Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

המחברים רוצה להודות "שיאון" חברה ישראלית עבור הזרעה והשבחה (חפץ-חיים, ישראל) על עזרתם שיתוף פעולה, ואת גברת Li Na (IMV טכנולוגיות, l ' aigle, צרפת) לקבלת סיוע עם כלי התקנה, הדרכה.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ישראל 1994 עבור רווחת בעלי חיים. זרע שור סופקו על ידי חברה ישראלית מסחרית עבור הזרעה והשבחה. שופך של שוורים 11 הוערכו במחקר זה.
1. זרע מדגם הכנה
הערה: התהליך מבוסס על המעבדה רוט פרוטוקול1,3.
<o...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

פוטנציאל הפריה זרע תלויה בגורמים מרובים המשקף את איכותם. ריכוז גבוה של spermatozoa, שיעור גבוה של spermatozoa מאוד בהדרגה תאי עשוי להיחשב זרע באיכות גבוהה. למרות זאת, כזה הערכה לא לקחת בחשבון פרמטרים אחרים התאית ופונקציונליים. השימוש microcapillary 'ספסל-top' זרימת cytometer ניתן להתאים בקלות להערכה של מבנים זרע ש...

שלמות והפונקציונליות של ממברנות זרע הם כמה הגורמים המציין זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה. קרום פלזמה משמש כמחסום בין תאים תאיים, חוץ-תאית, ובכך שמירה על שיווי משקל osmotic הסלולר1. מתח שגורם נזק שלמות קרום פלזמה עלול לפגום הומאוסטזיס, תצמצם הקיבולת הכדאיות, הפריה ולהגדיל מוות של תאים. למשל, הקפאה קריוגנית מפחיתה את הכדאיות זרע עקב נזק שלה קרום פלזמה, עקב שינויי טמפרטורה ומתח osmotic2. בעבר דיווחנו כי חשיפת זרע בול ריכוזים נמוכים של והקאה מזהמים כגון מסוג אטרזין של חומרי הדברה, diaminochlorotriazine העיקריים המטבוליט שלה או את aflatoxin mycotoxin B1, מפחית את הזרע הכדאיות1,3 . זה נקבע על-ידי תיוג ה-DNA גדילי כפול עם דאפי בשילוב עם PI, אשר נקשר ה-DNA של תאים עם קרום פלזמה פגום.
תגובה acrosome (AR) כרוך פיוז'ן של קרום acrosome החיצוני של קרום פלזמה שמעליה וכתוצאה מכך שחרורו של אנזימים acrosomal4,5. אלה אירועים חיוני עבור חדירה zona-pellucida ומיזוג נוסף של הזרע עם oocyte6. לכן, הערכת הקרומיות acrosomal מהווה פרמטר שימושי כדי להעריך את איכות תאי הזרע ואת פוריות הגבר-7,-8,-9. מספר טכניקות פלורסנט מתאימים עבור אימות תקינות acrosome, FITC-הרשות הפלסטינית או FITC-PSA8,10. במחקרים קודמים שלנו, באמצעות דפוסי FITC-PSA מכתימים1,3, סיפק הגדרות מדויקות עבור (i) acrosome ללא פגע, (ii) פגום acrosome ממברנה ואנו (iii) הגיב acrosome. בדו ח הנוכחי, לנו להעריך את מצב acrosome באמצעות cytometry זרימה ייעודיים זרע ולהשוות את התוצאות לאלה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles מעורב ב, בין אחרים דברים, ATP סינתזה, ייצור מינים חמצן תגובתי, סידן איתות אפופטוזיס. תפקוד פיזיולוגי, כולל פוריות זכר ונקבה, הם קשורים פונקציה מיטוכונדריאלי שונה11. זרע המיטוכונדריה מסודרים של midpiece, לשחק תפקיד מכריע תנועתיות הזרע12. זה מקובל גם גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) מזוהה עם נורמלי תנועתיות הפריה גבוהה קיבולת13. לעומת זאת, ΔΨm נמוכה קשורה עם רמה גבוה של מינים חמצן תגובתי שומן מופחתת הפריה שיעור14. בכל זאת, תרכובות סביבתיים שונים, למשל האנדוקרינית משבשים, יכול לגרום מתח סלולארית, להוביל גידול ארעי של ΔΨm, hyperpolarization1,3, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים, בסופו של דבר. אפופטוזיס15. החללית פלורסנט 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1) מאפשר בחינת לדוגמה, את ההשפעות של רעלים והקאה על זרע ΔΨm1,3.
Spermiograms סטנדרטי, בהתבסס על פרמטרים פיזיולוגיים, מורפולוגיים, אינם טובים מספיק לחזות ספירת זרע. שיטות מדויקות יותר נדרשים כדי להבטיח את איכות הזרע. כאן, אנו מספקים שתי שיטות האפשריים כדי לקבוע את איכות הזרע בהתבסס על הערכות של זרע ממברנות: צביעת מרובע בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תיאר ב שלנו מחקרים1,3 cytometry זרימה מתקדמות ייעודיים זרע, מנוצל לאחרונה המעבדה שלנו, כבר נמצא בשימוש על-ידי אחרים16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Spermiograms סטנדרטית המתארת איכות הזרע מתבססים בעיקר על הפרמטרים פיזיולוגיים וחזותית, כמו לפלוט נפח, ריכוז, תנועתיות, תנועתיות מתקדמת, ו זרע-מורפולוגיה הכדאיות. עם זאת, הערכות אלה לא מספיק טוב כדי לנבא את איכות הזרע. בהתחשב בכך תחזוקה של זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה תלוי הקרומיות ופונקציונליות תאיים, הערכה של פרמטרים אלה עשויות לאפשר חיזוי טוב יותר של מיומנות ההפריה של הזרע. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות האפשריים כדי להעריך את איכות הזרע שימוש ספציפי הגששים פלורסנט בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry ניתוחים. ניתוחים העריכו propidium יודיד (PI), הקרומיות acrosomal באמצעות fluorescein מצומדת isothiocyanate של קרום פלזמה תקינות באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) אפון השדה agglutinin (FITC-PSA) ו מיטוכונדריאלי הקרומיות באמצעות 5, 5', 6, 6'-טטרה-כלורו-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1). שילובים של שיטות אלה מוצגים. למשל, השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס). אנו מאמינים כי שיטות אלה, אשר מבוססים על בחינת ממברנות תא זרע, הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות הזרע.

איור 1 מראה fluorimetric בו זמנית הערכה של זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) שימוש PI, דאפי, FITC-PSA, JC-1. הערכה של ממברנות הזרע באמצעות צביעת בו זמנית עם ארבעה מכשירי בדיקה פלורסנט מאפשר, לדוגמה, הערכת שיעור זרע בכל קטגוריה – חיים לעומת המלח; גבוה לעומת<...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

מטרת הליכים אלה היא להעריך את שלמות קרום הזרע באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ניתוח ציטומטריה זרימה. טכניקות אלה עשויות לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הרבייה כגון חיזוי פוטנציאל ההפריה ואיכות דגימת הזרע. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהם מאפשרים הערכה מדויקת של קרום זרע מרובים אשר ידועים לקשר עם פוטנציאל הפריית זרע.ההשלכות של טכניקות אלה להרחיב לקראת אבחון של איכות שפיכה כפי שהוא מאפשר הערכה מדויקת יותר של פלזמת זרע ושלמות קרום אקרוזום, כמו גם פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי. כדי להתחיל בהליך זה, להשיג כ 1 עד 6 מיליליטר של זרע שור בצינור 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר. הוסף שישה מיליליטר של חיץ NKM מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לכל מיליליטר אחד של זרע.צנטריפוגה ב 600 פעמים g במשך שמונה דקות. חזור על הצנטריפוגה פעם או פעמיים עד העל-טבעי ברור. לאחר מכן, מיד להשליך את רוב supernatant, משאיר כ סנטימטר אחד של על טבעי מעל גלולה.בזהירות להישען על הצינורות בזווית של 30 מעלות באינקובטור ולחכות 20 עד 30 דקות כדי לאפשר את spermatozoa לשחות למעלה. באמצעות micropipette, להסיר בזהירות את מיליליטר הנותרים של על טבעי אשר מכיל כעת את זרע מוטיב ולהעביר אותו צינור טרי 1.5 מיליליטר. שמור על הזרע ב 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.ראשית, הכן את כל פתרונות המלאי הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר 133 microliters של spermatozoa מוטיב בריכוז של 25 מיליון זרע למיליליטר לצינור חדש 1.5 מיליליטר. הוסיפו 17 מיקרוליטרים של פתרון העבודה DAPI ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.צנטריפוגה ב 1,000 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר NKM לכדור. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של FITC-PSA, שני microliters של JC-1, ושלושה microliters של PI. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.צנטריפוגה ב 1,000 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור ב-40 מיקרוליטרים של מאגר NKM. לאחר מכן להעביר 10 microliters של המדגם לשקופית זכוכית.מורחים את הדגימה ומוסיפים כיסוי. לאחר מכן, מיד להתחיל לדמיין את המדגם על ידי מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרה 40X ומסנן משולש כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, באמצעות מצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונה נפרדת עבור כל מסנן. השתמש באפשרות המיזוג בתוכנת המצלמה כדי למזג את שלוש התמונות שהתקבלו מהסננים, כדי לשמור את הקובץ החדש בתבנית JPEG.פתחו את התמונה הממוזגת בעזרת כלי הצבע ולהשתמש באפשרות המברשת לסימני הזרע שנספרו. לאחר מכן, לסווג את spermatozoa מבוסס על הפלואורסצנטיות הנפלטת מכל בדיקה, הקפדה להעריך לפחות 200 spermatozoa לכל שקופית. כל התאים צריכים להופיע כחולים מ- DAPI.לספור את התאים המתים, שנראים סגולים, כדי להעריך את הכדאיות. לאחר מכן השתמש בדפוסים של כתמי פלואורסצנטיות כדי להעריך את מצב האקרומוזום. לבסוף, להעריך את פוטנציאל קרום המיטוכונדריה על ידי הבחנה spermatozoa עם פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי גבוה אשר מציגים אמצע מוכתם אדום מן הזרע עם פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי נמוך אשר מציגים אמצע מוכתם ירוק.לספור מידות אדומות וירוקות בנפרד ולחשב את היחס ביניהם. כדי להתחיל את הערכת שלמות קרום הפלזמה, לקחת את המספר הרצוי של בארות מן הכדאיות ואת ערכת הריכוז. מעבירים את בארות לבסיס העבודה ומכסים אותן במכסה גמיש כדי להגן עליהן מפני אור.הוסף 199 מיקרוליטרים של פתרון במאגר עבור ציטומטריה לכל באר. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות. מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטומטר הזרימה באמצעות הגדרת הכדאיות. כדי להתחיל להעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, להוציא את המספר הרצוי של בארות מתוך ערכת פעילות המיטוכונדריה. העבר אותם לבסיס העבודה.מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט לכל באר ולהשתמש פיפטה כדי לנצל מחדש את האבקה הקיימת בתוך באר. הוסף 190 microliters של PBS לגם הומוגניזציה על ידי pipetting. הוסף 0.75 מיקרוליטרים של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות.מכסים את הצלחת עם המכסה והדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטומטר הזרימה באמצעות הגדרת הפעילות המיטוכונדרית. כדי להתחיל להעריך את שלמות הממברנה האקרוזומלית, להוציא את המספר הרצוי של בארות מן הכדאיות ואת ערכת שלמות acrosome.מעבירים את בארות לבסיס העבודה ומכסים אותן במכסה גמיש כדי להגן עליהן מפני אור. הוסף 200 מיקרוליטרים של פתרון במאגר עבור ציטומטריה לכל באר. לאחר מכן הוסיפו 0.7 מיקרוליטרים של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות.מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטרומטר הזרימה באמצעות הגדרת התובנה. במחקר זה, איכות הזרע מוערכת בטכניקות שונות, שאחד מהם העריך קרום זרע באמצעות בדיקות פלואורומטריות.ניתן להעריך את ההבדלים באיכות דגימת הזרע במונחים של שלמות קרום. לדוגמה, השפיכה של שור מספר שבע היה אחוז נמוך יחסית של תאים מתים, שיעור נמוך של זרע עם אקרוסום פסאודו-הגיב, ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי גבוה יותר בהשוואה לשפיכה של שור מספר אחד. דגימות לאחר מכן מוערכים עבור הכדאיות ופעילות המיטוכונדרית.ההיסטוגרמות לדוגמאות מייצגות אלה מייצגות את הזרע והפסולת המגודרים ואת הזרע המגודר. היסטוגרמות אלה מייצגות גם את התאים קיימא ומתים ואת התפלגות של זרע קרום מיטוכונדריאלי מקוטב דה מקוטב. שלמות האקרואז מוערכת לאחר מכן עם ערכה מוכנה לשימוש ולקרוא עם ציטומטריית זרימה, חלוקת האזור לשלושה אזורי סמן המייצגים תאים פלואורסצנטיים נמוכים זניחים עם אקרומוזום לא מוכתם שלם, תאים פלואורסצנטיים נמוכים עם חלק מוכתם שיורית של האקרואז, ותאים פלואורסצנטיים מאוד עם קרום משובש.בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לוודא להכין כראוי את דגימת הזרע הראשונית. טכניקות אלה יכולות לספק תובנה להערכת איכות הזרע ו ניתן ליישם אותן על אורגניזמים שונים כגון בשר חזיר, עופות ואנושיים. השוואה בין שתי הטכניקות, הכתמה מרובעת וציטומטריית זרימה לא הצביעה על הבדלים משמעותיים בכדאיות, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ושלמות האקרוזום החושפת כי שתי הטכניקות הניבו תוצאות תואמות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...