Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke GI og leveren medfødte immunsystemet programmer for økonomisk støtte til dette prosjektet. B.A.J.T. er også finansiert av R01 AI121209.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Colorado Anschutz medisinsk Campus.
1. utarbeidelsen av materialet
<ol><li>Lage en 5 mg/mL løsning av DNase I fosfat-bufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Gjøre en fordøyelsen blanding ved å legge til 5000 U/mL collagenase IV Klikk EHAA media.</li>
	<li>Varm fordøyelsen blanding ved 37 ° C i 30 min før bruk.</li>
	<li>Gjøre en i...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

Generelle betydningen av LECs i immun homeostase og regulering har nylig kommet til lys25. Mye av publiserte lymfatisk litteraturen fokuserer på huden og lymfeknuter; imidlertid lymfekar finnes i hele kroppen26 , og dermed vår forståelse av deres betydning i ulike organer er nødvendig. Her viser vi en metode der LECs i leveren kan studeres celle for celle for å forstå deres samtidige gjengivelsen av forskjellige overflate markører, cytokiner, chemokines og intracellu...

Rollen lymfekar og LECs i leveren er ikke godt forstått. Mens lymfekar finnes innenfor portalen triaden av leveren1 og utvide under sykdom2, er lite forstått om funksjonen og fenotypen av LECs i leveren. Med oppdagelsen av indikatorer som finnes på LECs3, fyller betydningen av disse cellene i ulike vev nisjer i homeostase og sykdom en betydelig gap i vår forståelse. LECs spiller en viktig rolle i å opprettholde perifere toleranse lymfeknute og metastatisk svulster av samhandler direkte med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfeknute kan fremme beskyttende immunitet via deres samhandling med vandrende dendrittiske celler14,15,16. Derfor finnes det flere roller for LECs som kan være spesifikk for vev og interaksjoner som de er til stede. Imidlertid forstått lite om hvordan LECs sammen med immunceller i vev eller hvordan LECs fungerer i ulike organsystemer; Dermed kan evaluere LECs på per celle basis i leveren eller andre organer føre til fremskritt i hvordan LECs programmet vev-spesifikke immunitet. Mens mye av litteraturen som fokuserer på LECs i leveren bruker mikroskopi for å visualisere LECs bruke ett eller to markører og morfologi17, er svært lite gjort for å evaluere LECs på celle for celle basis med flowcytometri, men en studie vurdere forskjellene mellom leveren sinusformet endotelceller (LSECs) og LECs18. Å kunne analysere LEC populasjoner i leveren av flowcytometri tillater fordypning i LEC fenotypen under normale homeostase eller sykdom.
For å evaluere LECs av flowcytometri, er flere overflate markører nødvendig. LECs er vanligvis visualisert uttrykk for prospero-relaterte homeobox 1 (Prox-1), lymfatisk fartøy endothelial hyaluronan reseptor 1 (LYVE1) eller vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 3 (VEGFR3) bruker mikroskopi. Men i leveren er uttrykk for disse markørene ikke begrenset til LECs. Prox-1 er mye uttrykt av hepatocytter under leveren utvikling og regeneration skade19, og LYVE1 og VEGFR3 er uttrykt av leveren sinusformet endotelceller18. I lymfeknute, LECs identifiseres med flowcytometri som klynger av differensiering (CD) CD45, CD31 + og podoplanin + (PDPN)16. Men er denne tilnærmingen for minimal isolere LECs i leveren siden CD45 - CD31 + celler vil fange endotelceller, og den dominerende befolkningen vaskulær endotelial celler i leveren er LSECs. Dermed for andre markører å skille sjeldne LEC befolkningen fra rikelig LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttrykt av eldre LSECs18) og CD146 (en vanlig vaskulær endotelial celle markør som er hovedsakelig uttrykt i leveren sinusoids av leveren sinusformet endotelceller20 med liten eller ingen uttrykk av lymfatiske endotelceller21) var kandidat markører.
Derfor optimalisert vi en metode for å isolere og visualisere LECs i leveren bruker ovenfor markører, CD45, CD31, CD146, CD16/32, og PDPN for flowcytometri. Vi beskriver bruk av collagenase IV, DNase 1 og mekanisk separasjon for leveren vev fordøyelsen en enkeltcelle suspensjon. Vi beskriver også bruk av iodixanol tetthet gradert for isolering av ikke-parenchymal celler (NPC) og å eliminere mobilnettet rusk. Til slutt fastslå bruker flere indikatorer, vi den optimale flyt cytometri gating strategien for å identifisere LECs fra lever med PDPN som den dominerende markøren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

Lymfekar finnes innenfor portalen triad leveren, og deres beskrevet funksjon er å fjerne interstitiell væske fra lever til lymfeknutene der mobilnettet rusk og antigener kan undersøkes. Vi er svært interessert i å forstå hvordan den lymfatiske blodkar kan være involvert i betennelser og immun celle funksjon i leveren. Men lite har blitt publisert etablering fordøyelsen protokoller for isolering av lymfatisk endotelceller (LECs) fra leveren eller spesifikke indikatorer som kan brukes til å evaluere lever LECs på per celle basis. Derfor optimalisert vi en metode for fordøyelsen og flekker av leveren for å vurdere LEC befolkningen i leveren. Vi er sikker på at metoden skissert her vil være nyttig for identifisering og isolering av LECs fra leveren og vil styrke vår forståelse av hvordan LECs reagerer på leveren microenvironment.

Studier analysere leveren lymfekar har primært brukes immunohistochemistry for å quantitate frekvensen og diameteren på lymfekar i leveren. Men tillater denne metoden ikke for evaluering av LECs på en celle-for-celle-basis eller uttrykk for flere indikatorer, cytokiner, chemokines eller transkripsjonsfaktorer. Derfor vi spurte om lever LECs kan være isolert fra leveren og vurdert flowcytometri. Tidligere arbeid isolere lymfeknute LECs ble utført ved hjelp av Liberase DL (collagenase...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøyelsen av Murine leveren for en flyt Cytometric analyse av lymfatisk endotelceller

Målet med denne protokollen er å identifisere lymfatisk endothelial celle populasjoner i leveren bruker beskrevet markører. Vi benytter collagenase IV og DNase og en mild hakking av vev, kombinert med flowcytometri, for å identifisere forskjellige innbyggere lymfatisk endotelceller.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i lymfatiske og leverfelt, for eksempel hvordan lymfatiske endotelceller, eller LECer, reagerer på spesifikke stimuli og hvordan det bidrar til sykdomspatogenese. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan evaluere leverlymfefenotisk endotelcellefenotype og funksjon per cellebasis, og kan brukes til down-stream applikasjoner etter cellesortering. Selv om denne metoden kan gi innsikt i leverlymfatisk biologi, kan den også brukes til å evaluere lymfatiske endotelceller fra forskjellige vev, som hud og brystkjertel.Å demonstrere prosedyren vil være Jeffrey Finlon, en profesjonell forskningsassistent fra laboratoriet mitt. For å forberede en encellede suspensjon fra isolerte leverceller, begynn med å sprøyte ned musen med sytti prosent etanol, og sikre potene til et disseksjonsbrett. Bruk disseksjonsaks for å kutte huden omtrent en centimeter over anus og bruk tannet tang for å løfte huden bort fra kroppen.Sett inn saksetipsene mellom huden og bukhinnen og åpne saksen for å skille vevet før du fortsetter hud snittet opp til nakken. Fest huden til disseksjonsbrettet under hver forben og over hver baklimb, og trekk peritoneal sekken oppover for å utvide snittet mot nakken. Grip fliker av leveren og kutt like under brystbenet for å tillate disseksjon rundt leveren.Deretter overfører orgelet til fire milliliter av Click's EHAA medium. Bruk skalpellen til å kutte leveren i omtrent en millimeter diameter stykker og fordøye bitene i fem hundre mikroliter av nylaget fordøyelsesløsning og fem hundre mikroliter av DNase 1. Etter femten minutter ved trettisyv grader Celsius, bruk en fem hundre milliliter pipet for å blande vevet grundig og returnere beholderen til inkubatoren i ytterligere femten minutter.På slutten av inkubasjonen, overføre den fordøyde prøven gjennom hundre mikron sil til en femti milliliter konisk rør og bruke stempelet fra en ett milliliter sprøyte for å forsiktig trykke de resterende delene av vev gjennom nettet. Vask filteret med fem milliliter isolasjonsbuffer og trykk forsiktig på gjenværende vev gjennom silen. Samle de isolerte levercellene ved sentrifugering og re-suspendere pellet i fire milliliter av røde blodlegemer lysis buffer.Etter fem minutter ved romtemperatur, vask cellene i ti milliliter isolasjonsbuffer og telle cellene på hemocytometeret for å bestemme hele levertellingen. Re-suspendere pellet i fem milliliter av tjue prosent iodixanol og overlegge celle suspensjon med en milliliter PBS. Skill cellene ved tetthet gradient separasjon og høste laget mellom PBS og iodixanol.Deretter filtrerer cellene gjennom et hundre mikrometer sil i en ny femti milliliter konisk rør. Vask cellene i ti milliliter frisk isolasjonsbuffer og re-suspendere den resulterende pellet i fem hundre mikroliter pbs, supplert med to prosent fosterbovin serum, eller FBS. Etter telling, aliquot omtrent fem ganger ti til sjette ikke-parenchymale celler i hver kontroll og eksperimentell brønn av en nittiseks brønnplate for sentrifugering og re-suspendere pellets i nitti mikroliter av PBS pluss FBS per brønn.Tilsett passende eksperimentelle og kontrollere primære antistoffcocktailer til hver brønn og beis alle brønnene med en passende levedyktighetsmarkør. Det viktigste trinnet i denne prosedyren er riktig titrering av antistoffene og bruk av istypekontroller og fluorescens-1-kontroller for å validere fargingen. Etter tretti minutter ved fire grader Celsius vasker sentrifuge cellene med hundre mikroliter PBS pluss FBS per brønn og overfører cellene fra hver brønn til individuelle fem milliliter rundbunnsstrømningscytometrirør til et fire hundre mikroliter endelig volum pbs pluss FBS per rør.Deretter bruker du et lite volum celler til å justere laser- og kompensasjonsinnstillingene på strømningssytometeret og lese alle hendelsene for hvert rør. Når alle rørene er lest, importerer du dataene til et passende flytcytometrianalyseprogram. Gate på levende celler basert på levedyktighet markør fargestoff der negativt uttrykk anses levende.Gate på de levende cellene basert på størrelsen og detaljnivået til cellene, samt deres levedyktighet markør fargestoff uttrykk, etterfulgt av gating på CD45 negativ CD31 positiv cellepopulasjon ved hjelp av riktig isotype kontroll og fluorescens-1 data for å bestemme de positive og negative populasjoner. Deretter gate CD45 negative CD31 positive celler i henhold til deres CD16/32 og podoplanin uttrykk for å tillate identifisering av CD45 negative CD31 positiv, CD16/32 negative podoplanin positiv lymfede endotel, og CD45 negative CD31 positiv, CD16/32 positiv podoplanin negative leveren sinusoidale endotelceller. Ettertrykkelige endotelceller uttrykker lymfatisk fartøy og endotelhyaluronan, men ikke CD146.Leverisolerte CD31 positive CD16/32 positive celler isolert som vist er også CD146 positive og podoplanin positive, mens CD31 positive CD16/32 negative celler er primært CD146 negative og enten podoplanin positiv eller negativ. Positivitet ble bestemt basert på fluorescens-1 farging. Leverlymfeiske endotelceller er CD146 negative og PDPN positive.Verken vaskulær endotel eller murine levermakrofager uttrykker podoplanin. Podoplanin farging kan også brukes til å skille kolangiocytter fra lymfatiske kar basert på de distinkte kjernefysiske strukturer av gallekanaler samt av cytokeratin 7 farging. Som bare lymfatiske endotelceller co-uttrykke vaskulær endotelvekstfaktor reseptor 3 og Prospero homeobox protein 1 i leveren, disse markørene kan videre brukes til å bekrefte renheten av den sorterte leverlymfekreften endotelcellepopulasjonen.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å jobbe raskt og holde celler på is. Etter denne fremgangsmåten kan andre metoder som flytsortering av LEC-populasjoner utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel transkripsjonsprofilering av LECer. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen leverspesifikk lymfatisk biologi for å utforske hvordan lymfatiske påvirker leversykdom hos mus og mennesker.Generelt vil personer som er nye på denne metoden slite fordi lymfatiske endotelceller er en sjelden, gradvis populasjon i en lever og metoden må utføres raskt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Ikke-invasiv optisk avbildning av Lymfatisk blodkar av en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolasjon og Flowcytometriske Karakterisering av Murine Small Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolasjon og Flowcytometriske analyse av endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...