Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke "SION" israelsk selskap for kunstig insemination og avl (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjelp og samarbeid og Ms. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Frankrike) for hjelp med instrumentet oppsett og trening.

Alle eksperimentene ble utført i 1994 israelske retningslinjer for dyrevelferd. Storfe sperm ble levert av kommersielle israelsk selskap for kunstig insemination og avl. Ejakulerer av 11 okser ble vurdert i denne studien.
1. sperm prøve forberedelse
Merk: Prosedyren er basert på Roth laboratoriet er protokollen1,3.
<ol><li>Få ca 1 – 6 mL av bull sæd i en 15 mL tube ved romtemperatur...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Sperm befruktning potensielle avhenger av flere faktorer som reflekterer kvaliteten. En høy konsentrasjon av spermatozoa og en høy andel av svært gradvis motile spermatozoa kan anses som høy kvalitet sæd. Likevel slike en evaluering tar ikke hensyn til andre cellulære og funksjonelle parametere. Bruk av "benk-topp" microcapillary flyt cytometer kan enkelt tilpasses til evaluering av ulike sperm strukturer med fluorescerende sonder, som tidligere vist av andre17 og demonstrert her (teknikk #3...

Integritet og funksjonaliteten av sæd membraner er noen av faktorene som angir sperm levedyktighet og gjødsling potensielle. Plasma membranen fungerer som en barriere mellom intracellulær og ekstracellulære avdelinger, og dermed opprettholde det cellular osmotisk likevekt1. Noen stress som induserer skade integriteten plasma membranen kan svekke homeostase, redusere levedyktighet og gjødsling kapasitet og øke celledød. For eksempel reduserer kryonisk bevaring sperm levedyktighet skyldes skader på sin plasma membran, temperaturendringer og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapportert at utsette bull sædcellene å lave konsentrasjoner av matbårne miljøgifter som plantevernmidler atrazine, sin hovedmetabolitten diaminochlorotriazine eller mycotoxin aflatoxin B1, reduserer sperm levedyktighet1,3 . Dette ble bestemt av merking double-strandet DNA med DAPI i kombinasjon med PI, som binder seg til DNA av celler med en skadet plasma membran.
Acrosome reaksjon (AR) innebærer blanding av ytre acrosome membranen og overliggende plasma membranen som resulterer i utgivelsen av acrosomal enzymer4,5. Dette er viktige hendelser for zona-pellucida gjennomtrenging og ytterligere sammenslåing av sæd med oocyte6. Evaluering av acrosomal membran integritet utgjør derfor en nyttig parameter for å evaluere sædkvalitet og mannlig fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er egnet for verifisering av acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våre tidligere studier, bruke mønstre av FITC-PSA flekker1,3, vi følger nøyaktig definisjoner for (i) intakt acrosome, (ii) skadet acrosome membran og (iii) reagerte acrosome. Gjeldende rapporten vi evaluere acrosome status ved hjelp av sæd-dedikert flowcytometri og sammenligner resultatene til de som bruker fluorescens mikroskopi.
Mitokondrier er multifunksjonell organelles involvert, blant andre ting, ATP syntese, reaktive oksygen arter produksjon, kalsium signalering og apoptose. Fysiologiske dysfunksjoner, herunder mannlige og kvinnelige ufruktbarhet, knyttes endret mitokondrie funksjonen11. Sperm mitokondrier ordnes i midpiece og spille en avgjørende rolle i sperm motilitet12. Det er godt akseptert at høy mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er tilknyttet normal motilitet og høy befruktning kapasitet13. I kontrast, lav ΔΨm er forbundet med et forhøyet nivå av frie radikaler og redusert befruktning rate14. Likevel, ulike miljømessige forbindelser, for eksempel endokrine disruptors, kan indusere mobilnettet stress og føre til en midlertidig økning i ΔΨm, hyperpolarization1,3, økt produksjon av frie radikaler og til slutt, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-klor-1, 1", 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) kan for eksempel undersøke effektene av matbårne giftstoffer på sperm ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, basert på fysiologiske og morfologiske parametere, er ikke god nok til å forutsi sædkvalitet. Mer nøyaktig metoder er nødvendig for å sikre kvaliteten. Her gir vi to mulige metoder for å fastslå kvaliteten basert på vurderinger av sæd membraner: samtidige firemannsrom farging med bestemte fluorescerende sonder og fluorescens mikroskopi, beskrevet i våre studier1,3 og avanserte sæd-dedikerte flowcytometri, nylig benyttet i vårt laboratorium, og allerede brukes av andre16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Standard spermiograms som beskriver kvaliteten er stort sett basert på fysiologiske og visuelle parametere, for eksempel ejaculate volum og konsentrasjon, motilitet og progressiv motilitet, og sæden morfologi og levedyktighet. Men er ingen av disse vurderingene god nok til å forutsi sædkvalitet. Gitt at vedlikehold av sæd levedyktighet og gjødsling potensielle avhenger av membran integritet og intracellulær funksjonalitet, kan evaluering av disse parameterne gjøre en bedre forutsigelse av sæd befruktning kompetanse. Her beskriver vi tre mulige metoder for å vurdere kvaliteten med bestemte fluorescerende sonder kombinert med fluorescens mikroskopi eller flyt cytometri analyser. Analyser vurdert plasma membranen integritet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium iodide (PI), acrosomal membran integritet ved hjelp av fluorescein isothiocyanate-konjugerte erter sativum agglutinin (FITC-PSA) og Mitokondrielt membran integritet bruker 5, 5', 6, 6'-tetra-klor-1, 1", 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Kombinasjoner av disse metodene er også presentert. For eksempel bruk av annexin V kombinert med PI fluorochromes kan vurdere apoptose og beregne andelen apoptotisk sperm (apoptotisk indeks). Vi tror at disse metodene, som er basert på å undersøke spermatozoon membraner, veldig nyttig for vurdering av kvaliteten.

Figur 1 viser samtidige fluorimetric vurdering av sæd membraner (plasma, acrosomal og mitokondrie) bruker PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1. Vurdering av sæd membraner bruker samtidige farging med fire fluorescerende sonder tillater, for eksempel vurdere andelen sperm i hver kategori-live vs døde. høy og lav ΔΨm; intakt vs. skadet acrosome-samtidig i hver spermatozoon.
<str...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Her presenterer vi metoder for å evaluere spermatozoan membran integritet, en cellular funksjon knyttet sperm befruktning kompetanse. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetric vurdering av sæd membraner: samtidige flekker med bestemte fluorescerende sonder, fluorescens mikroskopi og avanserte sæd-dedikert flowcytometri. Eksempler på kombinerte metodikkene er også presentert.

Fluorimetric teknikker for vurdering av Sperm membraner

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Målet med disse prosedyrene er å evaluere spermmembraner integritet ved hjelp av spesifikke fluorescerende sonder kombinert med fluorescens mikroskopi eller flyt cytometri analyse. Disse teknikkene kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen reproduksjon som prediksjon av befruktning potensial og kvaliteten på sperm prøve. Den største fordelen med disse teknikkene er at de muliggjør presis evaluering av flere spermmembraner som er kjent for å assosiere med sperm befruktning potensial.Implikasjonene av disse teknikkene strekker seg mot diagnose av ejakulatkvalitet, da det muliggjør mer nøyaktig evaluering av spermplasma og akrosom membranintegritet samt mitokondriemembranpotensial. For å begynne denne prosedyren, få omtrent en til seks milliliter oksese sæd i et 15 milliliter rør ved romtemperatur. Tilsett seks milliliter NKM-buffer forhåndsoppvarmet til 37 grader Celsius til hver en milliliter sæd.Sentrifuge på 600 ganger g i åtte minutter. Gjenta sentrifugeringen en eller to ganger til supernatanten er klar. Etter dette, kast umiddelbart det meste av det supernatante, og etterlater omtrent en centimeter supernatant over pelleten.Len forsiktig rørene i en 30 graders vinkel i inkubatoren og vent 20 til 30 minutter for å la spermatozoa svømme opp. Ved hjelp av en mikropipette fjerner du forsiktig de resterende en milliliter supernatant som nå inneholder motile spermatozoa og overfører den til et friskt 1,5 milliliter rør. Hold sperm på 37 grader Celsius til klar til bruk.Først klargjør du alle nødvendige lagerløsninger som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter overfører du 133 mikroliter av motile spermatozoa i en konsentrasjon på 25 millioner sperms per milliliter til et nytt 1,5 milliliter rør. Tilsett 17 mikroliter av DAPI-arbeidsløsningen og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Sentrifuge ved 1000 ganger g i fem minutter. Kast det overnaturlige og tilsett 100 mikroliter NKM-buffer til pelleten. Deretter legger du til 50 mikroliter FITC-PSA, to mikroliter JC-1 og tre mikroliter pi. Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Sentrifuge ved 1000 ganger g i fem minutter. Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 40 mikroliter NKM buffer. Overfør deretter 10 mikroliter av prøven til et glasssklie.Smør prøven og legg til en dekkslipp. Etter dette begynner du umiddelbart å visualisere prøven ved epifluorescence mikroskopi med et 40X-mål og et trippelfilter som beskrevet i tekstprotokollen, ved hjelp av et digitalt kamera for å fange et eget bilde for hvert filter. Bruk flettealternativet i kameraprogramvaren til å slå sammen de tre bildene som mottas fra filtrene, og lagre den nye filen i JPEG-format.Åpne det sammenslåtte bildet med malingsverktøyet og bruk børstealternativet til å markere den telte spermatozoaen. Deretter klassifiserer du spermatozoa basert på fluorescensen som slippes ut fra hver sonde, og sørger for å evaluere minst 200 spermatozoer per lysbilde. Alle celler skal vises blå fra DAPI.Tell de døde cellene, som ser lilla ut, for å evaluere levedyktigheten. Bruk deretter mønstrene av fluorescensfarging for å evaluere akrosomstatusen. Til slutt, vurdere mitokondriemembranpotensialet ved å skille spermatozoa med høyt mitokondriemembranpotensial som viser en rødfarget midtstykke fra spermatozoa med lavt mitokondriemembranpotensial som viser et grønnfarget midtstykke.Tell røde og grønne mellomstykker separat og beregn forholdet. For å starte plasmamembranintegritetsevalueringen, ta ønsket antall brønner fra levedyktighets- og konsentrasjonssettet. Overfør brønnene til arbeidsbasen og dekk dem med et fleksibelt lokk for å beskytte dem mot lys.Tilsett 199 mikroliter bufret løsning for cytometri til hver brønn. Deretter legger du til en mikroliter homogen sæd i en konsentrasjon på 57 millioner celler per milliliter til hver brønn og homogenisere ved pipettering. Dekk platen med lokket og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter.Deretter kjører du prøven gjennom strømningssytometeret ved hjelp av levedyktighetsinnstillingen. For å begynne å vurdere mitokondriemembranpotensialet, ta ut ønsket antall brønner fra mitokondrieaktivitetssettet. Overfør dem til arbeidsbasen.Tilsett 10 mikroliter absolutt etanol til hver brønn og bruk en pipette til å gjenbruke pulveret som finnes i brønnen. Tilsett 190 mikroliter PBS per brønn og homogeniser ved pipettering. Tilsett 0,75 mikroliter homogen sæd i en konsentrasjon på 57 millioner celler per milliliter til hver brønn og homogenisere ved pipettering.Dekk platen med lokket og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette, kjøre prøven gjennom strømningscytometeret ved hjelp av mitokondrieaktivitetsinnstillingen. For å begynne å vurdere akrosomal membranintegritet, ta ut ønsket antall brønner fra levedyktigheten og akrosom integritetssettet.Overfør brønnene til arbeidsbasen og dekk dem med et fleksibelt lokk for å beskytte dem mot lys. Tilsett 200 mikroliter bufret løsning for cytometri til hver brønn. Tilsett deretter 0,7 mikroliter homogen sæd i en konsentrasjon på 57 millioner celler per milliliter til hver brønn og homogenisere ved pipettering.Dekk platen med lokket og inkuber ved 37 grader Celsius i 45 minutter. Deretter kjører du prøven gjennom strømningssytometeret ved hjelp av innsiktsinnstillingen. I denne studien evalueres sædkvalitet ved hjelp av ulike teknikker, hvorav den ene evaluerte spermmembraner ved hjelp av fluorometriske sonder.Det er mulig å evaluere forskjellene i spermprøvekvalitet når det gjelder membranintegritet. For eksempel hadde ejakulatet av okse nummer syv en relativt lav prosentandel av døde celler, en lav andel sperm med pseudo-reagert akrosom, og høyere mitokondriemembran potensial sammenlignet med ejakulatet av okse nummer én. Prøver evalueres deretter for levedyktighet og mitokondrieaktivitet.Histogrammene for disse representative eksemplene representerer ungated spermatozoa og rusk og inngjerdet spermatozoa. Disse histogrammene representerer også levedyktige og døde celler og fordelingen av spermatozoa til polarisert og depolalisert mitokondriemembran. Den akrosom integriteten evalueres deretter med et bruksklart sett og leses med strømningscytometri, og deler området i tre markørområder som representerer ubetydelige lav fluoriserende celler med intakte ufargede akrosome, lave fluoriserende celler med gjenværende farget del av acrosome, og svært fluoriserende celler med forstyrret akrosom.Mens du prøver disse prosedyrene, Er det viktig å sørge for å forberede riktig den første sperm prøven. Disse teknikkene kan gi innsikt i sperm kvalitet evaluering og kan brukes på ulike organismer som storfe, fjærfe, og menneskelig. Sammenligning mellom de to teknikkene, firedobbel farging og strømningscytometri indikerte ingen signifikante forskjeller for levedyktighet, mitokondriemembranpotensial og den akrosomme integriteten som avslørte at de to teknikkene ga matchende resultater.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Helhetlig vurdering av kimbane Chemical Toxicity Bruke Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering av Maternal vaskulær remodelle under graviditeten i Mouse Livmor

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering av kardiomyocytt DNA syntese og ploidiundersøkelse: En metode for å hjelpe Kvantifisering av kardiomyocytt Regeneration og Omsetning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Vurdering av effektene av endokrine forstyrre forbindelser på utviklingen av virveldyr nettverk funksjon med flere elektrode matriser

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Håndtering og behandling av mannlig europeisk ål (a. anguilla) for hormonelle modning og Sperm kryonisk bevaring

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic analysen for vurdering av leukocytter vedheft til menneskelig indusert Pluripotent Stamcelle-avledet endotelceller (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Vurdering av Ultrastructural Neuroplasticity parametere etter i Utero signaltransduksjon utvikle musen hjernen og ryggmarg

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Måle sperm veiledning og motilitet innenfor Caenorhabditis elegans Hermafroditt reproduktive tarmkanalen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluering av befruktning stat ved tracing sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Anvendelse av mus Parthenogenetic Haploid embryonale stamceller som en erstatning for sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...