Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (concessione numero 31771064); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto della provincia di Guangdong (sovvenzione numeri 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); la scienza e la tecnologia pianificazione progetto di Guangzhou (concessione numero 201607010063); e l'innovazione dello studente non laureato e il programma di formazione all'imprenditorialità (concessione numero 201610559028); la National Science Foundation per giovani scienziati della Cina (grant numero 31800819).

Tutte le cellule staminali e procedure di esperimento sugli animali sono state condotte secondo le linee guida etiche della guida nazionale per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvate dal comitato di uso (Guangzhou, Cina) e Jinan University Animal Care.
1. preparazione dell'impalcatura DPP con il PLA2 decellularizzazione metodo14
Nota: Vedere Figura 1A per un disegno schematico del metodo d...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

Il presente protocollo segnala un metodo efficiente per la costruzione di un foglio multistrato di MSC. Questo strato di cellule presenta resistenza meccanica ottima, cell ad alta densità di semina e bioattività favorevole sulle cellule staminali. Utilizzando BMSCs come esempio, la struttura cellulare 3D rapidamente costruita con RAD16-io del peptide idrogel. Dopo in coltura nel sistema dinamico di aspersione, il foglio BMSC multistrato è ottenuto con successo e le BMSC mantenere un'alta espressione di marcatori di ce...

Terapia con cellule staminali è stata segnalata come un efficace trattamento per molte malattie; Tuttavia, cella bassa ritenzione e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione rimangono questioni critiche dopo l'iniezione di cellule staminali tradizionale. Per risolvere questo problema, tessuto ingegneria gli scienziati hanno sviluppato la tecnica del foglio di cella. Un foglio monostrato cellulare con intatto della matrice extracellulare in primo luogo è stato preparato utilizzando la risposta di temperatura cultura piatto1e relativi studi di follow-up segnalato i miglioramenti significativi di conservazione delle cellule staminali e la sopravvivenza all'interno il colpito da infarto zona2,3. Tra i metodi, costruendo il foglio di celle multistrato è stata segnalata come una strategia efficace per migliorare la sopravvivenza delle cellule e la cella foglio effetto terapeutico3,4. Da allora, gli scienziati hanno lavorato sullo sviluppo di metodi di costruzione del foglio differenti delle cellule al fine di aumentare la quantità di cellule, cellule staminali proprietà e proprietà meccaniche dei fogli delle cellule. Finora, alcuni tipi di strato delle cellule sono stati costruiti e studiati nel trattamento di infarto miocardico5, cartilagine ferita6, e la pelle ferita7.
La bioattività delle cellule staminali prima di trapianto ha mostrato un'influenza emergente sulla rigenerazione del tessuto danneggiato e cellula diverse strategie di costruzione di foglio hanno effetti diversi sulle cellule staminali. Da un lato, strati delle cellule confluenti consistevano soltanto di cellule staminali ad alta densità e matrici extracellulari naturale potrebbero essere acquistati da impilamento monostrato cellulare fogli8 o utilizzando tessuto magnetico Ingegneria tecniche9. D'altra parte, i ricercatori hanno sviluppato diverse impalcature per fornire un'adeguata resistenza meccanica e supporto delle cellule crescita10,11,12, che ha permesso una cellula staminale bassa densità per garantire la nutrizione di semina fornitura. Tuttavia, nonostante questi approcci, la fornitura di basso efficiente nutrizione all'interno della struttura di strato di celle multistrato rimane delle principali preoccupazioni durante la costruzione in vitro . Di conseguenza, un sistema di costruzione del foglio delle cellule efficiente e fattibile è urgentemente necessario.
Questo protocollo descrive i passaggi per preparare un foglio di cellula staminale (MSC) multilayeredmesenchymal. In questo sistema di costruzione, la resistenza meccanica del foglio di cella è fornita da un DPP. Basato su questa impalcatura, struttura cellulare 3D può essere rapidamente costruita con RAD16-io idrogel peptidici e un sistema di perfusione dinamica viene utilizzata per il foglio di celle multistrato, al fine di stabilizzare la struttura del foglio di cella 3D e fornire sufficiente nutrizione della coltura approvvigionamento per le cellule. Utilizzando questo sistema, un foglio BMSC multistrato è stato preparato correttamente e ha esibito un effetto terapeutico ottimale il ratto infarto miocardico modello13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Terapia della cellula formativa Mostra un promettente futuro nella rigenerazione di tessuti e organo danneggiato, e la tecnica di foglio di cella è stata sviluppata per migliorare la conservazione delle cellule basse e scarsa sopravvivenza all'interno della zona di destinazione. Tuttavia, durante il processo di costruzione di in vitro , è urgente una soluzione per il mantenimento delle cellule staminali bioattività e aumentando la quantità di cellule all'interno del foglio di cella. Qui, questo protocollo presenta un metodo per la costruzione di un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e un'operatività ottima. Pericardio porcino decellularizzato (DPP) è preparato dalla fosfolipasi un metodo di decellularizzazione2 (PLA2) come l'impalcatura di strato delle cellule e cellule staminali mesenchimali di ratto del midollo osseo (BMSC) sono isolate e ampliate come cellule del seminato. La struttura del foglio temporaneo celle multistrato è costruita usando RAD16-ho peptide idrogel. Infine, strato di cellule è coltivato con un sistema di perfusione dinamica per stabilizzare la struttura tridimensionale (3D) e strato di cellule poteva essere ottenuto seguendo una 48 ore di coltura in vitro. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di un foglio di multistrato sulle cellule staminali, e strato di cellule potrebbe essere sviluppato come un prodotto di terapia della cellula formativa favorevole in futuro.

Lo schema della costruzione foglio multistrato sulle cellule staminali è illustrato nella Figura 1. Preparando il patibolo di foglio di cella dal metodo di decellularizzazione di PLA2 è il primo passo. Basato sul patibolo, una struttura temporanea delle cellule 3D è costruita mescolando le cellule staminali con l'idrogel di peptide RAD16-1. Al fine di ottenere un foglio di celle multistrato con cellule staminali favorevole bioattività e ottima ...

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Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Costruzione di un foglio di multistrato delle cellule staminali mesenchimali con un sistema di cultura dinamica 3D

Questo articolo fornisce un metodo efficiente e fattibile per la costruzione di fogli multistrato sulle cellule staminali con proprietà favorevoli della cellula formativa.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

La terapia con cellule staminali è stata ampiamente segnalata come un trattamento promettente per molte malattie. E le tecniche delle schede cellulari sono state sviluppate per migliorare la ritenzione della cellula e la sopravvivenza anche all'interno degli obiettivi. Durante la costruzione dei fogli cellulari, l'insufficiente apporto nutrizionale rimane un problema chiave per la perdita della funzione delle cellule staminali ed è una proprietà insoddisfacente delle cellule staminali che finalmente in effettirebbe gli effetti terapeutici in vivo.Il nostro scopo di preparare il prodotto disponibile in lamiera di cellule staminali multistrato, il nostro team ha sviluppato l'impalcatura a pali, pericardio e lamiera cellulare cellularizzata. Sulla base dell'impalcatura, l'avviamento delle cellule multistrato sarebbe rapidamente costruito con idrogeno nonapeptide e viene utilizzato un sistema di perfusione dinamica per garantire l'alimentazione della cellula staminale in vitro. Eseni un'impalcatura DBP essiccata e mettila al centro della base nera.Mettere un anello di tensione bianco sull'impalcatura DBP e apporrlo nel portapassutale. Assicurarsi che l'impalcatura DBP sia totalmente fissata nel portapassutale. Aggiungere 100 mezzi di coltura di microlitri sull'impalcatura DBP.Mettere l'impalcatura nell'incubatore di 37 gradi Celsius e lasciare in ammollo per 15 minuti. Togliere le cellule dall'incubatrice, rimuovere i mezzi di coltura dal piatto di coltura, lavare delicatamente le cellule con due millilitri di PBS caldo. Rimuovere tutto il PBS dal piatto di coltura e assicurarsi che non rimanga liquido.Aggiungere due millilitri alla soluzione di tripside all'1,25% al piatto e incubare le cellule per tre minuti. Interrompere l'effetto tripina aggiungendo due mezzi di coltura millilitri. Lavare delicatamente le cellule dal piatto.Trasferire le sospensioni cellulari in un nuovo tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugate le cellule a 220 volte la gravità per cinque minuti, e ottenete sedimenti cellulari. Rimuovere il supernatante e spazzare via il sedimento cellulare.Sospendere di nuovo le cellule con una soluzione di saccarosio al 10% da tre millilitri. Aspira la sospensione cellulare di 10 microlitri e il numero di cella del contenuto legge un emocitometro, estrae tre milioni di cellule e trasferisce nel nuovo tubo centrifugo da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule a 220 volte la radice quadrata per cinque minuti, rimuovere completamente i supernatanti e ottenere il sedimento cellulare.Preparare 20 microlitri soluzione di saccarosio al 10%. Sospendere delicatamente le cellule e ottenere una sospensione uniforme. Aggiungere 20 microliter peptide hydro gel nella parte superiore della sospensione mescolare delicatamente il peptide hydro gel, e le cellule sospensione con la T, esettare l'impalcatura DBP, lasciando il portapatico, quindi aspirare delicatamente la mediana dei calcoli con una T.Aspirare la miscela la miscela e aggiungere uniformemente all'impalcatura DBP.Aggiungere un millilitro calciedetato sul fondo del portavimenta. Aggiungere delicatamente quattro millilitri nel piatto di coltura e quindi emergere il foglio cellulare. Metti le cellule nell'incubatrice per due ore lasciache la coltura.Il sistema dinamico di perfusione comprende un contenitore di coltura perfusione che scambia gas e una bottiglia di vetro. Gli assemblamenti sono sistemi di perfusione dinamici come mostrato nella figura. Aggiungere due mezzine di coltura idro millilitri nella bottiglia di vetro.Inserire il foglio cellulare nella camera del contenitore di coltura, aggiungere tre mediane di coltura millilitri nel contenitore, inserire i sistemi di perfusione dinamica negli incubatori e iniziare a pompare. Aprire il contenitore delle impostazioni cultura nel reclinato bipositivo. Estraete il foglio cellulare dal contenitore della coltura e mettetelo nel piatto della coltura.Utilizzare una forza per immobilizzare il porta tessuto e utilizzare altre due forcep per separare l'anello di tensione bianco dalla base nera. Infine, ottenere il foglio cellulare multistrato. L'impalcatura DBP è trasparente.Le rivendite SEM mostrano che i college catturati e i componenti sono completamente riservati. I fogli cellulari possono essere ottenuti e tenuti da forcep per una breve conservazione. Questi fogli cellulari potrebbero essere trasferiti in un tubo cilindriforme da 1,5 millilitri.Come modello ad esempio a partire dalle dimostrazione cellulari di BMFC altamente positivo per il marcatore delle cellule staminali CD 9O e CD 29. Dopo la costruzione della cella, il BMFC'S che esce dal foglio cellulare rimane ad alti livelli di espansione del CD 90 e del CD 29. La costruzione della struttura cellulare a più tipi è il passaggio critico del protocollo.Il tempo di pan richiede quattro gel idro quando il valore ph cambia da SA a neutro, quindi, è importante lavare la cella con soluzione di saccarosio per rimuovere gli ioni superficiali. Inoltre, il rapporto volume della sospensione cellulare e del panthihydrogel non è un buon amico per la costruzione della struttura temporanea multistrato. Dopo la formazione della struttura delle cellule staminali 3D, vedrai che il sistema di perfusione dinamica è importante per stabilizzare la struttura multistrato e mantenere le viabilità delle cellule staminali.L'infiltrazione dinamica della mediana di coltura potrebbe facilitare le cellule staminali a proliferare ed estrapolare il contesto cellulare all'interno della struttura multistrato anche i termometri a coltura dinamica dovrebbero essere regolati in base ai diversi tipi di cellule staminali.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

Bioingegneria

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