Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

De auteurs bedank "SION" Israëlische bedrijf voor kunstmatige inseminatie en fokken (Hafetz-Haim, Israël) voor hun hulp en samenwerking, en mevrouw Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Frankrijk) voor hulp bij de installatie van het instrument en de opleiding.

Alle van de experimenten werden uitgevoerd volgens de Israëlische richtsnoeren van 1994 voor het welzijn van dieren. Boviene sperma werd geleverd door Israëlische handelsvennootschap voor kunstmatige inseminatie en fokken. Ejaculeert van 11 stieren werden in deze studie geëvalueerd.
1. sperma proeven voorbereiding
Opmerking: De procedure is gebaseerd op het Roth laboratory's protocol1,3.</p...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Sperma bevruchting potentiële hangt af van meerdere factoren als gevolg van de kwaliteit. Een hoge concentratie van spermatozoïden en een groot aantal zeer geleidelijk motile spermacellen kunnen hoge kwaliteit sperma te worden overwogen. Echter een dergelijke evaluatie doet niet rekening houden met andere cellulaire en functionele parameters. Het gebruik van 'bench-top' microcapillary stroom cytometer kunnen gemakkelijk aan te passen aan de evaluatie van verschillende sperma structuren met behulp van fluorescerende son...

Integriteit en functionaliteit van sperma membranen zijn enkele van de factoren die sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële aangeeft. Het plasma-membraan fungeert als een beveiligingsbarrière tussen intracellulaire en extracellulaire compartimenten, waardoor het behoud van de cellulaire osmotische evenwicht1. Elke stress die schade aan de integriteit van het plasmamembraan induceert kan afbreuk doen aan de homeostase, levensvatbaarheid en bevruchting capaciteitsvermindering en verhogen van celdood. Bijvoorbeeld, vermindert cryopreservatie sperma levensvatbaarheid verschuldigd aan schade aan haar plasmamembraan, als gevolg van temperatuurveranderingen en osmotische stress2. We eerder gemeld dat het sperma van de stier aan lage concentraties van foodborne contaminanten zoals het pesticide atrazine, haar belangrijkste metaboliet diaminochlorotriazine of de mycotoxine aflatoxine B1, bloot vermindert sperma levensvatbaarheid1,3 . Dit werd bepaald door het dubbelstrengig DNA met DAPI labeling in combinatie met PI, dat aan het DNA van cellen met een beschadigde plasma-membraan bindt.
Acrosoom reactie (AR) gaat de fusie van de buitenste Acrosoom membraan en de bovenliggende plasmamembraan resulterend in de release van acrosomal enzymen4,5. Dit zijn essentiële gebeurtenissen voor zona-zitten penetratie en verdere samenvoegen van de zaadcellen met de oöcyt6. Evaluatie van acrosomal membraan integriteit vormt daarom een nuttige parameter om de kwaliteit van het sperma en de mannelijke vruchtbaarheid7,8,9te evalueren. Verschillende TL technieken zijn geschikt voor de verificatie van de integriteit van het Acrosoom, FITC-PNA of FITC-PSA8,10. In onze eerdere studies, met behulp van de patronen van FITC-PSA kleuring1,3, wij nauwkeurige definities voor (i) intact Acrosoom, (ii) beschadigd Acrosoom membraan en (iii) reageerde Acrosoom. In het onderhavige verslag, we behulp van sperma-dedicated stroom cytometry van de status van de Acrosoom evalueren en vergelijken de resultaten met behulp van fluorescentie microscopie.
De mitochondriën zijn multifunctionele organellen betrokken in, onder andere dingen, ATP synthese, reactieve zuurstof soorten productie, calcium signalering en apoptosis. Fysiologische stoornissen, met inbegrip van mannelijke en vrouwelijke onvruchtbaarheid, zijn gekoppeld aan gewijzigde mitochondriale functie11. Sperma mitochondriën zijn gerangschikt in de midpiece en een cruciale rol in12beweeglijkheid van sperma. Het wordt goed geaccepteerd dat hoge Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) geassocieerd met normale beweeglijkheid en hoge bevruchting capaciteit13 wordt. In tegenstelling, lage ΔΨm wordt geassocieerd met een verhoogd niveau van reactieve zuurstof soorten en bevruchting tarief14verminderd. Niettemin, verschillende ecologische verbindingen, bijvoorbeeld endocriene verstoorders, kunnen induceren van cellulaire spanning en leiden tot een tijdelijke toename van de ΔΨm, hyperpolarisatie1,3, verhoogde productie van vrije radicalen en uiteindelijk, Apoptosis15. De fluorescente sonde 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1) kan bijvoorbeeld onderzoek naar de effecten van foodborne toxines op sperma ΔΨm1,3.
Standaard spermiograms, op basis van fysiologische en morfologische parameters, zijn niet goed genoeg om te voorspellen sperma kwaliteit. Nauwkeuriger methoden zijn verplicht om de kwaliteit van het sperma. Hier bieden we twee haalbaar methoden voor het bepalen van de kwaliteit van het sperma op basis van evaluaties van sperma membranen: gelijktijdige vierpersoonskamers kleuring met specifieke fluorescerende sondes en fluorescentie microscopie, beschreven in onze studies1,3 en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry, onlangs gebruikt in ons laboratorium, en al worden gebruikt door anderen16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Standaard spermiograms beschrijving van de kwaliteit van het sperma zijn meestal gebaseerd op de fysiologische en visuele parameters, zoals het volume van ejaculaat en concentratie, beweeglijkheid en progressieve mobiliteit, en sperma morfologie en levensvatbaarheid. Echter, geen van deze evaluaties is goed genoeg om te voorspellen van de kwaliteit van sperma. Gezien het feit dat onderhoud van sperma levensvatbaarheid en bevruchting potentiële hangt af van membraan integriteit en intracellulaire functionaliteit, evaluatie van deze parameters in staat kan stellen een betere voorspelling van sperma bevruchting bevoegdheid. Hier beschrijven we drie haalbare methoden voor evaluatie van de kwaliteit van het sperma met behulp van specifieke fluorescerende sondes gecombineerd met fluorescentie microscopie en stroom cytometry analyses. Analyses beoordeeld plasmamembraan integriteit met behulp van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en propidium jodide (PI), acrosomal membraan integriteit met fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) en mitochondriale membraan integriteit met behulp van 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodide (JC-1). Combinaties van deze methoden worden ook gepresenteerd. Bijvoorbeeld, gebruik van Annexine V gecombineerd met PI fluorochromes maakt beoordeling van apoptosis en de berekening van het aandeel van apoptotic sperma (apoptotic index). Wij zijn van mening dat deze methodieken, die gebaseerd zijn op het onderzoek van de zaadcel membranen, zeer nuttig voor de beoordeling van de kwaliteit van het sperma zijn.

Figuur 1 toont gelijktijdige fluorimetrische beoordeling van sperma membranen (plasma, acrosomal en mitochondriale) met behulp van PI, DAPI, FITC-PSA en JC-1. Beoordeling van sperma membranen met behulp van gelijktijdige kleuring met vier TL sondes toelaat, bijvoorbeeld, evaluatie van het aandeel van zaadcellen in elke categorie — live vs. doden; hoge vs. lage ΔΨm; intact vs. beschadigd Acrosoom — gelijktijdig voor elke zaadce...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Het doel van deze procedures is om de integriteit van spermamembranen te evalueren met behulp van specifieke fluorescerende sondes in combinatie met fluorescentiemicroscopie of flow cytometrieanalyse. Deze technieken kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van reproductie, zoals voorspelling van bevruchting potentieel en de kwaliteit van sperma monster. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze nauwkeurige evaluatie van meerdere spermamembranen die bekend zijn te associëren met sperma bevruchting potentieel mogelijk te maken.De implicaties van deze technieken uit te breiden tot de diagnose van ejaculaat kwaliteit als het maakt een nauwkeurigere evaluatie van spermaplasma en acrosome membraan integriteit evenals mitochondriale membraan potentieel. Om deze procedure te beginnen, verkrijg ongeveer een tot zes milliliter stierensperma in een buis van 15 milliliter bij kamertemperatuur. Voeg zes milliliter NKM buffer voorverwarmd tot 37 graden Celsius aan elke een milliliter sperma.Centrifuge op 600 keer g gedurende acht minuten. Herhaal de centrifugatie een of twee keer totdat de supernatant duidelijk is. Gooi hierna onmiddellijk het grootste deel van de supernatant weg, waardoor ongeveer een centimeter supernatant boven de pellet overblijft.Leun de buizen voorzichtig onder een hoek van 30 graden in de couveuse en wacht 20 tot 30 minuten om de spermatozoa omhoog te laten zwemmen. Verwijder met behulp van een micropipet voorzichtig de resterende een milliliter supernatant die nu de motile spermatozoa bevat en breng het naar een verse 1,5 milliliter buis. Houd het sperma op 37 graden Celsius tot klaar voor gebruik.Bereid eerst alle benodigde voorraadoplossingen voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens 133 microliter van de motile spermatozoa met een concentratie van 25 miljoen zaadcellen per milliliter over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Voeg 17 microliter van de DAPI werkoplossing toe en broed gedurende 10 minuten in 37 graden Celsius.Centrifuge op 1.000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en voeg 100 microliters NKM-buffer toe aan de pellet. Voeg vervolgens 50 microliter FITC-PSA, twee microliters van JC-1 en drie microliter van PI toe. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.Centrifuge op 1.000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 40 microliter NKM-buffer. Breng vervolgens 10 microliter van het monster over naar een glazen schuif.Smeer het monster in en voeg een coverslip toe. Daarna onmiddellijk beginnen met het visualiseren van het monster door epifluorescentie microscopie met een 40X doelstelling en een drievoudige filter zoals beschreven in het tekstprotocol, met behulp van een digitale camera om een aparte afbeelding vast te leggen voor elk filter. Gebruik de samenvoegoptie in de camerasoftware om de drie afbeeldingen die van de filters zijn ontvangen samen te voegen, waarbij het nieuwe bestand in JPEG-indeling wordt opgeslagen.Open de samengevoegde afbeelding met het verfgereedschap en gebruik de penseeloptie om de getelde spermatozoa te markeren. Classificeer vervolgens de spermatozoa op basis van de fluorescentie die door elke sonde wordt uitgezonden, om ervoor te zorgen dat ten minste 200 spermatozoa per dia wordt geëvalueerd. Alle cellen moeten blauw van de DAPI verschijnen.Tel de dode cellen, die paars lijken, om de levensvatbaarheid te evalueren. Gebruik vervolgens de patronen van fluorescentie kleuring om de acrosome status te evalueren. Ten slotte, evalueren van de mitochondriale membraan potentieel door het onderscheiden van de spermatozoa met een hoog mitochondriaal membraan potentieel dat een rood gekleurde middenstuk vertonen van de spermatozoa met een laag mitochondriaal membraan potentieel dat een groen gekleurde middenstuk vertonen.Tel rode en groene middenstukken apart en bereken hun verhouding. Om te beginnen met de plasmamembraan integriteit evaluatie, neem het gewenste aantal putten uit de levensvatbaarheid en concentratie kit. Breng de putten naar de werkbasis en bedek ze met een flexibel deksel om ze te beschermen tegen licht.Voeg 199 microliters gebufferde oplossing voor cytometrie toe aan elke put. Voeg vervolgens een microliter homogeen sperma toe met een concentratie van 57 miljoen cellen per milliliter aan elke put en homogeniseren door pipetting. Bedek de plaat met het deksel en broed gedurende 10 minuten in op 37 graden Celsius.Voer hierna het monster door de stroomcytometer met behulp van de levensvatbaarheidsinstelling. Om te beginnen met het beoordelen van het mitochondriale membraanpotentieel, haal je het gewenste aantal putten uit de mitochondriale activity kit. Breng ze naar de werkbasis.Voeg 10 microliter absolute ethanol toe aan elke put en gebruik een pipet om het aanwezige poeder in de put opnieuw op te hangen. Voeg 190 microliter PBS per put toe en homogeniseer door pipetting. Voeg 0,75 microliter homogeen sperma met een concentratie van 57 miljoen cellen per milliliter toe aan elke put en homogeniseer door pipetting.Bedek de plaat met het deksel en broed gedurende 30 minuten in op 37 graden Celsius. Voer hierna het monster door de stroomcytometer met behulp van de instelling voor mitochondriale activiteit. Om te beginnen met het beoordelen van de acrosomale membraan integriteit, neem het gewenste aantal putten uit de levensvatbaarheid en acrosome integriteit kit.Breng de putten naar de werkbasis en bedek ze met een flexibel deksel om ze te beschermen tegen licht. Voeg 200 microliter gebufferde oplossing voor cytometrie toe aan elke put. Voeg vervolgens 0,7 microliter homogeen sperma toe met een concentratie van 57 miljoen cellen per milliliter aan elke put en homogeniseren door pipetting.Bedek de plaat met het deksel en broed gedurende 45 minuten op 37 graden Celsius. Voer hierna het monster door de stroomcytometer met behulp van de instelling inzicht. In deze studie wordt de spermakwaliteit geëvalueerd met behulp van verschillende technieken, waarvan er één spermamembranen evalueerde met behulp van fluorometrische sondes.Het is mogelijk om de verschillen in spermamonsterkwaliteit in termen van membraanintegriteit te evalueren. Bijvoorbeeld, het ejaculaat van stier nummer zeven had een relatief laag percentage dode cellen, een laag percentage sperma met pseudo-gereageerd acrosome, en een hoger mitochondriaal membraan potentieel in vergelijking met het ejaculaat van stier nummer een. Monsters worden vervolgens geëvalueerd op levensvatbaarheid en mitochondriale activiteit.De histogrammen voor deze representatieve voorbeelden vertegenwoordigen de geungated spermatozoa en puin en de gated spermatozoa. Deze histogrammen vertegenwoordigen ook de levensvatbare en dode cellen en de verdeling van spermatozoa naar gepolariseerd en gedepolariseerd mitochondriaal membraan. De acrosome integriteit wordt vervolgens geëvalueerd met een kant-en-klare kit en lees met stroom cytometrie, het gebied te verdelen in drie marker gebieden die verwaarloosbare lage fluorescerende cellen vertegenwoordigen met intacte ongevlekte acrosome, lage fluorescerende cellen met resterende gekleurde deel van het acrosome, en zeer fluorescerende cellen met verstoorde acrosome.Tijdens een poging tot deze procedures, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat goed voor te bereiden op de eerste spermamonster. Deze technieken kunnen inzicht geven in de kwaliteit van het sperma evaluatie en kan worden toegepast op verschillende organismen zoals runderen, pluimvee, en mens. Vergelijking tussen de twee technieken, viervoudige vlekken en stroom cytometrie aangegeven geen significante verschillen voor de levensvatbaarheid, mitochondriale membraan potentieel, en de acrosome integriteit waaruit blijkt dat de twee technieken geproduceerd bijpassende resultaten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Voor de verwerking en behandeling van mannelijke Europese aal (Anguilla anguilla) voor hormonale rijping en sperma cryopreservatie

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Toepassing van muis parthenogenetische haploïde embryonale stamcellen als een substituut van sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...