Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka de GI och levern medfödd immun program för monetära stöd för detta projekt. B.A.J.T. finansieras också av R01 AI121209.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Colorado Anschutz Medical Campus.
1. beredning av material
<ol><li>Göra en 5 mg/mL lösning av DNAS I fosfatbuffrad saltlösning (PBS).</li>
	<li>Göra en matsmältningen blandningen genom att lägga till 5.000 U/mL kollagenas IV klickas EHAA media.</li>
	<li>Varma matsmältningen blandning vid 37 ° C i 30 min innan användni...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

Totala vikten av LECs i immun homeostas och förordning har nyligen kommit till ljus25. Mycket av den publicerade lymfatiska litteraturen fokuserar på hud och lymfkörtlar; dock lymfkärlen finns i hela kroppen26 och, således, vår förståelse av deras betydelse i olika organ behövs. Här visar vi en metod där LECs i levern kan studeras på en cell för cell grund för att bättre förstå deras samtidiga uttryck för olika yta markörer, cytokiner, chemokiner och intr...

Lymfkärl och LECs roll i levern är inte väl förstått. Medan lymfkärl finns inom portalen triaden av levern1 och expandera under sjukdom2, förstås mycket lite när det gäller funktion och fenotyp av LECs inom levern. Med upptäckten av markörer som finns främst på LECs3, fyller vikten av dessa celler inom olika vävnad nischer i homeostas och sjukdom en viktig lucka i vår förståelse. LECs har en viktig roll i att upprätthålla perifer tolerans i lymfkörteln och metastaserande tumörer genom att interagera direkt med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfkörteln kan främja skyddande immunitet via deras interaktioner med flyttande dendritiska celler14,15,16. Därför finns det flera roller för LECs som kan vara specifika för vävnader och interaktioner där de förekommer. Dock är mycket lite förstås om hur LECs interagerar med immunceller i vävnaden eller hur LECs fungerar i olika organsystem; Således, utvärdera LECs på basis per cell inom levern eller andra organ kan leda till framsteg i hur LECs program vävnadsspecifika immunitet. Medan mycket av den litteratur som fokuserar på LECs i levern använder mikroskopi för att visualisera LECS-servern med hjälp av en eller två markörer och morfologi17, har mycket lite gjorts för att särskilt utvärdera LECs på en cell för cell grund med hjälp av flödescytometri, men en studie utvärdera skillnaderna mellan leverns sinusformig endothelial celler (LSECs) och LECs18. Att kunna analysera LEC populationer i levern av flödescytometri kan den djupgående studien av LEC fenotyp under normala homeostas eller sjukdom.
För att utvärdera LECs av flödescytometri, behövs flera yta markörer. Typiskt, LECs visualiseras genom uttryck av prospero-relaterade homeobox 1 (Prox-1), lymfatiska kärl endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) eller en vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptor 3 (VEGFR3) med mikroskopi. Dock i levern är uttrycket av dessa markörer inte begränsad till LECs. Prox-1 uttrycks allmänt av hepatocyter under levern utveckling, förnyelse och skada19och LYVE1 och VEGFR3 uttrycks av leverns sinusformig endothelial celler18. I lymfkörteln, LECs identifieras med flödescytometri som kluster av differentiering (CD) CD45-, CD31 + och podoplanin + (PDPN)16. Detta tillvägagångssätt är dock alltför minimal att isolera LECs i levern eftersom CD45 - CD31 + celler kommer att fånga endotelceller, och den dominerande befolkningen av vascular endothelial celler i levern är LSECs. Således behövs andra markörer för att skilja sällsynta LEC befolkningen från den rikliga LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttryckt i mogna LSECs18) och CD146 (en gemensam vaskulära endotelceller markör som huvudsakligen som uttrycks inom den leverskada sinusoider av leverns sinusformig endothelial celler20 med liten eller ingen uttryck av lymfatiska endotelceller21) var kandidat markörer.
Därför optimerat vi en metod för att isolera och visualisera LECs i levern med hjälp av den ovan markörer, CD45, CD31, CD146, CD16/32 och PDPN för flödescytometri. Vi beskriver användning av kollagenas IV, DNase 1 och mekanisk separation för levervävnad matsmältningen till en enskild cell suspension. Vi beskriver också användningen av iodixanol täthetlutning för isolering av icke-parenkymal celler (NPC) och att eliminera cellulära skräp. Slutligen fastställa använder flera markörer, vi optimalt flöde flödescytometri Usenets strategin att identifiera LECs från levern med PDPN som den dominerande markören.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

Inom levern, lymfkärl finns inom portalen triaden, och deras beskrivs funktion är att ta bort interstitiell vätska från levern till lymfkörtlarna där cellulära skräp och antigener kan vara tillfrågade. Vi är mycket intresserade av att förstå hur den lymfatiska kärl kan vara inblandade i inflammation och immunceller funktion inom levern. Mycket lite har dock publicerats om inrättande av matsmältningen protokoll för isolering av lymfatiska endotelceller (LECs) från levern eller specifika markörer som kan användas för att utvärdera levern LECs på basis per cell. Därför optimerat vi en metod för matsmältningen och färgning av levern för att utvärdera LEC befolkningen i levern. Vi är övertygade om att den metod som anges här kommer att vara användbart för identifiering och isolering av LECs från levern och stärker vår förståelse av hur LECs bemöta den levern mikromiljö.

Studier analysera lever lymfkärlen har främst använt immunohistokemi för att kvantifiera frekvens och diameter på lymfkärl i levern. Dock tillåter inte denna metod för utvärdering av LECs på basis av cell för cell eller för uttryck av flera markörer, cytokiner, chemokiner eller transkriptionsfaktorer. Därför frågade vi om levern LECs kunde isoleras från levern och utvärderas med hjälp av flödescytometri. Tidigare arbete isolera lymfkörtel LECs utfördes med hjälp av ...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Målet med detta protokoll är att identifiera lymfatiska endotelceller populationer inom levern med beskrivs märkpennor. Vi använder kollagenas IV och DNAS och en skonsam malning av vävnad, kombinerat med flödescytometri, för att identifiera en distinkt befolkning av lymfatiska endotelceller.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i lymfatiska och lever fält, såsom hur lymfatiska endotelceller, eller LECs, svara på specifika stimuli och hur det bidrar till sjukdom patogenes. Den största fördelen med denna teknik är att vi kan utvärdera levern lymfatisk endotelcell fenotyp och funktion på en per cell basis, och kan användas för ned-stream applikationer efter cell sortering. Även om denna metod kan ge insikt i levern lymfatisk biologi, Det kan också användas för att utvärdera lymfatiska endotelceller från olika vävnader, såsom hud och bröstkörtel.Demonstrera förfarandet kommer att Jeffrey Finlon, en professionell forskningsassistent från mitt laboratorium. För att förbereda en encellig suspension från isolerade leverceller, börja med att spruta ner musen med sjuttioprocents etanol och säkra tassarna till en dissekeringstavla. Använd dissekering sax för att skära huden ungefär en centimeter ovanför anus och använda tandade tlyktor för att lyfta huden bort från kroppen.Sätt in saxspetsarna mellan huden och peritoneum och öppna saxen för att separera vävnaderna innan du fortsätter hudens snitt upp till halsen. Säkra huden till dissektionskortet under varje framben och ovanför varje bakkvist, och dra peritoneal säcken uppåt för att förlänga snittet mot halsen. Ta tag i loberna i levern och skär strax under bröstbenet för att tillåta dissektion runt levern.Överför sedan orgeln i fyra milliliter av Click's EHAA medium. Använd skalpell för att skära levern i ungefär en millimeter diameter bitar och smälta bitarna i fem hundra mikroliter av nyberedda matsmältningslösning och fem hundra mikroliter av DNase 1. Efter femton minuter vid trettiosju grader Celsius, använd en fem hundra milliliter pipet att blanda vävnaderna noggrant och returnera behållaren till inkubatorn i ytterligare femton minuter.I slutet av inkubationen överför du det smälta provet genom ett hundra mikronsil i ett femtio milliliter koniskt rör och använd kolven från en milliliterspruta för att försiktigt trycka de återstående vävnadsbitarna genom nätet. Tvätta filtret med fem milliliter isoleringsbuffert och tryck försiktigt eventuell kvarvarande vävnad genom silen. Samla de isolerade levercellerna genom centrifugering och åter upphäva pelleten i fyra milliliter av röda blodkroppar lys buffert.Efter fem minuter i rumstemperatur, tvätta cellerna i tio milliliter isoleringsbuffert och räkna cellerna på hemocytometern för att bestämma hela leverräkningen. Åter upphäva pelleten i fem milliliter av tjugoprocentig iodixanol och överlagra cellen suspension med en milliliter PBS. Separera cellerna genom densitetsgradientseparation och skörda skiktet mellan PBS och iodixanol.Filtrera sedan cellerna genom ett hundra mikrometersil till ett nytt femtio milliliter koniskt rör. Tvätta cellerna i tio milliliter av färsk isolering buffert och åter upphäva den resulterande pelleten i fem hundra mikroliter pbs, kompletteras med två procent fetala nötkreatur serum, eller FBS. Efter räkning, aliquot cirka fem gånger tio till den sjätte icke-parenkymala celler i varje kontroll och experimentell brunn av en nittiosex väl platta för centrifugering och åter upphäva pellets i nittio mikroliter av PBS plus FBS per brunn.Tillsätt lämpliga experimentella och kontrollera primära antikroppar cocktails till varje brunn och färga alla brunnar med en lämplig lönsamhet markör. Det viktigaste steget i detta förfarande är korrekt titrering av antikropparna och användningen av istypskontroller och fluorescens-1-kontroller för att validera färgningen. Efter trettio minuter vid fyra grader Celsius, centrifug tvätta cellerna med hundra mikroliter pbs plus FBS per brunn och överföra cellerna från varje brunn i enskilda fem milliliter rund botten flöde cytometrirör till en fyra hundra mikroliter slutlig volym PBS plus FBS per rör.Sedan, använd en liten volym av celler för att justera laser och kompensationsinställningar på flödescytometern och läsa alla händelser för varje rör. När alla rör har lästs, importera data till en lämplig flöde cytometry analysprogram. Gate på levande celler baserat på livsduglig markör färgämne där negativt uttryck anses leva.Gate på de levande cellerna baserat på storleken och granulariteten hos cellerna samt deras viabilitet markör färgämne uttryck, följt av gating på CD45 negativa CD31 positiva cellpopulationen med hjälp av lämplig isotyp kontroll och fluorescens-1 data för att fastställa de positiva och negativa populationer. Sedan grind cd45 negativa CD31 positiva celler enligt deras CD16/32 och podoplanin uttryck för att möjliggöra identifiering av CD45 negativa CD31 positiva, CD16/32 negativa podoplanin positiva lymfatisk endotel, och CD45 negativa CD31 positiva, CD16/32 positiva podoplanin negativa lever sinusoidal endotel cell populationer. Empatiska endotelceller uttrycka lymfatiska fartyg och endotel hyaluronan en, men inte CD146.Lever isolerade CD31 positiva CD16/32 positiva celler isolerade som visat är också CD146 positiva och podoplanin positiva, medan CD31 positiva CD16/32 negativa celler är främst CD146 negativa och antingen podoplanin positiva eller negativa. Positivitet bestämdes baserat på fluorescens-1 färgning. Levern lymfatiska endotelceller är CD146 negativa och PDPN positiva.Varken den vaskulära endotelet eller murine lever makrofager uttrycka podoplanin. Podoplanin färgning kan också användas för att skilja kolangiocyter från lymfkärl baserat på de distinkta nukleära strukturer gallgångarna samt av cytokeratin 7 färgning. Som endast lymfatiska endotelceller co-express vaskulär endotel tillväxtfaktor receptor 3 och Prospero homeobox protein 1 i levern, dessa markörer kan ytterligare användas för att bekräfta renheten hos den sorterade levern lymfatisk endotelcellspopulation.Samtidigt som du försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att arbeta snabbt och hålla celler på is. Efter denna procedur kan andra metoder som flödessortering av LEC populationer utföras i syfte att svara på ytterligare frågor, såsom transkriptional profilering av LECs. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området leverspecifik lymfbiologi att undersöka hur lymfatik påverkar leversjukdom hos möss och människor.Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom lymfatiska endotelceller är en sällan, gradvis befolkning i en lever och metoden måste utföras snabbt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Icke-invasiv optisk avbildning av det lymfatiska vaskulaturen hos en mus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera perifera mononukleära blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering och Flödescytometriska karakterisering av murina tunntarms lymfocyter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av Human Endocervikala Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...