Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Författarna vill tacka ”SION” israeliska företaget för artificiell insemination och avel (Hafetz-Haim, Israel) för deras hjälp och samarbete och Ms. Li Na (IMV teknik, L'Aigle, Frankrike) för hjälp med instrumentet installation och utbildning.

Alla experimenten utfördes enligt 1994 israeliska riktlinjer för djurens välbefinnande. Bovin spermier levererades av kommersiella israeliska företaget för artificiell insemination och avel. Får utlösning av 11 tjurar utvärderades i denna studie.
1. sperma provberedning
Obs: Förfarandet bygger på Roth laboratoriets protokoll1,3.
<ol><li>Erhålla cirka 1 – 6 mL av bull sperma i ...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Spermier befruktning potentiella beror på flera faktorer avspeglar dess kvalitet. En hög koncentration av spermier och en hög andel mycket progressivt motila spermier kan anses hög kvalitet sperma. Dock sådan utvärdering tar inte hänsyn till andra cellulära och funktionella parametrar. Användningen av 'bänk' microcapillary flödescytometer kan lätt anpassas till utvärdering av olika spermier strukturer med fluorescerande sonder, som tidigare visat av andra17 och visade häri (teknik #3...

Integritet och funktionalitet av spermier membran är några av de faktorer som indikerar spermier livskraft och befruktning potentiella. Plasmamembranet fungerar som en barriär mellan intracellulär och extracellulär fack, därigenom bibehålla den cellulära osmotiska balans1. Stress som inducerar skador på plasmamembranet integritet kan försämra homeostas, minska livskraft och befruktning kapacitet och öka celldöd. Exempelvis minskar frysförvaring spermier lönsamhet på grund av skada till dess plasmamembran, till följd av temperaturväxlingar och osmotisk stress2. Tidigare rapporterade vi att utsätta bull spermier till låga koncentrationer av livsmedelsburna föroreningar såsom de bekämpningsmedel atrazin, dess huvudmetabolit diaminochlorotriazine eller den mykotoxin aflatoxin B1, minskar spermier livskraft1,3 . Detta bestämdes av märkning dubbelsträngat DNA med DAPI i kombination med PI, som binder till DNA celler med skadat plasma membran.
Akrosomen reaktion (AR) innebär fusion av yttre akrosomen membranet och överliggande plasmamembranet vilket resulterar i utsläpp av acrosomal enzymer4,5. Dessa är väsentliga händelser zona pellucida penetration och ytterligare sammanslagning av spermier med äggcellen6. Utvärdering av acrosomal membran integritet utgör därför en användbar parameter för att utvärdera sperma kvalitet och manlig fertilitet7,8,9. Flera fluorescerande tekniker är lämpliga för verifiering av akrosomen integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våra tidigare studier, med mönster av FITC-PSA färgning1,3, vi förutsatt korrekt definitioner för (i) intakt akrosomen, (ii) skadats akrosomen membran och (iii) reagerade akrosomen. I det aktuella betänkandet vi utvärdera akrosomen status med hjälp av spermier-dedikerad flödescytometri och jämföra resultaten till de som använder fluorescensmikroskopi.
Mitokondrierna är multifunktionella organeller involverad i, bland annat ATP syntes, reaktivt syre arter produktion, Kalciumsignalering och apoptos. Fysiologiska störningar, inklusive manlig och kvinnlig infertilitet, är associerade med förändrad mitokondriefunktion11. Spermier mitokondrier är ordnade i midpiece och spelar en avgörande roll i spermier motilitet12. Det är väl accepterat att hög mitokondriella membranpotential (ΔΨm) är förknippad med normala motilitet och hög befruktning kapacitet13. Däremot låg ΔΨm är associerade med en förhöjd nivå av reaktiva syreradikaler och minskad gödsling ränta14. Ändå kan olika miljömässiga föreningar, till exempel hormonstörande ämnen, inducera cellulär stress och leda till en övergående förhöjning av ΔΨm, hyperpolarisering1,3, ökad produktion av fria radikaler och så småningom apoptos15. Fluorescerande sonden 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1) möjliggör till exempel att undersöka effekterna av livsmedelsburna gifter på spermier ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, utifrån fysiologiska och morfologiska parametrar, är inte tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvalitet. Noggrannare metoder måste säkerställa spermiekvalitet. Här, vi ger två möjliga metoder för att bestämma spermiernas kvalitet baserat på utvärderingar av spermier membran: samtidiga Fyrbäddsrum färgning med specifika fluorescerande sonder och fluorescensmikroskopi, beskrivs i våra studier1,3 och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri, nyligen används i vårt laboratorium, och redan används av andra16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Standard spermiograms som beskriver spermiekvalitet är mestadels baserade på fysiologiska och visuella parametrar, såsom ejakulat volym och koncentration, motilitet och progressiv motilitet, och spermiernas morfologi och. Ingen av dessa bedömningar är dock tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvaliteten. Med tanke på att underhållet av spermier livskraft och befruktning potentiella beror på membran integritet och intracellulära funktionalitet, kan utvärdering av dessa parametrar aktivera en bättre Prediktion av spermier befruktning kompetens. Vi beskriver här, tre möjliga metoder för att utvärdera spermiernas kvalitet använder specifika fluorescerande sonder kombinerat med fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometri analyser. Analyser bedöms plasmamembranet integritet använder 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och propidium jodid (PI), acrosomal membran integritet med fluorescein isotiocyanat-konjugerad Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) och mitokondriella membranet integritet använder 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1). Kombinationer av dessa metoder presenteras också. Exempelvis användning av annexin V kombinerat med PI fluorokromer gör bedömningen av apoptos och beräkning av andelen apoptotiska spermier (apoptotiska index). Vi anser att dessa metoder, som bygger på att undersöka spermie membran, är mycket användbart för utvärdering av spermiernas kvalitet.

Figur 1 visar samtidiga fluorimetriskt bedömning av spermier membran (plasma, acrosomal och mitokondrie) använda PI, DAPI, FITC-PSA och JC-1. Bedömning av spermier membran med samtidiga färgning med fyra fluorescerande sonder tillåter, till exempel utvärdera andelen spermier i varje kategori – live vs döda; hög vs. låg ΔΨm; intakt vs. skadad akrosomen — samtidigt för varje spermie.
<p class="jove_content" fo:keep...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Här presenterar vi metoder för att utvärdera spermatozoan membran integritet, en cellulär funktion som är associerad med spermier befruktning kompetens. Vi beskriver tre tekniker för fluorimetriskt bedömning av spermier membran: samtidiga färgning med specifika fluorescerande sonder, fluorescensmikroskopi och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri. Exempel att kombinera metoderna presenteras också.

Fluorimetriskt tekniker för bedömning av spermier membran

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Målet med dessa förfaranden är att utvärdera spermier membranen integritet med hjälp av specifika fluorescerande sonder i kombination med fluorescens mikroskopi eller flöde cytometry analys. Dessa tekniker kan hjälpa till att svara på viktiga frågor inom reproduktion såsom förutsägelse av befruktning potential och kvalitet spermieprov. Den största fördelen med dessa tekniker är att de möjliggör exakt utvärdering av flera spermier membran som är kända för att associera med spermier befruktning potential.Konsekvenserna av dessa tekniker sträcker sig mot diagnos av ejakulat kvalitet som det möjliggör mer exakt utvärdering av spermier plasma och acrosome membran integritet samt mitokondriellt membran potential. För att påbörja detta förfarande, erhålla ungefär en till sex milliliter tjur sperma i en 15 milliliter rör vid rumstemperatur. Tillsätt sex milliliter NKM buffert förvörd till 37 grader Celsius till varje en milliliter sperma.Centrifugera vid 600 gånger g i åtta minuter. Upprepa centrifugeringen en eller två gånger tills supernatanten är klar. Efter detta, omedelbart kasta de flesta av supernatanten, lämnar cirka en centimeter av supernatant ovanför pelleten.Luta försiktigt rören i 30 graders vinkel i inkubatorn och vänta 20 till 30 minuter för att låta spermatozoa simma upp. Med hjälp av en mikropipette, ta försiktigt bort de återstående en milliliter av supernatant som nu innehåller den motila spermatozoa och överföra den till en färsk 1,5 milliliter rör. Håll spermierna på 37 grader Celsius tills den är klar att använda.Först förbereda alla be sin nödvändiga lagerlösningar som beskrivs i textprotokollet. Därefter överför 133 mikroliter av den motila spermatozoen vid en koncentration av 25 miljoner spermier per milliliter till ett nytt 1,5 milliliterrör. Tillsätt 17 mikroliter av DAPI arbetslösningen och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter.Centrifugera vid 1, 000 gånger g i fem minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 100 mikroliter av NKM-buffert till pelleten. Därefter lägger du till 50 mikroliter av FITC-PSA, två mikroliter av JC-1 och tre mikroliter av PI. Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter.Centrifugera vid 1, 000 gånger g i fem minuter. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 40 mikroliter av NKM-buffert. Överför sedan 10 mikroliter av provet till en glasrutschbana.Smeta ut provet och tillsätt ett täckskydd. Efter detta, omedelbart börja visualisera provet genom epifluorescens mikroskopi med en 40X mål och en trippel filter som beskrivs i textprotokollet, med hjälp av en digitalkamera för att fånga en separat bild för varje filter. Använd kopplingsalternativet i kamerans programvara för att sammanfoga de tre bilder som tas emot från filtren, vilket sparar den nya filen i JPEG-format.Öppna den sammanslagna bilden med färgverktyget och använd penselalternativet för att markera den räknade spermatozoen. Därefter klassificera spermatozoa baserat på fluorescens som avges från varje sond, se till att utvärdera minst 200 spermatozoa per bild. Alla celler ska visas blå från DAPI.Räkna de döda cellerna, som verkar lila, för att utvärdera livskraften. Använd sedan mönster fluorescensfärgning för att utvärdera den acrosome status. Slutligen utvärdera mitokondriellt membran potential genom att skilja spermatozoa med hög mitokondriellt membran potential som uppvisar en röd-färgade midpiece från spermatozoa med låg mitokondriellt membran potential som uppvisar en grön-färgade midpiece.Räkna röda och gröna mellanstycken separat och beräkna deras förhållande. För att börja utvärderingen av plasmamembranens integritet, ta önskat antal brunnar från livskraften och koncentrationssatsen. Överför brunnarna till arbetsbasen och täck dem med ett flexibelt lock för att skydda dem mot ljus.Lägg till 199 mikroliter av buffrad lösning för cytometri till varje brunn. Tillsätt sedan en mikroliter homogen sperma vid en koncentration av 57 miljoner celler per milliliter till varje brunn och homogenisera genom pipettering. Täck plattan med locket och inkubera i 37 grader Celsius i 10 minuter.Efter detta, kör provet genom flödescytometern med hjälp av viabilitetsinställningen. För att börja bedöma mitokondriellt membran potential, ta ut det önskade antalet brunnar från mitokondriell aktivitet kit. Överför dem till arbetsbasen.Tillsätt 10 mikroliter absolut etanol till varje brunn och använd en pipett för att återanvända pulvret som finns i brunnen. Tillsätt 190 mikroliter pbs per brunn och homogenisera genom pipettering. Tillsätt 0,75 mikroliter av homogen sperma vid en koncentration av 57 miljoner celler per milliliter till varje brunn och homogenisera genom pipettering.Täck plattan med locket och inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta kör du provet genom flödescytometern med hjälp av mitokondriell aktivitetsinställningen. För att börja bedöma acrosomal membran integritet, ta ut det önskade antalet brunnar från livskraften och acrosome integritet kit.Överför brunnarna till arbetsbasen och täck dem med ett flexibelt lock för att skydda dem mot ljus. Lägg till 200 mikroliter av buffrad lösning för cytometri till varje brunn. Tillsätt sedan 0,7 mikroliter av homogen sperma vid en koncentration av 57 miljoner celler per milliliter till varje brunn och homogenisera genom pipettering.Täck plattan med locket och inkubera i 37 grader Celsius i 45 minuter. Efter detta kör du provet genom flödescytometern med hjälp av inställningen för insikt. I denna studie utvärderas spermakvaliteten med hjälp av olika tekniker, varav en utvärderade spermiemembran med hjälp av fluorometriska sonder.Det är möjligt att utvärdera skillnaderna i spermieprovkvalitet i fråga om membranintegritet. Till exempel hade ejakulatet av tjur nummer sju en relativt låg andel döda celler, en låg andel spermier med pseudoreagererad acrosome, och högre mitokondriell membranpotential jämfört med ejakulat av tjur nummer ett. Prover utvärderas sedan för livskraft och mitokondriell aktivitet.Histogrammen för dessa representativa exempel representerar den ungated spermatozoa och skräp och gated spermatozoa. Dessa histogram representerar också de livskraftiga och döda cellerna och fördelningen av spermatozoa till polariserat och avpolariserat mitokondriellt membran. Den acrosome integriteten utvärderas sedan med en färdig att använda kit och läsa med flödescytometri, dela upp området i tre markörområden som representerar försumbara låg fluorescerande celler med intakt ouppnådda acrosome, låg fluorescerande celler med resterande färgade delen av den acrosome, och mycket fluorescerande celler med störd acrosome.Samtidigt försöker dessa förfaranden, Det är viktigt att se till att förbereda ordentligt det initiala spermieprovet. Dessa tekniker kan ge insikt i spermiekvalitet utvärdering och kan tillämpas på olika organismer såsom nötkreatur, fjäderfä, och mänskliga. Jämförelse mellan de två teknikerna, fyrdubbla färgning och flöde cytometry anges inga signifikanta skillnader för livskraft, mitokondriellt membran potential, och den acrosome integritet avslöjar att de två teknikerna gav matchande resultat.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattande Bedömning av nedärvda Kemisk toxicitet Använda Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Bedömning av Maternal kärlremodellering under graviditeten i musen livmoder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Bedömning av cardiomyocyte DNA-syntes och ploiditet: En metod för att Assist Kvantifiering av cardiomyocyte Regeneration och omsättning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bedömning av effekterna av hormonstörande föreningar på utvecklingen av Vertebrate neurala nätverk-funktion som använder multi elektrod matriser

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Hantering och behandling av manliga europeisk ål (Anguilla anguilla) för hormonella mognad och spermier frysförvaring

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Mikroflödessystem test för bedömning av leukocyt vidhäftning till mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived endotelceller (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Bedömning av ultrastrukturella neuroplasticitet parametrar efter i Utero transduktion i utvecklingsländer mus hjärnan och ryggmärgen

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Mätning av spermie vägledning och motilitet inom Caenorhabditis elegans hermaphrodite reproduktions organen

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Utvärdering av fertilisering staten genom att spåra spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Applicering av musen parthenogenetiska haploida embryonala stamceller som ersättning för spermier

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...