Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke "SION" israelsk selskab for kunstig befrugtning og opdræt (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjælp og samarbejde og Ms. Li Na (IMV teknologier, L'Aigle, Frankrig) for at få hjælp med opsætning af instrument og uddannelse.

Alle eksperimenterne blev udført efter 1994 israelske retningslinjer for dyrevelfærd. Kvæg sæd blev leveret af kommercielle israelsk selskab til kunstig befrugtning og avl. Ejakulerer 11 tyre blev vurderet i denne undersøgelse.
1. sperm prøve forberedelse
Bemærk: Proceduren er baseret på Roth laboratoriet protokol1,3.
<ol><li>Få ca. 1 – 6 mL af tyresæd i en 15 mL tube ved stuet...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Sperm befrugtning potentielle afhænger af flere faktorer som afspejler dens kvalitet. En høj koncentration af sædceller og en høj andel af meget gradvis motile sædceller kan anses for høj kvalitet sæd. Dog sådan evaluering tager ikke hensyn til andre cellulære og funktionelle parametre. Brug af 'bænk-top' microcapillary flow forskellige kan tilpasses nemt til evaluering af forskellige sperm strukturer ved hjælp af fluorescerende sonder, som tidligere vist af andre17 og demonstreret heri...

Integritet og funktionalitet af sperm membraner er nogle af de faktorer, der angiver sperm levedygtighed og befrugtning potentielle. Plasmamembran fungerer som en sikkerhedsbarriere mellem intracellulære og ekstracellulære rum, dermed bevare cellulære osmotiske balance1. Nogen stress, der inducerer skader på plasma membran integritet kan forringe homøostase, reducere levedygtighed og befrugtning kapacitet og øge celledød. For eksempel reducerer kryopræservering sperm levedygtighed skyldes til skade på sin plasma membran, som følge af ændringer i temperatur og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapporteret at udsætte bull sæd til lave koncentrationer af fødevarebårne kontaminanter som pesticid atrazin, dets vigtigste metabolit diaminochlorotriazine eller mykotoksiner aflatoksin B1, reducerer sperm levedygtighed1,3 . Dette blev bestemt ved mærkning dobbelt-strenget DNA med DAPI i kombination med PI, som binder sig til DNA af celler med en beskadiget plasmamembran.
Acrosome reaktion (AR) indebærer fusion af den ydre acrosome membran og den overliggende plasma membran resulterer i frigivelse af acrosomal enzymer4,5. Disse er væsentlige begivenheder for zona pellucida penetration og yderligere sammenlægning af sperm med oocyt6. Evaluering af acrosomal membran integritet udgør derfor, en nyttig parameter for at evaluere sædkvalitet og mandlige fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er velegnet til kontrol af acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I vores tidligere undersøgelser, ved hjælp af mønstre af FITC-PSA farvning1,3, vi fastsat præcise definitioner for (i) intakt acrosome, (ii) beskadiget acrosome membran og (iii) reagerede acrosome. I den foreliggende betænkning, vi vurdere acrosome status ved hjælp af sæd-dedikeret flowcytometri og sammenligne resultaterne til dem, der bruger Fluorescens mikroskopi.
Mitokondrier er multifunktionelle organeller involveret, blandt andre ting, ATP syntesen, reaktive ilt arter produktion, calcium signalering apoptose. Fysiologiske dysfunktioner, herunder mandlige og kvindelige infertilitet, er forbundet med ændrede mitokondrie funktion11. Sperm mitokondrier er arrangeret i midpiece og spiller en afgørende rolle i sperm motilitet12. Det er blevet godt modtaget, høj mitokondrielle membran potentiale (ΔΨm) er forbundet med normale motilitet og høj befrugtning kapacitet13. Derimod lave ΔΨm er forbundet med en forhøjet niveau af reaktive ilt arter og reduceret befrugtning sats14. Ikke desto mindre kan forskellige miljømæssige forbindelser, for eksempel endokrine disruptorer, fremkalde cellulært stress og føre til en forbigående stigning i ΔΨm, hyperpolarisering1,3, øget produktion af frie radikaler og i sidste ende, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-chlor-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1) giver mulighed for undersøgelse for eksempel virkninger af fødevarebårne toksiner på sæd ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, baseret på fysiologiske og morfologiske parametre, der ikke er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. Mere præcise metoder er nødvendige for at sikre sædkvalitet. Her, vi give to mulige metoder til at bestemme sædkvalitet baseret på vurderinger af sperm membraner: samtidige firedobbelt farvning med specifikke fluorescerende sonder og Fluorescens mikroskopi, beskrevet i vores undersøgelser1,3 og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri, for nylig udnyttet i vores laboratorium, og allerede bruges af andre16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Standard spermiograms der beskriver sædkvalitet er for det meste baseret på de fysiologiske og visuelle parametre, såsom ejakulatvolumen og koncentration, motilitet og progressive motilitet, og sperm morfologi og levedygtighed. Men ingen af disse vurderinger er gode nok til at forudsige sædkvaliteten. I betragtning af at vedligeholdelse af sperm levedygtighed og befrugtning potentielle afhænger membran integritet og intracellulære funktionalitet, kan evaluering af disse parametre aktiverer en bedre forudsigelse af sperm befrugtning kompetence. Her beskriver vi tre mulige metoder til at evaluere sædkvalitet ved hjælp af specifikke fluorescerende sonder kombineret med Fluorescens mikroskopi eller flow flowcytometri analyser. Analyser vurderes plasma membran integritet ved hjælp af 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium Iodid (PI), acrosomal membran integritet ved hjælp af fluorescein isothiocyanat-konjugeret Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) og mitokondrielle membran integritet ved hjælp af 5, 5', 6, 6'-tetra-chlor-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine Iodid (JC-1). Kombinationer af disse metoder er også præsenteret. For eksempel, brug af annexin V kombineret med PI fluorokromer muliggør vurdering af apoptose og beregningen af andelen af apoptotiske sæd (apoptotiske indeks). Vi mener, at disse metoder, som er baseret på undersøge sædcelle membraner, er meget nyttige til vurdering af sædkvalitet.

Figur 1 viser samtidige fluorimetri vurdering af sperm membraner (plasma, acrosomal og mitokondriel) ved hjælp af PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1. Vurdering af sperm membraner ved hjælp af samtidige farvning med fire fluorescerende sonder tillader for eksempel vurdere andelen af sædceller i hver kategori – live vs døde; høj vs lav ΔΨm; intakt vs. beskadiget acrosome — samtidig for hver sædcelle.
<p class="jove_content" fo...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Vi præsenterer her, metoder til at vurdere spermatozoan membran integritet, en cellulær funktion tilknyttet sperm befrugtning kompetence. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetri vurdering af sperm membraner: samtidige farvning med specifikke fluorescerende sonder, Fluorescens mikroskopi og avancerede sæd-dedikeret flowcytometri. Eksempler på kombinerer metoder er også præsenteret.

Fluorimetri teknikker til vurdering af Sperm membraner

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Målet med disse procedurer er at evaluere sædmembraner integritet ved hjælp af specifikke fluorescerende sonder kombineret med fluorescens mikroskopi eller flow cytometri analyse. Disse teknikker kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for reproduktion såsom forudsigelse af befrugtning potentiale og kvaliteten af sædprøve. Den største fordel ved disse teknikker er, at de muliggør præcis evaluering af flere sædmembraner, som er kendt for at associere med sperm befrugtning potentiale.Konsekvenserne af disse teknikker strækker sig mod diagnosticering af ejakulere kvalitet, da det giver mulighed for en mere præcis evaluering af sperm plasma og akrosom membran integritet samt mitokondrielle membran potentiale. For at påbegynde denne procedure opnås ca. en til seks milliliter tyresæd i et 15 milliliterrør ved stuetemperatur. Der tilsættes seks milliliter NKM-buffer, der er forvarmt til 37 grader Celsius, til hver en milliliter sæd.Centrifuge ved 600 gange g i otte minutter. Centrifugering en eller to gange, indtil supernatanten er klar. Efter dette, straks kassere det meste af supernatant, forlader cirka en centimeter af supernatant over pellet.Læn rørerne forsigtigt i en 30 graders vinkel i inkubatoren og vent 20 til 30 minutter for at lade spermatozoer svømme op. Ved hjælp af en mikropipette fjernes den resterende en milliliter supernatant, som nu indeholder den motile spermatozoe, og den overføres til et friskt 1,5 milliliterrør. Hold sædcellerne på 37 grader Celsius, indtil den er klar til brug.Forberedning først alle nødvendige lagerløsninger som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst overføres 133 mikroliter af motile spermatozoer i en koncentration på 25 millioner sædceller pr. milliliter til et nyt 1,5 milliliterrør. Tilsæt 17 mikroliter af DAPI arbejdsløsningen og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Centrifuge ved 1,000 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt 100 mikroliter NKM-buffer til pellets. Dernæst tilsættes 50 mikroliter FITC-PSA, to mikroliter JC-1 og tre mikroliter PI. Inkubere ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Centrifuge ved 1,000 gange g i fem minutter. Kassér supernatanten og opslæm pellet i 40 mikroliter NKM buffer. Overfør derefter 10 mikroliter af prøven til et glasdias.Smør prøven og tilsæt en dækslæd. Efter dette, straks begynde at visualisere prøven ved epifluorescens mikroskopi med en 40X mål og en tredobbelt filter som skitseret i tekstprotokollen, ved hjælp af et digitalt kamera til at fange et separat billede for hvert filter. Brug fletteindstillingen i kamerasoftwaren til at flette de tre billeder, der er modtaget fra filtrene, og gemme den nye fil i JPEG-format.Åbn det flettede billede med maleværktøjet, og brug penselindstillingen til at markere den optalte spermatozoe. Dernæst klassificere spermatozoer baseret på fluorescens udsendes fra hver sonde, og sørg for at evaluere mindst 200 spermatozoer per dias. Alle celler skal være blå fra DAPI'en.Tæl de døde celler, som synes lilla, for at vurdere levedygtigheden. Brug derefter fluorescensmønstrene til at evaluere den akrosome status. Endelig evaluere mitokondrielle membran potentiale ved at skelne spermatozoer med høj mitokondriel membran potentiale, som udviser en rød-plettet midpiece fra spermatozoer med lav mitokondriel membran potentiale, som udviser en grøn-plettet midpiece.Tæl røde og grønne midpieces separat og beregne deres forhold. For at begynde plasmamembranens integritetsevaluering skal du tage det ønskede antal brønde fra levedygtigheds- og koncentrationssættet. Overfør brøndene til arbejdsbasen og dæk dem med et fleksibelt låg for at beskytte dem mod lys.Tilføj 199 mikroliter af bufferopløsning til cytometri til hver brønd. Derefter tilsættes en mikroliter af homogen sæd i en koncentration på 57 millioner celler pr. milliliter til hver brønd og homogeniseres ved pipettering. Dæk pladen med låget og inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Derefter køres prøven gennem flowcytometeret ved hjælp af levedygtighedsindstillingen. For at begynde at vurdere mitokondriel membran potentiale, tage det ønskede antal brønde fra mitokondrielle aktivitet kit. Overfør dem til arbejdsbasen.Tilsæt 10 mikroliter af absolut ethanol til hver brønd og bruge en pipette til at resuspendre pulveret til stede i brønden. Tilsæt 190 mikroliter PBS pr. brønd og homogeniser ved pipettering. Der tilsættes 0,75 mikroliter homogen sæd i en koncentration på 57 millioner celler pr. milliliter til hver brønd, og der homogeniseres ved pipettering.Dæk pladen med låget og inkuberes ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Derefter køres prøven gennem flowcytometeret ved hjælp af mitokondriel aktivitetsindstilling. For at begynde at vurdere akrosomal membran integritet, tage det ønskede antal brønde fra levedygtighed og akronosom integritet kit.Overfør brøndene til arbejdsbasen og dæk dem med et fleksibelt låg for at beskytte dem mod lys. Tilføj 200 mikroliter bufferopløsning til cytometri til hver brønd. Derefter tilsættes 0,7 mikroliter homogen sæd i en koncentration på 57 millioner celler pr. milliliter til hver brønd og homogeniseres ved pipettering.Dæk pladen med låget og inkuberes ved 37 grader Celsius i 45 minutter. Derefter skal du køre prøven gennem flowcytometeret ved hjælp af indsigtsindstillingen. I denne undersøgelse evalueres sædkvaliteten ved hjælp af forskellige teknikker, hvoraf den ene evaluerede sædmembraner ved hjælp af fluormetriske sonder.Det er muligt at vurdere forskellene i sædprøvekvalitet med hensyn til membranintegritet. For eksempel havde ejakuulatet af tyr nummer syv en relativt lav procentdel af døde celler, en lav andel af sædceller med pseudo-reagerede acrosome, og højere mitokondrielle membran potentiale i forhold til ejakulere af tyr nummer et. Prøverne evalueres derefter for levedygtighed og mitokondriel aktivitet.Histogrammer for disse repræsentative eksempler repræsenterer de ikke-neerede spermatozoer og snavs og gated spermatozoer. Disse histogrammer repræsenterer også levedygtige og døde celler og fordelingen af spermatozoer til polariseret og de-polariseret mitokondrielle membran. Den akrosome integritet evalueres derefter med en klar-til-brug kit og læses med flow cytometri, dividere området i tre markør områder, der repræsenterer ubetydelige lav fluorescerende celler med intakt uhæmmet akrosom, lav fluorescerende celler med resterende farvede del af akrosom, og meget fluorescerende celler med forstyrret akrosom.Mens du forsøger disse procedurer, Er det vigtigt at sørge for at forberede korrekt den oprindelige sædprøve. Disse teknikker kan give indsigt i sædkvalitet evaluering og kan anvendes på forskellige organismer såsom kvæg, fjerkræ, og mennesker. En sammenligning mellem de to teknikker, firedobbelt farvning og flowcytometri indikerede ingen signifikante forskelle for levedygtighed, mitokondriel membranpotentiale og den akrosome integritet, der afslørede, at de to teknikker gav matchende resultater.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering af Maternal Vascular Remodeling under graviditet i Mus livmoderen

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering af cardiomyocyte DNA Synthesis og Ploidi: En metode til at hjælpe Kvantificering af cardiomyocyte Regeneration og Omsætning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Vurdering af virkningerne af hormonforstyrrende stoffer på udviklingen af hvirveldyr neurale netværksfunktion ved hjælp af multi elektrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Håndtering og behandling af mandlig europæiske ål (Anguilla anguilla) for hormonelle modning og Sperm kryopræservering

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Mikrofluid analyse til vurdering af leukocyt adhæsion til menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt endotelceller (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering af ultrastrukturelle neuroplasticitet parametre efter i Utero transduktion af udvikle mus hjernen og rygmarven

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Måling sperm vejledning og motilitet i Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktive tarmkanalen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluering af gødskning tilstand ved at spore sperm nuklear morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Anvendelse af musedelhenogenetiske haploid embryonale stamceller som erstatning for sædceller

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...