Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummer 31771064); Wissenschaft und Technik Planung Projekt der Provinz Guangdong (Zuschuss Zahlen 2013B010404030, 2014A010105029 und 2016A020214012); Wissenschaft und Technik Planung Projekt von Guangzhou (Grant-Nummer 201607010063); der Student Innovation und Entrepreneurship Trainingsprogramm (Grant-Nummer 201610559028); die National Science Foundation für junge Wissenschaftler von China (Gewährungsnummer 31800819).

Alle Stammzellen und Tierversuch Verfahren wurden nach den ethischen Richtlinien des nationalen Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und durch die Jinan Universität Animal Care and Use Committee (Guangzhou, China) genehmigt.
1. Vorbereitung des DPP-Gerüst mit PLA2 Decellularization Methode14
Hinweis: Siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung des PLA2<...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

Dieses Protokoll meldet eine effiziente Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen MSC-Blatt. Dieses Blatt Zelle weist optimale mechanische Festigkeit, hohe Zelldichte seeding und günstige Stammzellen Bioaktivität. Mit BMSCs als ein Beispiel, die 3D Zellstruktur ist schnell aufgebaut mit RAD16-ich Peptid Hydrogel. Nach in das dynamische Perfusion System kultiviert wird, erhält man das vielschichtige BMSC Blatt erfolgreich und die BMSCs pflegen eine hohe Expression der Stammzell-Marker.
<p class="jove_cont...

Stammzell-Therapie als eine wirksame Behandlung für viele Krankheiten berichtet; niedrige Zelle Retention und Armen überleben innerhalb der Zielzone bleiben jedoch kritische Fragen nach der traditionellen Stammzell-Injektion. Um dieses Problem zu lösen, entwickelte Gewebe-engineering-Wissenschaftler die Zelle Blatt Technik. Eine monolayered Zelle Blatt mit intakten extrazelluläre Matrix war zunächst mithilfe der Temperatur-Antwort Kultur Gericht1vorbereitet, und seine Follow-up Studien berichtet die signifikanten Verbesserungen der Stammzellen Aufbewahrung und Überleben in das infarzierte Bereich2,3. Unter den Methoden Bau der vielschichtigen Zelle Blatt als eine wirksame Strategie zur Verbesserung der Zelle überleben und die Zelle Blatt therapeutische Wirkung3,4berichtet. Seitdem haben Wissenschaftler gearbeitet, auf andere Zelle Blatt Bauweisen zu entwickeln, um die Zelle Höhe, Stammzell-Eigenschaft und mechanischen Eigenschaften der Zelle Blätter erhöhen. So weit, bestimmte Arten von Zelle Blatt wurden konstruiert und studierte bei der Behandlung von Herzinfarkt5, Knorpel Verletzung6, und Haut Wunde7.
Die Bioaktivität der Stammzellen vor der Transplantation zeigten einen aufstrebenden Einfluss auf die Regeneration des verletzten Gewebes, und andere Zelle Blatt Bau Strategien haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Stammzellen. Auf der einen Seite konfluierende Zelle Blätter bestand nur aus High-Density-Stammzellen, und natürliche extrazelluläre Matrizen konnte durch Stapeln monolayered Zelle Blätter8 oder mithilfe magnetischer Tissue engineering Techniken9erworben werden. Auf der anderen Seite entwickelten die Forscher verschiedene Gerüste um ausreichende mechanische Festigkeit und Unterstützung Zelle Wachstum10,11,12, ermöglichte eine niedrige Stammzelle Aussaat Dichte um die Ernährung zu gewährleisten liefern. Die niedrigen effizienten Nährstoffversorgung innerhalb der vielschichtigen Zellstruktur Blatt bleibt jedoch trotz dieser Ansätze ein Hauptanliegen beim in-vitro- Bau. Eine effiziente und praktikable Zelle Blatt Bausystem ist daher dringend erforderlich.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um ein Multilayeredmesenchymal Stammzellen (MSC) Zelle Blatt vorbereiten. In diesem Bausystem bietet ein DPP die Zelle Blatt mechanische Festigkeit. Basierend auf diesem Gerüst, die 3D Zellstruktur kann schnell aufgebaut werden mit RAD16-ich Peptid Hydrogel und eine dynamische Perfusion System wird verwendet, um die Kultur der vielschichtigen Zelle Blatt, um die 3D Blatt Zellstruktur stabilisieren und für eine ausreichende Ernährung Versorgung der Zellen. Mit diesem System, ein vielschichtiges BMSC Blatt wurde erfolgreich erstellt und einen optimalen therapeutischen Effekt auf die Ratte Myokardinfarkt Modell13ausgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Stammzell-Therapie zeigt eine viel versprechende Zukunft bei der Regeneration von verletzten Organ und Gewebe, und die Zelle-Blatt-Technik wurde entwickelt, um die niedrigen Zelle Aufbewahrung und Armen überleben innerhalb der Zielzone zu verbessern. Während des Bauprozesses in Vitro ist eine Lösung für die Aufrechterhaltung der Stammzelle Bioaktivität und Erhöhung der Zelle innerhalb der Zelle Blatt jedoch dringend erforderlich. Dieses Protokoll stellt eine Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale Bedienbarkeit. Decellularized porcinen Perikard (DPP) wird vorbereitet, indem Phospholipase2 (PLA2) Decellularization Methode als die Zelle Blatt Gerüst und Ratte Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind isoliert und als die gesetzten Zellen erweitert. Die temporäre vielschichtigen Zellstruktur Blatt mit RAD16 konstruiert ist-ich Peptid Hydrogel. Schließlich Zelle Blatt ist mit einem dynamischen Perfusion System zu stabilisieren die dreidimensionale (3D) Struktur kultiviert, und die Zelle Blatt konnte nach einer 48-Stunden-Kultur in Vitroabgerufen werden. Dieses Protokoll bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von einem vielschichtigen Stammzell-Blatt und das Blatt Zelle in der Zukunft als günstige Stammzell-Therapie Produkt entwickelt werden könnte.

Die schematische Darstellung der vielschichtigen Stammzell-Blatt Bau ist in Abbildung 1dargestellt. Vorbereitung der Zelle Blatt Gerüst von der PLA-2 -Decellularization-Methode ist der erste Schritt. Basierend auf dem Schafott, entsteht eine temporäre 3D Zellstruktur durch Mischen der Stammzellen mit der RAD16-1-Peptid-Hydrogel. Um ein vielschichtiges Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale mechanische Festigkeit zu erha...

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Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Dieser Artikel bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von vielschichtigen Stammzell-Blätter mit günstigen Stammzell-Eigenschaft.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Die Stammzelltherapie wurde weithin als vielversprechende Behandlung für viele Krankheiten berichtet. Und die Zellblatttechniken wurden entwickelt, um auch die Retention der Zelle und das Überleben innerhalb der Ziele zu verbessern. Während des Zellblattbaus bleibt die unzureichende Nahrungsversorgung ein zentrales Problem für den Verlust der Funktion der Stammzellzelle und ist eine unbefriedigende Stammzelleigenschaft, die schließlich die therapeutische Wirkung in vivo bewirken würde.Unser Ziel, verfügbare mehrschichtige Stammzellblattprodukte vorzubereiten, hat unser Team das zelluläre Pol-, Perikard- und Zellblechgerüst entwickelt. Basierend auf dem Gerüst würde der Mehrschichtzellenstarter schnell mit Nonapeptid Hydrogen konstruiert und ein dynamisches Perfusionssystem verwendet, um die Nahrungsversorgung der Stammzelle in vitro zu gewährleisten. Nehmen Sie ein getrocknetes DBP-Gerüst heraus und legen Sie es in die Mitte der schwarzen Basis.Legen Sie einen weißen Spannring auf das DBP-Gerüst und befestigen Sie ihn im Gewebeträger. Stellen Sie sicher, dass das DBP-Gerüst vollständig im Gewebeträger fixiert ist. Fügen Sie 100 Mikroliter Kulturmedien auf dem DBP-Gerüst hinzu.Legen Sie das Gerüst in den 37 Grad Celsius Inkubator und lassen Sie es für 15 Minuten einweichen. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator, entfernen Sie die Kulturmedien aus der Kulturschale, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit zwei Millilitern warmer PBS. Entfernen Sie alle PBS aus dem Kulturgericht, und stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit verbleibt.Fügen Sie der Schale zwei Milliliter zu 1,25% Trypsin-Lösung hinzu und brüten Die Zellen drei Minuten lang. Beenden Sie den Trypsin-Effekt, indem Sie zwei Milliliter Kulturmedium hinzufügen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig von der Schale.Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein neues 15 Milliliter Zentrifugalrohr. Zentrifugate die Zellen bei 220-facher Schwerkraft für fünf Minuten, und erhalten Zellsedimente. Entfernen Sie den Überstand, und wischen Sie das Zellsediment ab.Setzen Sie die Zellen mit drei Milliliter 10%Saccharose-Lösung aus. Aspirieren Sie 10 Mikroliter Zellsuspension, und die Inhaltszellzahl liest ein Hämozytometer, extrahieren Sie drei Millionen Zellen und übertragen Sie in Ihrem neuen 1,5 Milliliter Zentrifugalrohr. Zentrifugate die Zellen bei 220 mal quadratischen Wurzel für fünf Minuten, vollständig entfernen die Überräube und erhalten die Zellen Sediment.Bereiten Sie 20 Mikroliter 10%Saccharose-Lösung. Die Zellen vorsichtig wieder aufhängen und eine gleichmäßige Suspension erhalten. Fügen Sie 20 Mikroliter Peptid-Hydrogel an der Oberseite der Suspension sanft mischen das Peptid Hydrogel, und die Zellen Suspension mit dem T, nehmen Sie das DBP Gerüst, verlassen Sie den Gewebeträger, und dann sanft die Calculi Median mit einem T.Aspirieren die Mischung die Mischung und gleichmäßig auf das DBP Gerüst hinzufügen.Fügen Sie einen Milliliter Calciumedetat auf den Boden des Gewebeträgers. Fügen Sie dem Kulturgericht vorsichtig vier Milliliter Kulturmittel hinzu und tauchen dann das Zellblatt auf. Legen Sie die Zellen in den Inkubator für zwei Stunden lassen Sie es Kultur.Das dynamische Perfusionssystem umfasst einen Perfusionskulturbehälter, den Gasaustausch und eine Glasflasche. Assembles sind dynamische Perfusionssysteme, wie die Abbildung zeigt. Fügen Sie zwei Hydromilliliter Kultur medians in die Glasflasche.Legen Sie das Zellblatt in die Kammer des Kulturbehälters ein, fügen Sie drei Milliliter Kulturmittel in den Behälter ein, legen Sie die dynamischen Perfusionssysteme in die Inkubatoren und beginnen Sie zu pumpen. Öffnen Sie den Kulturcontainer im bipositiven Liegerad. Nehmen Sie das Zellblatt aus dem Kulturbehälter und legen Sie es in Kulturgericht.Verwenden Sie eine Zange, um den Gewebeträger zu immobilisieren und verwenden Sie zwei weitere Zangen, um den weißen Spannungsring von der schwarzen Basis zu trennen. Schließlich erhalten Sie das mehrschichtige Zellblatt. DBP Gerüst ist transparent.Die SEM-Weiterverkäufe zeigen, dass Colleges erfasst und die Komponenten vollständig reserviert sind. Die Zellblätter können für eine kurze Konservierung durch Zange erhalten und gehalten werden. Diese Zellplatte konnte in 1,5 Milliliter Zylindriformrohr übertragen werden.Als Modell zum Beispiel beginnend mit Zelldarstellungen von BMFC'S sehr positiv für die Stammzellen Marker CD 9O und die CD 29. Nach dem Zellbau bleibt das Verlassen des Zellblattes durch die BMFC nach wie vor hohe Ausdehnungsstufen von CD 90 und CD 29. Die Erstellung der mehrschichtigen Zellstruktur ist der entscheidende Schritt des Protokolls.Die Pfannenzeit erfordert vier Hydrogel, wenn sich der PH-Wert von SA zu neutral ändert, daher ist es wichtig, die Zelle mit Saccharoselösung zu waschen, um die Oberflächenionen zu entfernen. Auch das Volumenverhältnis von Zellsuspension und Panthihydrogel ist kein guter Freund für den Aufbau der temporären Mehrschichtstruktur. Nach der Bildung der 3D-Stammzellstruktur werden Sie sehen, dass das dynamische Perfusionssystem wichtig ist, um die mehrschichtige Struktur zu stabilisieren und die Stammzellviabilitäten aufrechtzuerhalten.Die dynamische Infiltration des Kulturmedians könnte Stammzellen erleichtern, den Zellkontext innerhalb der mehrschichtigen Struktur zu vermehren und zu extrapolieren, auch die dynamischen Kulturthermometer sollten an verschiedene Stammzelltypen angepasst werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

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