Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر "سيون" شركة إسرائيلية للتلقيح الاصطناعي، وتربية (حاييم هافيتز، إسرائيل) لمساعدتهم والتعاون، والسيدة لي نا (التكنولوجيات IMV، L'Aigle، فرنسا) للحصول على المساعدة مع أداة الإعداد والتدريب.

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الإسرائيلية عام 1994 للرفق بالحيوان. تم توفير الحيوانات المنوية البقري من شركة إسرائيلية تجارية للتلقيح الاصطناعي، وتربية. وقيمت الدفقات من شيكاغو بولز 11 في هذه الدراسة.
1-الحيوانات المنوية عينة إعداد
ملاحظة:<...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

الحيوانات المنوية إخصاب محتمل يعتمد على عوامل متعددة تعكس نوعيته. تركيزات عالية من المني ونسبة عالية من المني متحركة عالية تدريجيا قد يعتبر السائل المنوي عالية الجودة. ومع ذلك، مثل هذا تقييم لا تأخذ في الاعتبار المعلمات الخلوية والفنية الأخرى. استخدام سيتوميتير ميكروكابيلاري 'مقاعد البد...

سلامة ووظيفة الحيوانات المنوية الأغشية عدد قليل من العوامل التي تشير إلى بقاء الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة. غشاء البلازما يعمل كحاجز بين الأقسام داخل الخلية وخارج الخلية، وبالتالي الحفاظ على توازن ناضح الخلوية1. أي الإجهاد الذي يؤدي إلى الأضرار بسلامة غشاء البلازما قد يضعف التوازن والحد من القدرة على البقاء والتسميد وزيادة موت الخلية. على سبيل المثال، يقلل نعد بقاء الحيوانات المنوية نظراً الأضرار التي لحقت بغشاء البلازما، ونتيجة للتغيرات في درجات الحرارة والضغط التناضحي2. ذكرت سابقا أن تعريض الحيوانات المنوية الثور بتركيزات منخفضة من الملوثات المنقولة مثل والاترازين مبيدات الآفات، وبه ديامينوتشلوروتريازيني المستقلب الرئيسي أو ميكوتوكسين الأفلاتوكسين B1، يقلل من الحيوانات المنوية البقاء1،3 . وكان تحديد هذا بواسطة وسم الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل مع DAPI في تركيبة مع بي، التي تلزم للحمض النووي للخلايا بغشاء البلازما تالفة.
أكروسومي رد فعل (ع) ينطوي على الانصهار الغشاء الخارجي أكروسومي وغشاء البلازما السطحية أسفر عن الإفراج عن الإنزيمات أكروسومال4،5. هذه هي الأحداث الأساسية لاختراق zona pellucida ودمج مزيد من الحيوانات المنوية مع البويضات6. ولذلك، يشكل تقييم سلامة غشاء أكروسومال معلمة مفيدة لتقييم نوعية السائل المنوي وخصوبة الذكور7،،من89. عدة تقنيات الفلورسنت مناسبة للتحقق من سلامة acrosome، فيتك-السلطة الوطنية الفلسطينية أو بسا فيتك8،10. في دراساتنا السابقة، باستخدام أنماط بسا فيتك المصبوغة1،3، تقدم تعاريف دقيقة ل (ط) acrosome سليمة، (ثانيا) تلف غشاء acrosome و (ثالثا) كان رد فعل أكروسومي. في التقرير الحالي، وعلينا تقييم الوضع acrosome استخدام مخصصة للحيوانات المنوية التدفق الخلوي ومقارنة النتائج لتلك باستخدام مجهر الأسفار.
الميتوكوندريا هي العضيات متعدد الوظائف المعنية في، في جملة أمور، ATP التوليف، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وإشارات الكالسيوم والمبرمج. الاختلالات الوظيفية الفيزيولوجية، بما في ذلك العقم الذكور والإناث، ترتبط بتغيير الوظيفة المتقدرية11. يتم ترتيب في ميدبيسي الميتوكوندريا الحيوانات المنوية وتلعب دوراً حاسما في حركية الحيوانات المنوية12. من المقبول أيضا أن غشاء الميتوكوندريا العالية المحتملة (ΔΨm) يرتبط بحركية طبيعية والتسميد عالية القدرة13. وفي المقابل، ΔΨm منخفضة يرتبط بمستوى مرتفع من الأنواع الأكسجين التفاعلية وانخفاض معدل الإخصاب14. على الرغم من ذلك، يمكن أن تحفز الإجهاد الخلوية المركبات البيئية المختلفة، على سبيل المثال اختلال الغدد الصماء، ويؤدي إلى زيادة مؤقتة في ΔΨm، فرط الاستقطاب1،3، وزيادة إنتاج الجذور الحرة، وفي نهاية المطاف، [ابوبتوسس]15. التحقيق الفلورسنت 6، 5، 5 '، 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1) تمكن على سبيل المثال، بدراسة آثار السموم المنقولة على الحيوانات المنوية ΔΨm1،3.
سبيرميوجرامس القياسية، استناداً إلى المعلمات الفسيولوجية والمورفولوجية، ليست جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. أساليب أكثر دقة مطلوبة لضمان جودة الحيوانات المنوية. هنا، نحن نقدم اثنين من الأساليب الممكنة لتحديد نوعية الحيوانات المنوية على أساس تقييمات أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ رباعية متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والفحص المجهري الأسفار، ووصف لنا الدراسات1،3 ومؤخرا استخدمت الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية، في المختبر، وسبق استخدامها من قبل الآخرين16،،من1718.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

سبيرميوجرامس القياسية التي تصف نوعية الحيوانات المنوية معظمها يستند المعلمات الفسيولوجية والمرئية، مثل حجم السائل المنوي وتركيز وحركية والحركة التقدمية، ومورفولوجية الحيوانات المنوية والجدوى. غير أن أيا من هذه التقييمات جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. نظراً لأن الحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة يتوقف على سلامة الغشاء ووظائف داخل الخلايا، قد تمكن التقييم لهذه المعلمات تنبؤ أفضل من اختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. وهنا يصف لنا ثلاثة أساليب مجدية لتقييم جودة الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت الخاصة جنبا إلى جنب مع الأسفار مجهرية أو التدفق الخلوي التحليلات. تحليلات لتقييم سلامة غشاء البلازما باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ويوديد propidium (PI)، سلامة الغشاء أكروسومال باستخدام fluorescein isothiocyanate مترافق بسام بيسوم agglutinin (فيتك-PSA) و سلامة غشاء الميتوكوندريا استخدام 5, 5 ', 6, 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1). وترد أيضا مزيج من هذه الأساليب. على سبيل المثال، استخدام أننيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس). ونحن نعتقد أن هذه المنهجيات، التي تستند إلى دراسة الأغشية المني، مفيدة جداً لتقييم مدى جودة الحيوانات المنوية.

باستخدام الشكل 1 يبين فلوريميتريك المتزامنة التقييم أغشية الحيوانات المنوية (البلازما، أكروسومال و mitochondrial) PI، DAPI، فيتك-PSA وجيمي كارتر-1. تقييم الأغشية الحيوانات المنوية استخدام تلطيخ متزامنة مع أربعة تحقيقات الفلورسنت يسمح، على سبيل المثال، تقييم نسبة ا...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

نقدم هنا، منهجيات لتقييم سلامة غشاء سبيرماتوزوان، ميزة خلوية المرتبطة باختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. يصف لنا ثلاث تقنيات لتقييم فلوريميتريك أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والأسفار الفحص المجهري الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية. وترد أيضا أمثلة للجمع بين المنهجيات.

فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

الهدف من هذه الإجراءات هو تقييم سلامة أغشية الحيوانات المنوية باستخدام مسابير فلورية محددة مقترنة بالمجهر الفلوري أو تحليل تدفق الخلايا. قد تساعد هذه التقنيات في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التكاثر مثل التنبؤ بإمكانيات الإخصاب وجودة عينة الحيوانات المنوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تمكن من إجراء تقييم دقيق لأغشية الحيوانات المنوية المتعددة التي من المعروف أنها ترتبط بإمكانيات تخصيب الحيوانات المنوية.الآثار المترتبة على هذه التقنيات تمتد نحو تشخيص جودة السائل المنوي كما أنها تمكن من تقييم أكثر دقة من بلازما الحيوانات المنوية وسلامة الغشاء acrosome، فضلا عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لبدء هذا الإجراء، الحصول على ما يقرب من 1-6 ملليلتر من السائل المنوي الثور في أنبوب 15 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة. إضافة ستة ملليلتر من المخزن المؤقت NKM قبل warmed إلى 37 درجة مئوية لكل ملليلتر من السائل المنوي.أجهزة الطرد المركزي في 600 مرة ز لمدة ثماني دقائق. كرر الطرد المركزي مرة أو مرتين حتى يكون المُندفع غير واضح. بعد هذا، على الفور تجاهل معظم من فوق، وترك ما يقرب من سنتيمتر واحد من فوق بيليه.تميل بعناية الأنابيب في زاوية 30 درجة في الحاضنة وانتظر 20 إلى 30 دقيقة للسماح للحيوانات المنوية للسباحة. باستخدام micropipette، وإزالة بعناية المليلتر واحد المتبقية من عظمى الذي يحتوي الآن على الحيوانات المنوية motile ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. حافظ على الحيوانات المنوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.أولاً، إعداد كافة الحلول المطلوبة الأسهم كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل 133 ميكرولترات من الحيوانات المنوية المتحركة بتركيز 25 مليون من الحيوانات المنوية لكل ملليلتر إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 17 ميكرولترات من حل العمل DAPI واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.جهاز طرد مركزي في 1،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت NKM إلى بيليه. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من FITC-PSA، واثنين من microliters من JC-1، وثلاثة microliters من PI. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.جهاز طرد مركزي في 1،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 40 ميكرولترات من المخزن المؤقت NKM. ثم نقل 10 ميكرولترات من العينة إلى شريحة زجاجية.تشويه العينة وإضافة غطاء. بعد ذلك، تبدأ على الفور تصور العينة عن طريق المجهر epifluorescence مع هدف 40X وتصفية الثلاثي كما هو مبين في بروتوكول النص، وذلك باستخدام كاميرا رقمية لالتقاط صورة منفصلة لكل مرشح. استخدم خيار الدمج في برنامج الكاميرا لدمج الصور الثلاث التي تم تلقيها من الفلاتر، وحفظ الملف الجديد بتنسيق JPEG.افتح الصورة المدمجة باستخدام أداة الطلاء واستخدم خيار الفرشاة لوضع علامة على الحيوانات المنوية التي تم عدها. بعد ذلك ، تصنيف الحيوانات المنوية على أساس الفلوريسنس المنبعث من كل مسبار ، مع التأكد من تقييم ما لا يقل عن 200 spermatozoa لكل شريحة. يجب أن تظهر كافة الخلايا باللون الأزرق من DAPI.عد الخلايا الميتة، التي تظهر باللون الأرجواني، لتقييم الجدوى. ثم استخدام أنماط من تلطيخ الفلوريسنس لتقييم حالة أكروبسوم. وأخيرا، تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا من خلال التمييز بين الحيوانات المنوية مع ارتفاع إمكانات غشاء الميتوكوندريا التي تظهر منتصف أحمر ملون من الحيوانات المنوية مع انخفاض إمكانات غشاء الميتوكوندريا التي تظهر منتصف الخضراء الملون.عد منتصفات حمراء وخضراء بشكل منفصل وحساب نسبتها. لبدء تقييم سلامة غشاء البلازما، خذ العدد المطلوب من الآبار من مجموعة القدرة على البقاء والتركيز. قم بنقل الآبار إلى قاعدة العمل واغطيها بغطاء مرن لحمايتها من الضوء.إضافة 199 ميكرولترات من محلول المخزنة مؤقتاً لcytometry إلى كل بئر. ثم إضافة ميكرولتر واحد من السائل المنوي المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر والتجانس عن طريق الأنابيب. غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس التدفق باستخدام إعداد قابلية البقاء. للبدء في تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا، أخرج العدد المطلوب من الآبار من مجموعة أنشطة الميتوكوندريا. تحويلها إلى قاعدة العمل.إضافة 10 ميكرولترات من الإيثانول المطلق إلى كل بئر واستخدام ماصة لإعادة تعليق مسحوق موجود داخل البئر. إضافة 190 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني في بئر ومتجانسة عن طريق pipetting. إضافة 0.75 ميكرولترات من المني المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر والتجانس عن طريق الأنابيب.غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس تدفق السيّد باستخدام إعداد نشاط الميتوكوندريا. للبدء في تقييم سلامة الغشاء الأكروزومية ، أخرج العدد المطلوب من الآبار من مجموعة النزاهة الحيوية والمكرة.قم بنقل الآبار إلى قاعدة العمل واغطيها بغطاء مرن لحمايتها من الضوء. إضافة 200 ميكرولترات من محلول المخزن المؤقت لcytometry لكل بئر. ثم إضافة 0.7 ميكرولترات من السائل المنوي المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر وتجانس عن طريق الأنابيب.غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس التدفق باستخدام إعداد البصيرة. في هذه الدراسة، يتم تقييم نوعية السائل المنوي باستخدام تقنيات مختلفة، واحدة منها تقييم أغشية الحيوانات المنوية باستخدام المسابير الفلوروميترية.من الممكن تقييم الاختلافات في نوعية عينة الحيوانات المنوية من حيث سلامة الأغشية. على سبيل المثال، كان السائل المنوي للثيران رقم سبعة نسبة منخفضة نسبيا من الخلايا الميتة، ونسبة منخفضة من الحيوانات المنوية مع acrosome الزائفة رد فعل، وارتفاع إمكانات غشاء الميتوكوندريا بالمقارنة مع السائل المنوي للثور رقم واحد. ثم يتم تقييم العينات لقابلية البقاء والنشاط الميتوكوندريا.تمثل الرسوم البيانية لهذه الأمثلة التمثيلية الحيوانات المنوية غير المُبَرَّد والحطام والحيوانات المنوية المسورة. وتمثل هذه المدرجات أيضا الخلايا القابلة للحياة والميت وتوزيع الحيوانات المنوية إلى غشاء الميتوكوندريا المستقطب والمستقطب. ثم يتم تقييم سلامة acrosome مع مجموعة جاهزة للاستخدام وقراءة مع تدفق القياسات الخلية، وتقسيم المنطقة إلى ثلاث مناطق علامة التي تمثل الخلايا الفلورية المنخفضة لا تذكر مع الخلايا الحمراء غير المطّهية سليمة، والخلايا الفلورية المنخفضة مع جزء ملطخ المتبقية من acrosome، وخلايا الفلورة عالية مع acrosome تعطلت.أثناء محاولة هذه الإجراءات، من المهم التأكد من إعداد عينة الحيوانات المنوية الأولية بشكل صحيح. هذه التقنيات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تقييم جودة الحيوانات المنوية ويمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة مثل الأبقار والدواجن والإنسان. المقارنة بين التقنيتين، وتلطيخ رباعية والتدفق قياس الخلايا لم يدل على وجود اختلافات كبيرة في القدرة على البقاء، وإمكانية غشاء الميتوكوندريا، والسلامة acrosome تكشف أن التقنيات اثنين أنتجت نتائج مطابقة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

تقييم في وقت واحد Cardiomyocyte الحمض النووي تحضير والصيغة الصبغية: طريقة لمساعدة الكمي لCardiomyocyte التجديد ودوران

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

تقييم آثار المركبات على تطوير شبكات عصبونية الفقاريات دالة باستخدام صفائف متعدد القطب الصماء

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

المناولة والمعالجة من الذكور ثعبان (أنغيلا أنغيلا) للنضج الهرموني وتجميد الحيوانات المنوية

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

والرزن موائع جزيئية "تقييم التصاق الكريات البيض" إلى "خلايا بطانية" المستمدة من "الخلايا الجذعية Pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان" (هيبسك-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

تقييم حالة الإخصاب من خلال تتبع المورفولوجيا النووية للنطفو النووي للنطفو في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبوسيس

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...