Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
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Os autores gostaria de agradecer sua ajuda e cooperação e MS. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, França) para obter assistência com a instalação do instrumento e formação empresa israelense "SION" para inseminação artificial e reprodução (Hafetz-Haim, Israel).

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações de 1994 israelense para o bem-estar animal. Esperma de bovina foi fornecida pela empresa israelense comercial para inseminação artificial e reprodução. Ejacula de 11 touros foram avaliadas neste estudo.
1. preparação da amostra esperma
Nota: O procedimento baseia-se protocolo1,3 no laboratório Roth.
<ol><li>...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Fecundação do esperma potencial depende de múltiplos fatores, refletindo sua qualidade. Uma alta concentração de espermatozoides e uma elevada proporção de espermatozoides móveis altamente progressivamente podem ser considerados o sêmen de alta qualidade. No entanto, essa avaliação não leva em conta outros parâmetros celulares e funcionais. O uso de 'bancada' conta citômetro de fluxo pode ser facilmente adaptado para avaliação de várias estruturas de esperma utilizando sondas fluorescentes, como mostrado...

Integridade e funcionalidade de membranas de esperma são alguns dos fatores indicando a viabilidade do esperma e fertilização potencial. A membrana plasmática funciona como uma barreira entre os compartimentos intracelulares e extracelulares, mantendo assim o equilíbrio osmótico celular1. Qualquer estresse que induz os danos para a integridade da membrana plasmática pode prejudicar a homeostase, reduzir a capacidade de viabilidade e fertilização e aumentar a morte celular. Por exemplo, criopreservação reduz viabilidade de esperma devido a danos a sua membrana plasmática, como resultado de mudanças de temperatura e estresse osmótico2. Informamos anteriormente que expondo o esperma de touro a baixas concentrações de contaminantes de origem alimentar como o pesticida atrazine, diaminochlorotriazine seu metabolito principal ou a aflatoxina micotoxina B1, reduz a viabilidade de esperma1,3 . Isso foi determinado pela rotulagem o DNA de cadeia dupla com DAPI em combinação com PI, que se liga ao DNA de células com uma membrana plasmática danificada.
Reacção acrossómica (AR) envolve a fusão da membrana externa do acrossoma e membrana plasmática sobrejacente, resultando na liberação de enzimas acrossomal4,5. Estes são eventos essenciais para a penetração da zona pelúcida e ainda mais a fusão do espermatozoide com o oócito6. Portanto, a avaliação da integridade da membrana acrossomal constitui um parâmetro útil para avaliar a qualidade do sêmen e a fertilidade masculina7,8,9. Várias técnicas fluorescentes são adequadas para a verificação de integridade do acrossoma, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Em nossos estudos anteriores, usando os padrões de FITC-PSA coloração1,3, desde as definições precisas para (i) acrossoma intacta, (ii) danificado da membrana do acrossoma e (iii) reagiu acrossoma. No relatório atual, podemos avaliar o status de acrossoma usando citometria de fluxo de esperma-dedicado e comparar os resultados com aqueles usando microscopia de fluorescência.
As mitocôndrias são organelas multifuncionais envolvido em, entre outras coisas, ATP síntese, produção de espécies reactivas de oxigénio, sinalização de cálcio e apoptose. Disfunções fisiológicas, incluindo a infertilidade masculina e feminina, estão associadas com alteração da função mitocondrial11. Mitocôndrias de esperma são arranjadas na peça intermediária e desempenham um papel crucial no esperma motilidade12. É bem aceite que o elevado potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) está associado a motilidade normal e alta fertilização capacidade13. Em contraste, ΔΨm baixo está associado um nível elevado de espécies reativas de oxigênio e reduzida taxa de fertilização14. Não obstante, vários compostos ambientais, por exemplo, desreguladores endócrinos, podem induzir estresse celular e levar a um aumento transiente da hiperpolarização1,3, ΔΨm, aumento da produção de radicais livres e, eventualmente, apoptose,15. A sonda fluorescente 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1) permite por exemplo, examinando os efeitos de toxinas de origem alimentar no esperma ΔΨm1,3.
Spermiograms padrão, com base nos parâmetros fisiológicos e morfológicos, não são bons o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Métodos mais precisos são necessários para assegurar a qualidade do esperma. Aqui, nós fornecemos dois métodos viáveis para determinar a qualidade do esperma com base em avaliações de membranas de esperma: coloração quádruplo simultânea com sondas fluorescentes específicas e microscopia de fluorescência, descrito em nossos estudos1,3 e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma, recentemente utilizado em nosso laboratório e já está sendo usado por outros16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Spermiograms padrão, descrevendo a qualidade do esperma baseiam-se principalmente os parâmetros fisiológicos e visuais, tais como o volume de ejaculação e concentração, motilidade e motilidade progressiva e morfologia do esperma e viabilidade. No entanto, nenhuma destas avaliações é bom o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Dado que a manutenção da viabilidade do esperma e fertilização potencial depende da integridade de membrana e funcionalidade intracelular, avaliação desses parâmetros poderá permitir uma melhor previsão de competência de fertilização do espermatozoide. Aqui, descrevemos três métodos viáveis para avaliar a qualidade do esperma utilizando sondas fluorescentes específicas, combinadas com análises de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Análises avaliaram integridade de membrana plasmática usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e iodeto de propidium (PI), integridade da membrana acrossomal usando conjugada com isotiocianato de fluoresceína aglutininas Pisum sativum (FITC-PSA) e integridade de membrana mitocondrial usando 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1). Combinações destes métodos também são apresentadas. Por exemplo, uso de anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico). Acreditamos que essas metodologias, que são baseadas em examinar as membranas do espermatozoide, são muito úteis para a avaliação da qualidade do esperma.

A Figura 1 mostra simultânea fluorimétrica avaliação das membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Avaliação das membranas de esperma usando coloração simultânea com quatro sondas fluorescentes, por exemplo, permite avaliar a proporção de espermatozoides em cada categoria — live vs mortos; alta vs baixa ΔΨm; intacta vs. danificado o acrossoma — simultaneamente para ca...

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Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

O objetivo desses procedimentos é avaliar a integridade das membranas espermatozoides utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas com microscopia de fluorescência ou análise de citometria de fluxo. Essas técnicas podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da reprodução, como a previsão do potencial de fertilização e a qualidade da amostra de espermatozoides. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem uma avaliação precisa de múltiplas membranas espermatozoides que são conhecidas por associar-se ao potencial de fertilização do esperma.As implicações dessas técnicas se estendem para o diagnóstico da qualidade da ejaculação, pois permite uma avaliação mais precisa do plasma de espermatozoides e da integridade da membrana acrosana, bem como do potencial da membrana mitocondrial. Para iniciar este procedimento, obtenha aproximadamente um a seis mililitros de sêmen de touro em um tubo de 15 mililitros à temperatura ambiente. Adicione seis mililitros de tampão NKM pré-aquecido a 37 graus Celsius a cada um mililitro de sêmen.Centrifugar a 600 vezes g por oito minutos. Repita a centrifugação uma ou duas vezes até que o sobrenatante esteja limpo. Depois disso, descarte imediatamente a maior parte do supernante, deixando aproximadamente um centímetro de sobrenante acima da pelota.Incline cuidadosamente os tubos em um ângulo de 30 graus na incubadora e espere de 20 a 30 minutos para permitir que os espermatozoides nadem para cima. Usando uma micropipette, remova cuidadosamente o mililitro restante de supernadário que agora contém o espermatozoide motile e transfira-o para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Mantenha o esperma a 37 graus Celsius até estar pronto para usar.Primeiro, prepare todas as soluções de estoque necessárias, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira 133 microliters do espermatozoide motile a uma concentração de 25 milhões de espermatozoides por mililitro para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 17 microliters da solução de trabalho DAPI e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione 100 microliters de tampão NKM à pelota. Em seguida, adicione 50 microliters de FITC-PSA, dois microliters de JC-1, e três microliters de PI. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Centrifugar a 1.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 40 microliters de tampão NKM. Em seguida, transfira 10 microliters da amostra para um slide de vidro.Esfregue a amostra e adicione uma mancha de cobertura. Depois disso, imediatamente comece a visualizar a amostra por microscopia de epifluorescência com um objetivo de 40X e um filtro triplo conforme descrito no protocolo de texto, usando uma câmera digital para capturar uma imagem separada para cada filtro. Use a opção mesclar no software da câmera para mesclar as três imagens recebidas dos filtros, salvando o novo arquivo no formato JPEG.Abra a imagem mesclada com a ferramenta de pintura e use a opção pincel para marcar o espermatozoide contado. Em seguida, classifique o espermatozoário com base na fluorescência emitida de cada sonda, certificando-se de avaliar pelo menos 200 espermatozoides por slide. Todas as células devem parecer azuis do DAPI.Conte as células mortas, que parecem roxas, para avaliar a viabilidade. Em seguida, use os padrões de coloração de fluorescência para avaliar o estado acrosto. Por fim, avalie o potencial da membrana mitocondrial distinguindo os espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de vermelho do espermatozoário com baixo potencial de membrana mitocondrial que exibem uma peça média manchada de verde.Conte as peças vermelhas e verdes separadamente e calcule sua razão. Para iniciar a avaliação da integridade da membrana plasmática, pegue o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e concentração. Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz.Adicione 199 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione um microliter de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação. Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando o ajuste de viabilidade. Para começar a avaliar o potencial da membrana mitocondrial, retire o número desejado de poços do kit de atividade mitocondrial. Transfira-os para a base de trabalho.Adicione 10 microliters de etanol absoluto a cada poço e use uma pipeta para resuspensar o pó presente dentro do poço. Adicione 190 microliters de PBS por poço e homogeneize por pipetação. Adicione 0,75 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citómetro de fluxo usando a configuração de atividade mitocondrial. Para começar a avaliar a integridade da membrana acrosomal, retire o número desejado de poços a partir do kit de viabilidade e integridade acrosma.Transfira os poços para a base de trabalho e cubra-os com uma tampa flexível para protegê-los da luz. Adicione 200 microliters de solução tamponada para citometria a cada poço. Em seguida, adicione 0,7 microliters de sêmen homogêneo a uma concentração de 57 milhões de células por mililitro a cada poço e homogeneize por pipetação.Cubra a placa com a tampa e incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Depois disso, execute a amostra através do citômetro de fluxo usando a configuração de insight. Neste estudo, a qualidade do sêmen é avaliada utilizando-se diferentes técnicas, uma das quais avaliou as membranas espermatozoides utilizando sondas fluorométricas.É possível avaliar as diferenças na qualidade da amostra de esperma em termos de integridade da membrana. Por exemplo, a ejaculação do touro número sete tinha uma porcentagem relativamente baixa de células mortas, uma baixa proporção de espermatozoides com acrossomo pseudo-reagido, e maior potencial de membrana mitocondrial quando comparado com a ejaculação do touro número um. As amostras são então avaliadas para viabilidade e atividade mitocondrial.Os histogramas para esses exemplos representativos representam os espermatozoides untados e os detritos e os espermatozoides fechados. Esses histogramas também representam as células viáveis e mortas e a distribuição de espermatozoides à membrana mitocondrial polarizada e des polarizada. A integridade acrosma é então avaliada com um kit pronto para uso e lida com citometria de fluxo, dividindo a área em três áreas de marcador que representam células de baixa fluorescing insignificantes com acrosmos intactas não manchadas, células fluorescentes baixas com parte manchada residual do acrosomo, e células altamente fluorescentes com acrooso interrompido.Ao tentar esses procedimentos, é importante ter certeza de preparar adequadamente a amostra inicial de espermatozoides. Essas técnicas podem fornecer insights sobre a avaliação da qualidade do esperma e podem ser aplicadas a vários organismos, como bovinos, aves e humanos. A comparação entre as duas técnicas, a coloração quádrupla e a citometria de fluxo não indicaram diferenças significativas para a viabilidade, o potencial da membrana mitocondrial e a integridade acrosma revelando que as duas técnicas produziram resultados correspondentes.

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Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulação e tratamento de macho Europeu enguias (Anguilla anguilla) para maturação Hormonal e criopreservação de esperma

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...