד. אנו בטוחים כי השיטה שמפורטות כאן יהיה שימושי עבור זיהוי ובידוד של LECs מן הכבד, תחזק את ההבנה שלנו של איך LECs להגיב microenvironment הכבד.

לימודי ניתוח lymphatics בכבד בעיקר השתמשו אימונוהיסטוכימיה כדי quantitate את התדירות ואת קוטר של כלי הלימפה בכבד. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת עבור הערכת LECs על בסיס תא-על ידי תאים-תאים או ביטוי של מספר סמנים, ציטוקינים, נוגדנים או גורמי שעתוק. לכן, שאלנו אם הכבד LECs יכול להיות מבודד מן ?...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדות הלימפה והכבד, כגון כיצד תאים אנדותל הלימפה, או LECs, להגיב לגירויים ספציפיים וכיצד זה תורם פתוגנזה המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להעריך פנוטיפ תא אנדותל לימפתי בכבד ולתפקד על בסיס לכל תא, והוא יכול לשמש עבור יישומים במורד הזרם לאחר מיון התא. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לביולוגיה הלימפתית בכבד, זה יכול לשמש גם כדי להעריך תאים אנדותל הלימפה מרקמות שונות, כגון העור ואת בלוטת החלב.הוכחת ההליך תהיה ג'פרי פינלון, עוזר מחקר מקצועי מהמעבדה שלי. כדי להכין השעיה חד-תאית מתאי כבד מבודדים, התחל בריסוס העכבר באתנול של שבעים אחוז, ואבטחת הכפות ללוח ניתוח. השתמש מספריים ניתוח לחתוך את העור על סנטימטר אחד מעל פי הטבעת ולהשתמש ממטרים שיניים כדי להרים את העור מן הגוף.הכנס את קצות המספריים בין העור לצפיה ופתח את המספריים כדי להפריד את הרקמות לפני שתמשיך את חתך העור עד הצוואר. אבטחו את העור ללוח הניתוח מתחת לכל רגליים ומעל כל אחורי, ומושכים את שק ההברעה כלפי מעלה כדי להאריך את החתך לכיוון הצוואר. לתפוס את האונות של הכבד לחתוך ממש מתחת עצם החזה כדי לאפשר ניתוח סביב הכבד.לאחר מכן העבר את האיבר לארבעה מיליליטר של מדיום EHAA של קליק. השתמש באזמל כדי לחתוך את הכבד לחתיכות בקוטר של כמילימטר ולעכל את החלקים ב500 microliters של פתרון עיכול מוכן טרי וחמש מאות microliters של DNase 1. לאחר רבע שעה ב-37 מעלות צלזיוס, יש להשתמש בצינור של 500 מיליליטר כדי לערבב את הרקמות ביסודיות ולהחזיר את המיכל לאנקובטור למשך רבע שעה נוספת.בסוף הדגירה, להעביר את המדגם מתעכל דרך מסננת מאה מיקרון לתוך צינור חרוט חמישים מיליליטר ולהשתמש בוכנה ממזרק מיליליטר אחד כדי ללחוץ בעדינות את חתיכות הנותרות של רקמה דרך רשת. לשטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר של חיץ בידוד בעדינות ללחוץ על כל הרקמה הנותרת דרך מסננת. לאסוף את תאי הכבד מבודדים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בארבעה מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום.לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים בעשרה מיליליטר של חיץ בידוד לספור את התאים על hemocytometer כדי לקבוע את ספירת הכבד המלאה. להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של יודיקסנול עשרים אחוז ולכסות את ההשעיה התא עם מיליליטר אחד של PBS. להפריד את התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות לקצור את השכבה בין PBS לבין יודיקסנול.ואז לסנן את התאים דרך מסננת מיקרומטר מאה לתוך צינור חרוט חמישים מיליליטר חדש. לשטוף את התאים בעשרה מיליליטר של חיץ בידוד טרי ולהשעות מחדש את גלולה וכתוצאה מכך 500 microliters של PBS, בתוספת שני אחוזים סרום בקר עוברי, או FBS. לאחר הספירה, aliquot כ חמש פעמים עשר לתאים הלא-על-טבעיים השישי לתוך כל שליטה וגם ניסיונית של צלחת באר תשעים ושש עבור צנטריפוגה מחדש להשעות את כדורי 90 microliters של PBS בתוספת FBS לגם.מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים הראשוני הניסיוני המתאים ושולטים בכל באר ומכתימים את כל הבארות בסמן כדאיות מתאים. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא טיטרציה נכונה של הנוגדנים ושימוש בפקדי סוג קרח ובקרות פלואורסצנטיות-1 כדי לאמת את הכתמים. לאחר שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה לשטוף את התאים עם מאה microliters של PBS בתוספת FBS ל הבאר ולהעביר את התאים מכל באר לתוך צינורות ציטומטריה זרימה עגולה-תחתונה בודדים חמישה מיליליטר לנפח סופי של 400 מיקרוליטר של PBS בתוספת FBS לצינור.לאחר מכן, השתמש בנפח קטן של תאים כדי להתאים את הגדרות הלייזר והפיצוי על ציטומטר הזרימה ולקרוא את כל האירועים עבור כל צינור. כאשר כל הצינורות נקראו, לייבא את הנתונים לתוכנית ניתוח cytometry זרימה מתאימה. שער על תאים חיים המבוססים על צבע סמן הכדאיות שבו ביטוי שלילי נחשב חי.שער על התאים החיים בהתבסס על הגודל והצפיפות של התאים, כמו גם ביטוי צבע סמן הכדאיות שלהם, ואחריו gating על CD45 שלילי CD31 אוכלוסיית תאים חיוביים באמצעות בקרת איזוטיפ מתאימה ונתונים פלואורסצנטיים-1 כדי לקבוע את האוכלוסיות החיוביות והשליליות. לאחר מכן שער CD45 שלילי CD31 תאים חיוביים על פי CD16/32 שלהם ביטוי podoplanin כדי לאפשר זיהוי של CD45 שלילי CD31 חיובי, CD16/32 שלילי podoplanin שלילי אנדותל לימפתי, ו CD45 שלילי CD31 חיובי, CD16/32 חיובי podoplanin שלילי כבד סינוסואידים אנדותל אוכלוסיות תאים אנדותל. תאי אנדותל מודגשים מבטאים כלי לימפה והיאלונון אנדותל אחד, אך לא CD146.כבד מבודד CD31 חיובי CD16/32 תאים חיוביים מבודדים כפי שהודגם הם גם CD146 חיובי podoplanin חיובי, בעוד CD31 חיובי CD16/32 תאים שליליים הם בעיקר CD146 שלילי או podoplanin חיובי או שלילי. החיוביות נקבעה על סמך כתמי פלואורסצנטיות-1. תאי ה אנדותל הלימפה הכבד הם CD146 שלילי PDPN חיובי.לא אנדותל כלי הדם ולא מקרופאגים כבד מורין אקספרס podoplanin. כתמים Podoplanin יכול לשמש גם כדי להבחין cholangiocytes מכלי הלימפה מבוסס על מבנים גרעיניים ברורים של צינורות המרה, כמו גם על ידי כתם cytokeratin 7. כמו רק תאים אנדותל הלימפה שיתוף להביע קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 3 ו חלבון הומאובוקוז Prosperobox 1 בכבד, סמנים אלה יכולים לשמש עוד יותר כדי לאשר את הטוהר של אוכלוסיית תאי האנדרותל הלימפתיים בכבד ממוין.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולשמור תאים על קרח. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו מיון זרימה של אוכלוסיות LEC ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון פרופיל שעתוק של LECs. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הלימפתית הספציפית לכבד כדי לחקור כיצד הלימפה משפיעה על מחלות כבד בעכברים ובבני אדם.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי תאים אנדותל הלימפה הם נדיר, אוכלוסייה הדרגתית בכבד ואת השיטה צריכה להתבצע במהירות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...