Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Yazarlar "SION" İsrail şirketi Suni tohumlama ve üreme (Hafetz-Haim, İsrail) için onların yardım ve işbirliği ve Bayan Li Na (te teknolojileri, L'Aigle, Fransa) araç kurulum ve eğitim ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm deneyler için hayvan refah 1994 İsrail yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sığır sperm Suni tohumlama ve ıslahı için ticari İsrail şirketi tarafından sağlandı. Cinsel ilißki 11 boğa bu çalışmada değerlendirildi.
1. sperm hazırlama örnek
Not: Yordamı Roth Laboratuvarı protokol1,3temel alır.
<ol><li>Yaklaşık 1-6 mL, Boğa Meni oda sıcaklığınd...

<ol>
	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Sperm fertilizasyon potansiyel çoklu kalitesini yansıtan faktöre bağlıdır. Sperm hücreleri yüksek konsantrasyon ve çok kademeli hareketli sperm hücreleri yüksek oranda yüksek kaliteli sperm kabul olabilir. Yine de, böyle bir değerlendirme dikkate almaz diğer hücresel ve fonksiyonel parametreler. 'Tezgah üstü' microcapillary akış sitometresi kullanımı floresan problar, daha önce başkaları tarafından17 gösterilen ve burada (tekniği #3) gösterildiği gibi kullanarak çeş...

Bütünlük ve sperm membran işlevselliğini sperm canlılığı ve fertilizasyon potansiyeli gösteren faktörlerden birkaçıdır. Plazma zarı böylece hücresel ozmotik denge1bakımı, hücre içi ve hücre dışı bölmeleri arasında bir bariyer görevi görür. Plazma membran bütünlüğü zarar indükler herhangi bir stres homeostazı bozabilir, canlılık ve döllenme kapasite azaltmak ve hücre ölümü artırmak. Örneğin, dondurma sperm canlılığı nedeniyle sıcaklık değişiklikleri ve ozmotik stres2bir sonucu olarak onun plazma zarı zarar azaltır. Biz daha önce gıda kaynaklı kirleticiler pestisit atrazine, onun büyük metaboliti diaminochlorotriazine veya mikotoksin Aflatoksin B1, gibi düşük konsantrasyonlarda boğa sperm açığa sperm canlılığı1,3 azaltır rapor . Bu PI, hasarlı bir plazma zarı içeren hücrelerin DNA bağlar ile birlikte çift iplikçikli DNA DAPI ile etiketleme tarafından tespit edilmiştir.
Füzyon acrosomal enzimler4,5sürümde kaynaklanan örten plazma zarı ve dış acrosome membran acrosome reaksiyon (AR) içerir. Zona pelusida penetrasyon ve daha fazla sperm yumurta6ile birleştirilmesi için önemli olaylar bunlar. Bu nedenle, acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi erkek üreme7,8,9ve sperm kalitesini değerlendirmek için yararlı bir parametre kabul ettiğiniz anlamına gelir. Çeşitli floresan teknikler acrosome bütünlüğü, FITC-PNA uygulamasına ait veya FITC-PSA8,10doğrulaması için uygundur. FITC-PSA boyama1,3, kalıpları kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz sağlam acrosome doğru tanımları (ı) için sağlanan (II) zarar acrosome membran ve (iii) acrosome tepki gösterdi. Geçerli rapordaki sperm adanmış akış sitometresi kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek ve bu floresans mikroskobu kullanarak sonuçları karşılaştırın.
Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri, diğer şeyler, ATP sentezi, reaktif oksijen türleri üretim, kalsiyum sinyal ve Apoptozis arasında yer vardır. Fizyolojik işlev bozuklukları, kısırlık, erkek ve kadın da dahil olmak üzere değiştirilmiş mitokondriyal işlev11ile ilişkilidir. Sperm mitokondri midpiece içinde düzenlenir ve sperm hareketliliği12' çok önemli bir rol oynamaktadır. İyi yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) yüksek fertilizasyon kapasitesi13ve normal hareket ile ilişkili olduğunu kabul edilir. Buna ek olarak, düşük ΔΨm reaktif oksijen türleri yükseltilmiş bir düzeyiyle ilişkilidir ve döllenme oranı14düşük. Yine de, çeşitli çevresel bileşenleri, örneğin Endokrin bozucular, hücresel stres teşvik ve ΔΨm, hyperpolarization1,3, artan üretim serbest radikallerin ve sonunda geçici bir artış yol, Apoptozis15. Floresan sonda 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1) sağlar örneğin, sperm ΔΨm1,3gıda kaynaklı toksinler etkilerini inceleyerek.
Standart spermiograms fizyolojik ve morfolojik parametreleri temel alınarak, sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değildir. Daha doğru yöntemleri sperm kalitesini sağlamak için gereklidir. Burada, sperm membran değerlendirme üzerinde dayalı sperm kalitesini belirlemek için kullanabileceğiniz iki uygun yöntem sağlamak: aynı anda dört kişilik belirli floresan problar ve bizim çalışmalar1,3 ' te açıklanan floresans mikroskobu ile boyama ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi, son zamanlarda kullanılan bizim laboratuvar ve başkaları tarafından zaten kullanılmakta16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Standart spermiograms sperm kalitesini açıklayan çoğunlukla ejakülat hacmi ve konsantrasyonu, hareketliliği ve ilerici hareketliliği ve sperm morfolojisi ve canlılık gibi fizyolojik ve görsel parametreleri temel alır. Ancak, bu değerlendirmeler sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değil. Sperm canlılığı ve döllenme potansiyel bakım membran bütünlüğü ve hücre içi işlevine bağlıdır göz önüne alındığında, bu parametrelerin değerlendirilmesi daha iyi bir tahmin sperm fertilizasyon yeterlilik etkinleştirmek. Burada, floresan mikroskopi veya akış sitometresi analizleri ile birlikte belirli floresan problar kullanarak sperm kalitesini değerlendirmek için üç uygun yöntemleri açıklanmaktadır. Analizleri değerlendirildi plazma membran bütünlüğü (DAPI) 4', 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak ve propidium iyodür (PI), acrosomal membran bütünlüğü floresein isothiocyanate Birleşik kullanarak Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) ve Mitokondrial membran bütünlüğü kullanarak 5, 5', 6, 6'-tetra-kloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1). Bu yöntemler kombinasyonları da sunulmaktadır. Örneğin, V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte. Spermatozoon membranlar inceleyerek üzerinde temel alır, bu metodolojileri sperm kalitesinin değerlendirilmesi için çok yararlı olduğuna inanıyoruz.

Şekil 1 gösterir aynı anda fluorimetric sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) değerlendirilmesi PI, DAPI, FITC-PSA ve JC-1 kullanarak. Aynı anda dört floresan problar ile boyama kullanarak sperm membran değerlendirmesini sağlar, örneğin, her kategoride sperm oranı değerlendirilmesi — canlı ölü vs ; yüksek ve düşük ΔΨm; sağlam vs. acrosome zarar — aynı anda her spermatozoon için.
<p class="...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes at JoVE.com

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.

Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Bu işlemlerin amacı, floresan mikroskopi veya akış sitometri analizi ile birlikte spesifik floresan problar kullanarak sperm zarlarının bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu teknikler, üreme alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir, örneğin döllenme potansiyelinin tahmini ve sperm numunesinin kalitesi gibi. Bu tekniklerin en büyük avantajı, sperm döllenme potansiyeli ile ilişkilendirdiği bilinen birden fazla sperm zarının hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlamaktır.Bu tekniklerin etkileri, sperm plazması ve akrozom membran bütünlüğünün ve mitokondriyal membran potansiyelinin daha doğru değerlendirilmesini sağladığı için boşalma kalitesinin tanısına doğru uzanır. Bu prosedüre başlamak için, oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüp içinde yaklaşık 1-6 mililitre boğa meni elde edin. Her bir mililitre meniye 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış altı mililitre NKM tampon ekleyin.8 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Santrifüj, süpernatant temizolana kadar bir veya iki kez tekrarlayın. Bundan sonra, hemen pelet üzerinde supernatant yaklaşık bir santimetre bırakarak, supernatant en atın.Tüpleri kuvözde 30 derecelik bir açıyla dikkatlice yaslayın ve spermatozoanın yüzmesini sağlamak için 20 ila 30 dakika bekleyin. Bir mikropipet kullanarak, dikkatle şimdi hareketli spermatozoa içeren supernatant kalan bir mililitre kaldırmak ve taze bir 1.5 mililitretüp aktarın. Kullanıma hazır olana kadar spermi 37 derecede tutun.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm stok çözümlerini hazırlayın. Daha sonra, 133 mikrolitre hareketli spermatozoa mililitre başına 25 milyon sperm konsantrasyonu ile yeni bir 1.5 mililitretüp aktarın. DAPI çalışma çözeltisi 17 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve pelet nkm tampon 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, 50 mikrolitre FITC-PSA, iki mikrolitre JC-1 ve üç mikrolitre PI ekleyin. 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yat.Santrifüj 1,000 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve NKM tampon 40 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra numunenin 10 mikrolitresini cam bir slayta aktarın.Örneği smear ve bir coverslip ekleyin. Bundan sonra, her filtre için ayrı bir görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi 40X objektif ve üçlü filtre ile epifloresan mikroskobu ile örneği görselleştirmeye hemen başlayın. Filtrelerden alınan üç görüntüyü birleştirmek ve yeni dosyayı JPEG biçiminde kaydetmek için kamera yazılımındaki birleştirme seçeneğini kullanın.Birleştirilmiş görüntüyü boya aletiyle açın ve sayılan spermatozoayı işaretlemek için fırça seçeneğini kullanın. Daha sonra, spermatozoa'yı her probdan yayılan floresan göre sınıflandırın ve slayt başına en az 200 spermatozoa değerlendirin. Tüm hücreler DAPI'den mavi görünmelidir.Canlılığı değerlendirmek için mor görünen ölü hücreleri sayın. Daha sonra akrozom durumunu değerlendirmek için floresan boyama desenleri kullanın. Son olarak, yeşil lekeli bir orta parçası sergileyen düşük mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoadan kırmızı lekeli bir orta parça sergileyen yüksek mitokondriyal membran potansiyeline sahip spermatozoayı ayırt ederek mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirin.Kırmızı ve yeşil midleri ayrı ayrı sayın ve oranlarını hesaplayın. Plazma membran bütünlüğü değerlendirmesine başlamak için, canlılık ve konsantrasyon kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın.Her kuyuya sitometri için 199 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda bir mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin. Kapağı kapağı ile kapak ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka.Bundan sonra, canlılık ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmeye başlamak için mitokondriyal aktivite kitinden istenilen sayıda kuyu alın. Onları çalışma üssüne aktarın.Her kuyuya 10 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve kuyunun içindeki tozu yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Kuyu başına 190 mikrolitre PBS ekleyin ve pipetleme ile homojenize. Her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,75 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenleştirin.Kapağı kapağı ile kapak ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, mitokondriyal aktivite ayarını kullanarak numuneyi akış sitometresinde çalıştırın. Akzonomal membran bütünlüğünü değerlendirmeye başlamak için, canlılık ve akrozom bütünlük kitinden istenilen sayıda kuyu çıkarın.Kuyuları çalışma tabanına aktarın ve ışıktan korumak için onları esnek bir kapakla kapatın. Her kuyuya sitometri için 200 mikrolitre arabellekli çözelti ekleyin. Daha sonra her kuyuya mililitre başına 57 milyon hücre konsantrasyonunda 0,7 mikrolitre homojen meni ekleyin ve pipetleme ile homojenize edin.Kapağı kapağı ile kapak ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bundan sonra, içgörü ayarını kullanarak örneği akış sitometresi üzerinden çalıştırın. Bu çalışmada meni kalitesi farklı teknikler kullanılarak değerlendirilmekte olup, bunlardan biri florometrik problar kullanılarak sperm membranları değerlendirilmiştir.Sperm numunesi kalitesindeki farklılıkları membran bütünlüğü açısından değerlendirmek mümkündür. Örneğin, yedi numaralı boğanın boşalması ölü hücrelerin nispeten düşük bir yüzdesine, psödo-tepkili akrozom ile sperm düşük bir oranda ve boğa bir numaralı boşalma ile karşılaştırıldığında daha yüksek mitokondriyal membran potansiyeli vardı. Örnekler daha sonra canlılık ve mitokondriyal aktivite açısından değerlendirilir.Bu temsili örnekler için histogramlar ungated spermatozoa ve enkaz ve kapılı spermatozoa temsil eder. Bu histogramlar aynı zamanda canlı ve ölü hücreleri ve polarize ve polarize mitokondriyal membran spermatozoa dağılımını temsil eder. Daha sonra akrozom bütünlüğü kullanıma hazır bir kit ile değerlendirilir ve akış sitometrisi ile okunur, alanı, bozulmamış lekesiz akrozom, akrozomun artık lekeli kısmı olan düşük floresan hücreleri ve bozulmuş akrozomlu hücreleri ile ihmal edilebilir düşük floresan hücreleri temsil eden üç marker alana bölünür.Bu prosedürleri çalışırken, doğru ilk sperm örneği hazırlamak için emin olmak önemlidir. Bu teknikler sperm kalitesi değerlendirmesi hakkında bilgi sağlayabilir ve büyükbaş, kümes hayvanları ve insan gibi çeşitli organizmalara uygulanabilir. Bu iki teknik arasında yapılan karşılaştırmada, dörtlü boyama ve akış sitometrisi canlılık, mitokondriyal membran potansiyeli ve akrozom bütünlüğü açısından anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Kullanım ve tedavi, erkek Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla) Hormonal olgunlaşma ve Sperm dondurma için

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...