Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de licence 31771064) ; la Science et la technologie de planification projet la Province du Guangdong (subvention numéros 2013B010404030, 2014A010105029 et 2016A020214012) ; la Science et la technologie de planification projet de Guangzhou (numéro de licence 201607010063) ; et l’Innovation de premier cycle et le programme de formation de l’esprit d’entreprise (numéro de licence 201610559028) ; la National Science Foundation des jeunes scientifiques de la Chine (nombre 31800819 de subventions).

Toutes les procédures de l’expérimentation animale et de cellules souches ont été réalisées selon les directives éthiques du Guide National pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité de l’urbanisme (Guangzhou, Chine) et de Jinan University animalier.
1. préparation de l’échafaudage DPP avec la PLA2 DÉCELLULARISATION méthode14
Remarque : Voir la Figure...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

Le présent protocole rapporte une méthode efficace pour la construction d’une feuille MSC multicouche. Cette feuille de cellules présente une résistance mécanique optimale, la densité de semis cellulaire élevée et bioactivité favorable des cellules souches. En utilisant BMSC à titre d’exemple, la structure cellulaire 3D est rapidement construite avec RAD16-j’ai peptide hydrogel. Après cultivée dans le système de perfusion dynamique, la feuille BMSC multicouche est obtenue avec succès et le BMSC mainte...

Thérapie de cellules souches a été signalée comme un traitement efficace pour de nombreuses maladies ; Cependant, rétention cellulaire faible et faible taux de survie dans la zone cible restent des problèmes critiques après l’injection des cellules souches traditionnelles. Pour résoudre ce problème, les scientifiques ingénierie tissulaire a développé la technique de feuille de cellule. Une feuille d’examen cellule avec la matrice extracellulaire intacte a été tout d’abord préparée à l’aide de la réponse de la température de culture plat1, et ses études de suivi a signalé les améliorations significatives de la conservation de cellules souches et la survie au sein de la strangulation zone2,3. Parmi les méthodes, la construction de la plaque de plusieurs couches de cellules a signalé comme une stratégie efficace pour améliorer la survie de la cellule et la cellule feuille effet thérapeutique3,4. Depuis lors, les scientifiques ont travaillé sur l’élaboration de méthodes de construction différentes cellules feuille afin d’augmenter la quantité de cellules, propriété des cellules souches et des propriétés mécaniques des feuilles cellule. Jusqu'à présent, certains types de plaque de cellules ont été construites et étudiés dans le traitement de l’infarctus du myocarde5, blessures des cartilages6, et peau plaie7.
La bioactivité des cellules souches avant la transplantation a montré une influence émergente sur la régénération des tissus lésés, et les stratégies de construction différentes cellules feuille ont des effets différents sur les cellules souches. D’une part, feuilles de cellules confluentes consistaient seulement à haute densité de cellules souches, et matrices extracellulaires naturelles pourraient être acquis par empilement de feuilles cellule examen8 ou à l’aide de tissus magnétique d’ingénierie techniques9. En revanche, les chercheurs ont développé différents échafaudages pour offrir une résistance mécanique suffisante et un soutien cellule croissance10,11,12, qui a permis une cellule souche basse densité pour assurer la nutrition de l’ensemencement approvisionnement. Cependant, malgré ces approches, l’alimentation faible nutrition efficace au sein de la structure en tôle multicouches cellule reste une préoccupation majeure lors de la construction en vitro . Par conséquent, il est urgent d’un système de construction efficace et réalisable cellule feuille.
Ce protocole décrit les étapes pour préparer une feuille de cellules multilayeredmesenchymal stem cell (MSC). Dans ce système de construction, la résistance mécanique de feuille de cellule est assurée par un DPP. Se fondant sur cet échafaudage, la structure cellulaire 3D peut être construite rapidement avec RAD16-j’ai hydrogel de peptide et un système de perfusion dynamique est utilisée pour la culture de la feuille de plusieurs couches de cellules, afin de stabiliser la structure de feuille 3D cell et de fournir une alimentation suffisante alimentation pour les cellules. Grâce à ce système, une feuille BMSC multicouche a été préparée avec succès et montre un effet thérapeutique optimal sur le rat infarctus du modèle13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Thérapie de cellules souches montre un prometteur future dans la régénération de blessés organes et tissus, et la technique de feuille de cellule a été développée pour améliorer la rétention cellulaire faible et faible taux de survie dans la zone cible. Cependant, au cours du processus de construction in vitro , une solution pour le maintien des cellules souches bioactivité et augmentant la quantité de cellules dans la feuille de la cellule est absolument nécessaire. Ici, ce protocole présente une méthode pour construire une feuille de plusieurs couches de cellules avec des cellules souches favorables bioactivité et opérabilité optimale. DECELLULARISE péricarde porcin (DPP) est préparée par la phospholipase une méthode de DÉCELLULARISATION2 (PLA2) comme l’échafaud de feuille de cellule, et rat cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse (BMSC) sont isolées et élargis comme les cellules ensemencées. La structure en tôle cellulaire multicouche temporaire est construite à l’aide de RAD16-j’ai peptide hydrogel. Enfin, la feuille de la cellule est cultivée avec un système de perfusion dynamique pour stabiliser la structure de tridimensionnelle (3D) et la plaque de cellules pourrait être obtenue après une culture de 48 heures en vitro. Ce protocole fournit une méthode efficace et réalisable pour la construction d’une feuille de plusieurs couches de cellules souches, et la plaque de cellules pourrait être développée comme un produit de thérapie des cellules souches favorables à l’avenir.

Le schéma de la construction de feuille de plusieurs couches de cellules souches est illustré à la Figure 1. Préparer l’échafaud de feuille cellulaire par la méthode de DÉCELLULARISATION PLA2 est la première étape. Basé sur l’échafaud, une structure de cellule 3D temporaire est construite en mélangeant les cellules souches à l’hydrogel de peptide RAD16-1. Afin d’obtenir une feuille de plusieurs couches de cellules avec des cell...

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Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Construction d’une feuille les cellules souches mésenchymateuses multicouche avec un système de Culture dynamique 3D

Cet article fournit une méthode efficace et réalisable pour la construction de plusieurs couches de cellules souches feuilles dont la propriété des cellules souches favorables.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

La thérapie de cellules souches a été largement rapportée comme traitement prometteur pour beaucoup de maladies. Et les techniques de feuille de cellule ont été développées afin d’améliorer la rétention de la cellule et la survie dans les cibles, aussi. Pendant la construction des feuilles cellulaires, l’insuffisance de l’approvisionnement nutritionnel reste un problème clé pour la perte de la fonction des cellules souches, et est une propriété de cellules souches insatisfaisante aurait finalement un effet sur les effets thérapeutiques in vivo.Notre but de préparer le produit disponible de feuille de cellules souches multicouches, notre équipe a développé l’échafaudage cellulaire de poteauxized, de péricardium et de feuille de cellule. Basé sur l’échafaudage, le démarreur de cellules multicoucouches serait rapidement construit avec de l’hydrogène nonapeptide et un système de perfusion dynamique est utilisé pour assurer l’approvisionnement nutritionnel des cellules souches in vitro. Sortez un échafaudage DBP séché et mettez-le au centre de la base noire.Placez un anneau de tension blanc sur l’échafaudage DBP et fixez-le dans le porte-tissus. Assurez-vous que l’échafaudage DBP est totalement fixé dans le porte-tissus. Ajouter 100 médiums de culture de microlitres sur l’échafaudage DBP.Mettez l’échafaud dans l’incubateur de 37 degrés Celsius et laissez-le tremper pendant 15 minutes. Sortez les cellules de l’incubateur, retirez les médiums de culture du plat de culture, lavez doucement les cellules avec deux millilitres de PBS chaud. Retirez tous les PBS du plat de culture et assurez-vous qu’il ne reste plus de liquide.Ajouter deux millilitres à la solution trypsine à 1,25% au plat, et incuber les cellules pendant trois minutes. Arrêtez l’effet trypsine en ajoutant deux millilitres de culture moyenne. Laver délicatement les cellules du plat.Transférer les suspensions cellulaires dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 220 fois la gravité pendant cinq minutes, et obtenir des sédiments cellulaires. Enlevez le surnatant et éliminez les sédiments cellulaires.Suspendre à nouveau les cellules avec la solution de saccharose de 10% millilitre de millilitre. Aspirez la suspension cellulaire de 10 microlitres, et le numéro de cellule de contenu lit un hémocytomètre, extrayez trois millions de cellules et transférez dans votre nouveau tube centrifuge de 1,5 millilitre. Centrifugez les cellules à 220 fois la racine carrée pendant cinq minutes, retirez complètement les supernatants et obtenez les sédiments des cellules.Préparez 20 microlitres solution de saccharose à 10%. Suspendez doucement les cellules et obtenez une suspension uniforme. Ajouter 20 microlitres peptide hydro gel au sommet de la suspension doucement mélanger le gel hydro peptidique, et la suspension des cellules avec le T, sortir l’échafaudage DBP, quitter le porte-tissus, puis aspirer doucement le terre-plein central calcul avec un T.Aspirate le mélange du mélange et ajouter uniformément à l’échafaud DBP.Ajouter un millilitre de calcium au fond du porte-tissus. Ajouter délicatement quatre millilitres de milieu culturel dans le plat de culture, puis sortir la feuille de cellule. Mettez les cellules dans l’incubateur pendant deux heures laissez-le la culture.Le système de perfusion dynamique comprend un récipient de culture de perfusion le gaz échangeant des recréations et une bouteille en verre. Les assemblages sont des systèmes de perfusion dynamiques comme le montre la figure. Ajouter deux terre-pleins hydro millilitres dans la bouteille en verre.Insérez la feuille de cellule dans la chambre du récipient de culture, ajoutez trois médianes de culture millilitres dans le récipient, mettez les systèmes dynamiques de perfusion dans les incubateurs, et commencez à pomper. Ouvrez le récipient de culture dans le couché bipositif. Sortez la feuille de cellule du récipient de culture et mettez-la dans le plat de culture.Utilisez un forceps pour immobiliser le porteur de tissu et utilisez deux autres forceps pour séparer l’anneau de tension blanc de la base noire. Enfin, obtenez la feuille de cellule multicouches. L’échafaudage DBP est transparent.Les reventes sem montre que les collèges capturés et les composants sont complètement réservés. Les feuilles cellulaires peuvent être obtenues et retenues au forceps pour une courte conservation. Ces feuilles de cellule pourraient être transférées sur un tube cylindriforme de 1,5 millilitre.Comme un modèle par exemple en commençant par des affichages cellulaires de BMFC très positif pour le marqueur de cellules souches CD 9O et le CD 29. Après la construction cellulaire, le BMFC’S quittant la feuille de cellule reste des niveaux élevés d’expansion du CD 90 et du CD 29. La construction de la structure cellulaire multicououche est l’étape critique du protocole.Le temps de casserole exige quatre gel d’hydro lorsque la valeur de PH change de SA à neutre, par conséquent, il est important de laver la cellule avec la solution de saccharose pour enlever les ions de surface. En outre, le rapport de volume de suspension cellulaire et panthihydrogel n’est pas bon ami pour construire la structure temporaire multicouche. Après la formation de la structure des cellules souches 3D, vous verrez que le système dynamique de perfusion est important pour stabiliser la structure multicououche ainsi que pour maintenir les viabilités des cellules souches.L’infiltration dynamique de la médiane de culture pourrait faciliter des cellules souches proliférer et extrapoler le contexte cellulaire dans la structure multicouche aussi les thermomètres de culture dynamique devraient être ajustés selon différents types de cellules souches.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

Bio-ingénierie

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