Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare la società israeliana "SION" per inseminazione artificiale e l'allevamento (Hafetz Haim, Israele) per il loro aiuto e la cooperazione e la sig. ra Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francia) per assistenza con la messa in funzione e la formazione.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati conformemente agli orientamenti israeliano 1994 per il benessere animale. Sperma di bovini è stato fornito da società commerciale israeliana per inseminazione artificiale e l'allevamento. Eiacula di 11 tori sono stati valutati in questo studio.
1. preparazione del campione di sperma
Nota: La procedura è basata sul protocollo1,3 di laboratorio Roth...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Potenziale di fertilizzazione dello sperma dipende da molteplici fattori che riflettono la sua qualità. Un'alta concentrazione di spermatozoi e un'alta percentuale di spermatozoi mobili altamente progressivamente potrebbe essere considerati la qualità dello sperma. Tuttavia, tale valutazione non prendere in considerazione altri parametri cellulari e funzionali. L'uso di 'Banco' microcapillary citometro a flusso può essere facilmente adattato alla valutazione delle varie strutture di sperma usando sonde fluorescenti, c...

L'integrità e la funzionalità delle membrane degli spermatozoi sono alcuni dei fattori che indica la vitalità degli spermatozoi e potenziale di fecondazione. La membrana plasmatica agisce come una barriera tra compartimenti intracellulari ed extracellulari, mantenendo l' equilibrio osmotico cellulare1. Qualsiasi stress che induce il danno all'integrità della membrana plasmatica potrebbe alterare l'omeostasi, ridurre la capacità di fertilizzazione e redditività e aumentare la morte delle cellule. Per esempio, crioconservazione riduce la vitalità degli spermatozoi causa danni alla sua membrana plasmatica, a seguito di variazioni di temperatura e stress osmotico2. Precedentemente abbiamo segnalato che esponendo lo sperma di Toro a basse concentrazioni di contaminanti di origine alimentare come i pesticidi atrazina, suo principale metabolita diaminochlorotriazine o l'aflatossina B1, la micotossina riduce sperma attuabilità1,3 . Questo è stato determinato dall'etichettatura il DNA double-stranded con DAPI in combinazione con PI, che si lega al DNA delle cellule con una membrana plasmatica danneggiata.
Reazione acrosomiale (AR) comporta la fusione della membrana acrosomiale esterna e la membrana di plasma sovrastante conseguente rilascio di enzimi acrosomiali4,5. Questi sono eventi da non mancare per penetrazione della zona pellucida e ulteriormente l'Unione dello sperma con l' ovocita6. Pertanto, la valutazione dell'integrità della membrana acrosomiale costituisce un parametro utile per valutare la qualità dello sperma e la fertilità maschile7,8,9. Parecchie tecniche fluorescenti sono utilizzabili per la verifica di integrità acrosomiale, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. Nei nostri studi precedenti, utilizzando i modelli di FITC-PSA colorazione1,3, abbiamo fornito le definizioni precise per (i) acrosomiale intatta, (ii) danneggiato della membrana acrosomiale e (iii) ha reagito acrosomiale. Nel rapporto corrente, valutiamo lo stato acrosomiale mediante citometria a flusso di sperma-dedicato e confrontare i risultati con quelli utilizzando la microscopia a fluorescenza.
I mitocondri sono organelli multifunzionali coinvolti in, tra le altre cose, ATP sintesi, produzione di specie reattive dell'ossigeno, segnalazione del calcio e apoptosi. Disfunzioni fisiologiche, tra cui l'infertilità maschile e femminile, sono associate con la funzione mitocondriale alterata11. I mitocondri dello sperma sono disposti nel midpiece e svolgono un ruolo cruciale in spermatozoi motilità12. È ben accettato che potenziale di membrana mitocondriale alta (ΔΨm) è associata con normale motilità e fertilizzazione alta capienza13. Al contrario, ΔΨm basso è associato con un livello elevato di specie reattive dell'ossigeno e ridotto tasso di fertilizzazione14. Tuttavia, vari composti ambientali, per esempio gli interferenti endocrini, possono indurre stress cellulare e portare a un aumento transitorio nel ΔΨm, hyperpolarization1,3, aumentata produzione di radicali liberi e, infine, apoptosi15. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1) consente, ad esempio, esaminare gli effetti delle tossine di origine alimentare sul sperma ΔΨm1,3.
Spermiograms standard, basato su parametri fisiologici e morfologici, non sono abbastanza buone predire la qualità dello sperma. Metodi più accurati sono tenuti a garantire la qualità dello sperma. Qui, forniamo fattibile due metodi per determinare la qualità dello sperma sulla base delle valutazioni delle membrane degli spermatozoi: colorazione quadrupla simultanea con sonde fluorescenti specifiche e microscopia a fluorescenza, descritto nei nostri studi1,3 e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate, recentemente utilizzato nel nostro laboratorio e già utilizzato da altri16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Spermiograms standard che descrivono la qualità dello sperma sono principalmente basati sui parametri fisiologici e visual, come il volume di liquido seminale e concentrazione, motilità e motilità progressiva e morfologia degli spermatozoi e vitalità. Tuttavia, nessuna di queste valutazioni è abbastanza buona per predire la qualità dello sperma. Dato che il mantenimento della vitalità degli spermatozoi e fecondazione potenziale dipende dalla funzionalità intracellulare e l'integrità della membrana, la valutazione di questi parametri potrebbe consentire una migliore previsione di competenza di fertilizzazione dello sperma. Qui, descriviamo tre possibili metodi per valutare la qualità dello sperma usando sonde fluorescenti specifiche combinate con analisi di citometria a flusso o microscopia di fluorescenza. Analisi ha valutato l'integrità della membrana del plasma utilizzando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e ioduro di propidio (PI), l'integrità della membrana acrosomiale utilizzando fluoresceina isotiocianato-coniugato dell'agglutinina Pisum sativum (FITC-PSA) e l'integrità della membrana mitocondriale usando 5, 5', 6, 6'-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl ioduro di carbocyanine (JC-1). Combinazioni di questi metodi inoltre sono presentati. Per esempio, uso di annessina V combinato con consente di fluorocromi PI apoptosi di valutare e calcolare la percentuale di spermatozoi apoptotici (indice apoptotico). Crediamo che queste metodologie, che si basano sull'esame di membrane di spermatozoo, sono molto utili per la valutazione della qualità dello sperma.

Figura 1 spettacoli fluorimetrica simultanea valutazione delle membrane degli spermatozoi (plasma, acrosomale e mitocondriale) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Valutazione delle membrane dello sperma usando la macchiatura simultanea con quattro sonde fluorescenti permette, ad esempio, valutare la percentuale di spermatozoi in ogni categoria — live vs morti; alta vs bassa ΔΨm; intatto vs. danneggiato acrosomiale — contemporane...

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Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Qui, presentiamo le metodologie per valutare l'integrità della membrana di spermatozoan, una cellulare caratteristica associata con competenza di fertilizzazione dello sperma. Descriviamo tre tecniche per la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi: macchiatura simultanea con sonde fluorescenti specifiche, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate. Inoltre vengono presentati esempi di combinazione delle metodologie.

Fluorimetrica tecniche per la valutazione delle membrane degli spermatozoi

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

L'obiettivo di queste procedure è valutare l'integrità delle membrane spermatica utilizzando specifiche sonde fluorescenti combinate con microscopia a fluorescenza o analisi della citometria del flusso. Queste tecniche potrebbero aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione come la previsione del potenziale di fecondazione e la qualità del campione di spermatozoi. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono una valutazione precisa di più membrane spermatica che sono note per associarsi al potenziale di fecondazione dello sperma.Le implicazioni di queste tecniche si estendono verso la diagnosi della qualità dell'eiaculato in quanto consente una valutazione più accurata del plasma spermatico e dell'integrità della membrana acrosoma, nonché del potenziale della membrana mitocondriale. Per iniziare questa procedura, ottenere circa uno o sei millilitri di sperma di toro in un tubo da 15 millilitri a temperatura ambiente. Aggiungere sei millilitri di tampone NKM pre-riscaldato a 37 gradi Celsius a ciascuno millilitro di sperma.Centrifuga a 600 volte g per otto minuti. Ripetere la centrifugazione una o due volte fino a quando il supernatante non è chiaro. Successivamente, scartare immediatamente la maggior parte del supernatante, lasciando circa un centimetro di supernatante sopra il pellet.Appoggiare con cura i tubi con un angolo di 30 gradi nell'incubatore e attendere da 20 a 30 minuti per consentire agli spermatozoi di nuotare. Utilizzando una micropipetta, rimuovere con cura il rimanente millilitro di supernatante che ora contiene gli spermatozoi mobile e trasferirlo in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Mantenere lo sperma a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso.In primo luogo, preparare tutte le soluzioni stock necessarie come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire 133 microlitri degli spermatozoi motili a una concentrazione di 25 milioni di spermatozoi per millilitro in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 17 microlitri della soluzione di lavoro DAPI e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Centrifuga a 1.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere 100 microlitri di tampone NKM al pellet. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di FITC-PSA, due microlitri di JC-1 e tre microlitri di PI. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Centrifuga a 1.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 40 microlitri di tampone NKM. Quindi trasferire 10 microlitri del campione in uno scivolo di vetro.Spalmare il campione e aggiungere un coverslip. Successivamente, inizia immediatamente a visualizzare il campione con la microscopia a epifluorescenza con un obiettivo 40X e un filtro triplo come delineato nel protocollo di testo, utilizzando una fotocamera digitale per catturare un'immagine separata per ogni filtro. Utilizzare l'opzione di unione nel software della fotocamera per unire le tre immagini ricevute dai filtri, salvando il nuovo file in formato JPEG.Aprite l'immagine unita con lo strumento pittura e usate l'opzione pennello per contrassegnare gli spermatozoi contati. Successivamente, classificare gli spermatozoi in base alla fluorescenza emessa da ciascuna sonda, assicurandosi di valutare almeno 200 spermatozoi per diapositiva. Tutte le celle devono apparire blu dal DAPI.Conta le cellule morte, che appaiono viola, per valutare la vitalità. Quindi utilizzare i modelli di colorazione a fluorescenza per valutare lo stato acrosoma. Infine, valutare il potenziale della membrana mitocondriale distinguendo gli spermatozoi ad alto potenziale di membrana mitocondriale che presentano un centrotavola macchiato di rosso dagli spermatozoi a basso potenziale di membrana mitocondriale che presentano un centrotavola macchiato di verde.Contare separatamente i centrotavola rossi e verdi e calcolarne il rapporto. Per iniziare la valutazione dell'integrità della membrana plasmatica, prendere il numero desiderato di pozzi dal kit di vitalità e concentrazione. Trasferire i pozzali alla base di lavoro e coprirli con un coperchio flessibile per proteggerli dalla luce.Aggiungere 199 microlitri di soluzione tamponata per la citometria ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un microlitro di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione. Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione di vitalità. Per iniziare a valutare il potenziale della membrana mitocondriale, eserti il numero desiderato di pozzi dal kit di attività mitocondriale. Trasferirli alla base di lavoro.Aggiungere 10 microlitri di etanolo assoluto ad ogni pozzo e utilizzare una pipetta per rimostrare la polvere presente all'interno del pozzo. Aggiungere 190 microlitri di PBS per pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione. Aggiungere 0,75 microlitri di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione.Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione dell'attività mitocondriale. Per iniziare a valutare l'integrità della membrana acrosomica, esegna il numero desiderato di pozzi dal kit di integrità acrosoma e vitalità acrosoma.Trasferire i pozzali alla base di lavoro e coprirli con un coperchio flessibile per proteggerli dalla luce. Aggiungere 200 microlitri di soluzione tamponata per la citometria ad ogni pozzo. Aggiungere quindi 0,7 microlitri di sperma omogeneo ad una concentrazione di 57 milioni di cellule per millilitro ad ogni pozzo e omogeneizzare mediante pipettazione.Coprire la piastra con il coperchio e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, eseguire il campione attraverso il citometro di flusso utilizzando l'impostazione insight. In questo studio, la qualità dello sperma viene valutata utilizzando diverse tecniche, una delle quali ha valutato le membrane spermatica utilizzando sonde fluorometriche.È possibile valutare le differenze nella qualità del campione di sperma in termini di integrità della membrana. Ad esempio, l'eiaculato del toro numero sette aveva una percentuale relativamente bassa di cellule morte, una bassa percentuale di spermatozoi con acrosoma pseudo-reagito e un maggiore potenziale di membrana mitocondriale rispetto all'eiaculato del toro numero uno. I campioni vengono quindi valutati per la vitalità e l'attività mitocondriale.Gli istogrammi per questi esempi rappresentativi rappresentano gli spermatozoi e i detriti non datati e gli spermatozoi recintati. Questi istogrammi rappresentano anche le cellule vitali e morte e la distribuzione degli spermatozoi alla membrana mitocondriale polarizzata e depolarizzata. L'integrità acrosoma viene quindi valutata con un kit pronto all'uso e letta con citometria a flusso, dividendo l'area in tre aree marcatori che rappresentano cellule trascurabili a bassa fluorescenza con acrosoma intatto non macchiato, celle a bassa fluorescenza con parte macchiata residua dell'acrosoma e cellule altamente fluorescenti con acrosoma interrotto.Durante il tentativo di queste procedure, è importante assicurarsi di preparare correttamente il campione iniziale di spermatozoi. Queste tecniche possono fornire informazioni sulla valutazione della qualità dello sperma e possono essere applicate a vari organismi come bovini, pollame e umani. Il confronto tra le due tecniche, la colorazione quadrupla e la citometria del flusso non ha indicato differenze significative per la vitalità, il potenziale della membrana mitocondriale e l'integrità acrosoma rivelando che le due tecniche hanno prodotto risultati corrispondenti.

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Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

La valutazione simultanea di Cardiomyocyte DNA Sintesi e Ploidia: Un metodo per assistere Quantificazione del Cardiomyocyte Rigenerazione e fatturato

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Valutazione degli effetti di composti sullo sviluppo della funzione di vertebrati rete neurale utilizzando array di multi-elettrodi sistema endocrino

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Gestione e trattamento di maschio anguilla europea (Anguilla anguilla) per maturazione ormonale e crioconservazione degli spermatozoi

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...