Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
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著者は、彼らの助けと協力、計測器のセットアップとトレーニングの支援の李娜 (IMV 技術、l ' aigle、フランス) さんの「シオン」人工授精と繁殖 (Hafetz、イスラエル共和国) のためのイスラエルの会社を感謝したいです。

動物福祉のため 1994 イスラエル ガイドラインに従ってすべての実験を行った。牛の精子が人工授精と繁殖のための商業のイスラエルの会社によって提供されました。本研究では 11 の雄牛の射精を行った。
1. 精子サンプル準備
注:手順は、ロス研究室のプロトコル1,3に基づいています。
<ol><li>...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

精子の受精の可能性は、その品質を反映した複数の要因に依存します。精子の高濃度と徐々 に高運動性の精子の割合が高い高品質の精液を考慮可能性があります。それにもかかわらず、このような評価、アカウントにとらない他の携帯電話と機能パラメーター。'卓上' マイクロキャピ ラリー流れの cytometer の使用はで先ほど他17本 (法 #3) 蛍光プローブを用いた様々 なの精?...

整合性と精子の膜の機能は、精子の生存率と潜在的な受精を示す要因の一部です。細胞膜は、細胞浸透圧平衡1維持、細胞内と細胞外のコンパートメント間の障壁として機能します。プラズマ膜の完全性への損傷を誘発するストレスが恒常性を損なう、生存率及び受精能力削減および細胞死を増やします。例えば、凍結保存は温度変化と浸透圧ストレス2の結果としてその原形質膜への損傷をによる精子の生存率を低減します。我々 は以前報告公開農薬アトラジン、その主要代謝物 diaminochlorotriazine カビ毒アフラトキシン B1 など食品由来汚染物質の低濃度に雄牛の精液精子生存率1,3 を減少させること.これは、破損した細胞膜と細胞の DNA に結合する PI との組み合わせで DAPI で二本鎖 DNA を標識によって決定されました。
精子先体反応 (AR) は、外側の精子膜と先酵素4、5の解放に終って覆う膜の融合を含まれます。これらは、透明帯の浸透とさらに6卵と精子の結合の重要なイベントです。したがって、先膜の完全性の評価は、精液性状と男性の生殖能力7,8,9評価に有用なパラメーターを構成します。いくつかの蛍光灯のテクニックは、精子の整合性、FITC PNA または FITC PSA8,10の検証に適しています。FITC PSA 染色1,3パターンを使用して私たちの以前の研究で、(i) の正確な定義をそのまま精子提供、(ii) 精子膜を破損しているし、(iii) 精子先体反応します。現在のレポートでは、精子専用フローサイトメトリーを使用して精子の状態を評価し、蛍光顕微鏡を使用して、結果を比較します。
ミトコンドリアは、多機能の細胞小器官で、他のもの、ATP 合成、活性酸素種の生産、カルシウム シグナル伝達とアポトーシスの関与です。生理学的な機能不全、男性と女性の不妊を含む変更されたミトコンドリア機能11に関連付けられます。精子のミトコンドリアは、midpiece に配置され、精子運動12で重要な役割を果たします。高のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) は通常の運動性と高い受精能力13に関連付けられてそれをよく受け入れられています。対照的に、低 ΔΨm は活性酸素種の高いレベルに関連付けられてし、受精率14を削減します。それにもかかわらず、様々 な環境物質、例えば内分泌かく乱物質を細胞ストレスを誘発でき、ΔΨm、過分極1,3フリーラジカルと最終的には、生産の増加の一時的な増加につながるアポトーシス15。蛍光プローブ 5, 5', 6, 6'-テトラ-クロロ-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1) により、たとえば、精子 ΔΨm1,3食中毒の毒素の影響を調べること。
生理学的および形態学的パラメーターに基づく標準の spermiograms は精液の品質を予測するのに十分ではありません。正確な方法は、精子の質を確保するため必要があります。ここで、精子の膜の評価に基づく精子の質を決定する 2 つの可能な方法を提供: 特定の蛍光プローブと蛍光顕微鏡、私たち研究1,3に記載されている同時 4 人染色最近既に他のユーザーによって使用されている当研究室において利用される高度な精子専用フローサイトメトリー、16,17,18。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

精子の質を記述する標準的な spermiograms 主、射精量、濃度、運動と進歩的な運動と精子形態の生存率など、生理学的および視覚的パラメーターに基づいています。しかし、これらの評価なしは精液の品質を予測するのに十分です。精子の生存率及び受精可能性の維持は、膜の完全性および細胞内の機能に依存することを考えるこれらのパラメーターの評価は、精子受精能力のより良い予測を可能にするかもしれない。ここでは、蛍光顕微鏡やフローのフローサイトメトリー解析と組み合わせて特定の蛍光プローブを用いた精子の質を評価する 3 つの可能な方法をについて説明します。解析評価 4', 6-diamidino-2-phenylindole を使用して細胞膜の整合性 (DAPI) とヨウ化 propidium (PI)、イソチオ シアン酸共役フルオレスセインを使用して整合性を先膜エンドウ凝集素 (FITC PSA) と5, 5', を使用してミトコンドリア膜の完全性 6、6'-テトラ-クロロ-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1)。また、これらの方法の組み合わせを提示します。例えば、アネキシン V の使用は PI 蛍光色素によりアポトーシスを評価およびアポトーシス精子 (アポトーシス インデックス) の割合を計算すると組み合わせます。精子膜の検討に基づいて、これらの方法論は精子の質を評価するために非常に有用と考えます。

精子膜 (プラズマ、先とミトコンドリア)図 1番組同時蛍光光度法による評価は、PI、DAPI、FITC PSA と JC 1 を使用します。4 つの蛍光プローブの同時染色を用いた精子膜の評価により、たとえば、各カテゴリにおける精子の割合を評価-ライブ対死者;高対低 ΔΨm;そのまま対。精子を破損した — 各精子を同時に。
<p class="jove_conte...

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Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

精子膜の完全性、精子の受精能力に関連付けられている携帯電話の機能を評価する方法論を紹介します。精子の膜の蛍光光度法による評価のための 3 つの技術について述べる: 高度な精子専用フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、特定の蛍光プローブの同時染色します。方法論を組み合わせることの紹介も。

蛍光光度法による精子膜評価技術

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

これらの手順の目的は、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリー分析と組み合わせた特定の蛍光プローブを使用して、精子膜の完全性を評価することです。これらの技術は、受精の可能性の予測や精子サンプルの質など、生殖の分野で重要な質問に答えるのに役立つかもしれません。これらの技術の主な利点は、精子受精電能と関連付けられる複数の精子膜の正確な評価を可能にすることです。これらの技術の意味は、精子の血漿とアクロソーム膜の完全性だけでなく、ミトコンドリア膜の可能性のより正確な評価を可能にするので、射精品質の診断にまで及ぶ。この手順を開始するには、室温で15ミリリットルチューブ内の約1〜6ミリリットルの雄牛精液を得る。精液の各1ミリリットルに摂氏37度に事前に温めたNKMバッファーの6ミリリットルを追加します。8分間600回gで遠心分離機。上清がはっきりするまで遠心分離を1、2回繰り返します。この後、すぐに上清の大部分を捨て、ペレットの上に約1センチの上清を残します。慎重にインキュベーターで30度の角度でチューブを傾け、精子が泳がれるように20〜30分待ちます。マイクロピペットを使用して、残りの1ミリリットルの上清を慎重に除去し、現在はモタイル精子を含み、新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。精子を37°Cで使用する準備ができるまで保ちます。まず、テキストプロトコルで概説されているように、必要なすべてのストックソリューションを準備します。次に、1ミリリットル当たり2500万個の精子の濃度で133マイクロリットルの運動精子を新しい1.5ミリリットルチューブに移す。DAPI作業溶液を17マイクロリットル加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。遠心分離機を1,000倍gで5分間行う。上清を捨て、ペレットに100マイクロリットルのNKMバッファーを加えます。次に、FITC-PSAの50マイクロリットル、JC-1の2マイクロリットル、および3マイクロリットルのPIを加えます。摂氏37度で10分間インキュベートします。遠心分離機を1,000倍gで5分間行う。上清を捨て、40マイクロリットルのNKMバッファーにペレットを再懸濁します。その後、サンプル10マイクロリットルをガラススライドに移します。サンプルを塗り、カバースリップを追加します。この後、テキストプロトコルで概説されている40X目的とトリプルフィルターを用いて、すぐに蛍光顕微鏡によるサンプルの可視化を開始し、デジタルカメラを使用して各フィルタの別々の画像をキャプチャします。カメラソフトウェアのマージオプションを使用して、フィルタから受信した3つの画像をマージし、新しいファイルをJPEG形式で保存します。ペイントツールでマージされた画像を開き、ブラシオプションを使用して、カウントされた精子をマークします。次に、各プローブから放出される蛍光に基づいて精子を分類し、スライド当たり少なくとも200個の精子を評価することを確認する。DAPI からすべてのセルが青色で表示されます。生存率を評価するために、紫色に見える死んだ細胞を数えます。次に、蛍光染色のパターンを用いて、アクロソーム状態を評価する。最後に、緑色に染まった中間片を示すミトコンドリア膜電位が低い精子から赤染色された中間体を示す高いミトコンドリア膜電位を有する精子を区別することにより、ミトコンドリア膜電位を評価する。赤と緑のミッドピースを別々にカウントし、その比率を計算します。原形質膜完全性評価を開始するには、生存率および濃度キットから所望の数のウェルを取ります。井戸を作業ベースに移し、柔軟な蓋で覆い、光から保護します。各ウェルにサイトメトリー用の緩衝溶液199マイクロリットルを加えます。その後、各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で均質精液の1マイクロリットルを追加し、ピペット処理によって均質化する。蓋でプレートを覆い、摂氏37度で10分間インキュベートします。この後、生存率設定を使用してフローサイトメーターを通してサンプルを実行します。ミトコンドリア膜電位の評価を開始するには、ミトコンドリア活性キットから所望の数のウェルを取り出す。作業ベースに転送します。各ウェルに10マイクロリットルの絶対エタノールを加え、ピペットを使用してウェル内に存在する粉末を再懸濁させます。1ウェルあたり190マイクロリットルのPBSを加え、ピペットで均質化します。各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で0.75マイクロリットルの均質精液を加え、ピペット処理で均質化します。蓋でプレートを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。この後、ミトコンドリア活性設定を使用して、フローサイトメーターを通してサンプルを実行します。アクロスソーム膜の完全性の評価を開始するには、生存率および不死性完全性キットから所望の数のウェルを取り出します。井戸を作業ベースに移し、柔軟な蓋で覆い、光から保護します。各ウェルにサイトメトリー用の緩衝溶液200マイクロリットルを加えます。その後、各ウェルに1ミリリットル当たり5700万個の細胞の濃度で0.7マイクロリットルの均質精液を加え、ピペット処理によって均質化します。蓋でプレートを覆い、摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、インサイト設定を使用して、フローサイトメーターを通してサンプルを実行します。本研究では、精液の質は異なる技術を用いて評価され、そのうちの1つはフルオロメトリックプローブを用いて精子膜を評価した。精子サンプルの質の違いを膜の完全性の観点から評価することが可能である。例えば、7番の雄牛の射精は、死んだ細胞の割合が比較的低く、疑似反応したアクロソームを有する精子の割合が低く、かつ、雄牛ナンバーワンの射精と比較するとミトコンドリア膜電位が高かった。次いで、サンプルの生存率とミトコンドリア活性について評価されます。これらの代表的な例のヒストグラムは、アンガウンド精子および破片およびゲート付き精子を表す。これらのヒストグラムはまた、生存細胞と死細胞および分極および脱分極ミトコンドリア膜への精子の分布を表す。その後、アクロソームの完全性をすぐに使用できるキットで評価し、フローサイトメトリーで読み取り、無傷の未染色のアクロソーム、残存性の染色部分を持つ低蛍光細胞、および破壊されたワニ体を有する高い蛍光細胞を有する3つのマーカー領域に分割する。これらの手順を試みている間、 最初の精子サンプルを適切に準備することが重要です。これらの技術は、精子の質評価に関する洞察を提供し、ウシ、家禽、および人間などの様々な生物に適用することができます。4倍の染色とフローサイトメトリーの2つの技術の比較は、生存率、ミトコンドリア膜電位、および2つの技術が一致する結果を生み出すことを明らかにするアクロソーム完全性について有意な差を示さなかった。

Research

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子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

アラビドプシス二重受精における精子核形態をたどる受精状態の評価

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...