Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
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この仕事に支えられた中国の国家自然科学基金 (許可番号 31771064)科学技術計画プロジェクトの広東省 (許可番号 2013B010404030、2014A010105029、および 2016A020214012)。科学技術計画プロジェクトの広州 (許可番号 201607010063)学部の技術革新と起業家研修 (許可番号 201610559028)(許可番号 31800819) 中国の若い科学者を全米科学財団。

すべての幹細胞および動物実験プロシージャがケアと実験動物の使用のため全国のガイドの倫理的なガイドラインに従って実施、済南大学動物ケアおよび使用委員会 (中国・広州) によって承認します。
1. PLA2 Decellularization と DPP 足場の準備方法14
注: は、PLA2 decellularization 法の模式図を図 1 aを参?...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. 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この議定書は、多層 MSC シートを構築するための効率的な方法を報告します。この細胞シートは、最適な強度、高い細胞播種密度および有利な幹細胞活性を展示します。BMSCs を例として使用して、3 D の細胞の構造がすぐに RAD16 で構築されて-私ペプチド ハイドロゲルです。動的な灌流システムで培養されて後、多層 BMSC のシートは正常に取得し、BMSCs 高幹細胞マーカー発現を維持します。...

幹細胞療法は多くの病気の効果的な治療法として報告されています。ただし、低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存伝統的な幹細胞の注入の後の重要な問題に残る。この問題を解決するためには、組織工学科学者は、細胞シート技術を開発しました。そのままの細胞外マトリックスを持つ単層細胞シートまず温度応答文化料理1を使用して調製し、, そのフォロー アップ研究幹細胞の保存と、梗塞内生存の重要な改善を報告しました。エリア2,3。方法のうちは、多層の細胞シートを構築する細胞の生存率と細胞シート治療効果3,4を改善するための効果的な戦略として報告されています。以来、科学者は細胞量、幹細胞プロパティ、および細胞シートの機械的性質を高めるために別の細胞シート工法の開発に働いています。これまでのところ、細胞シートの特定の種類を構築し、心筋梗塞の5、軟骨損傷6治療の研究、皮膚傷7。
移植前に幹細胞の生物活性を示した負傷した組織再生に新たな影響を及ぼす、異なる細胞シートの構築戦略は、幹細胞の異なる効果を持ちます。一方、コンフルエントの細胞シートはのみ高密度の幹細胞で構成され、重なり単層細胞シート8または磁気ティッシュ エンジニア リング技術9を使用して、自然な細胞外マトリックスを取得できます。その一方で、研究者は、十分な機械的強度を提供し、細胞成長10、11,12、低細胞播種密度栄養を確保するための許可をサポートする異なる足場を開発しました。供給。ただし、これらのアプローチにもかかわらず多層細胞シート構造内で低効率の高い栄養供給は体外工事主要な関心事を残ります。したがって、効率的かつ実行可能な細胞シート施工システムは緊急に必要です。
このプロトコルでは、multilayeredmesenchymal 幹細胞 (MSC) の細胞シートを準備する手順について説明します。この工法では、細胞シートの機械的強度は、DPP によって提供されます。この足場を基に、3 D の細胞構造を素早く構築できます RAD16 で-私ペプチド ハイドロゲルと動的な灌流システム、3 D の細胞シート構造の安定化し、十分な栄養を提供するために、多層の細胞シートを文化に使用セルの供給。このシステムを使用すると、多層 BMSC シート準備ができましたし、ラット心筋梗塞モデル13の最適な治療効果を展示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

幹細胞療法は有望なを示す将来負傷した臓器や組織を再生・細胞シート技術は低細胞保存とターゲット ゾーン内で貧しい人々 の生存を改善するために開発されました。ただし、体外施工中に幹細胞の活性を維持して細胞シート内細胞量の増加のためのソリューションが急務します。ここでは、このプロトコルは有利な幹細胞の生物活性と最適な操作性と多層の細胞シートを構築する手法を提案します。細胞シート足場として2 (PLA2) decellularization メソッド ホスホリパーゼによって脱ブタの心膜 (DPP) を用意し、ラット骨髄間葉系幹細胞 (BMSCs) が分離されシード細胞として展開されます。一時的な多層細胞シート構造は、RAD16 を使用して作成されます-私ペプチド ハイドロゲルです。最後に、三次元 (3 D) の構造を安定させるために動的な灌流システムと細胞シートを培養し、48 時間培養の in vitro細胞シートを得ることができた。このプロトコルは、多層の細胞シートを構築するための効率的かつ実行可能な方法を提供し、細胞シートが将来的に有利な幹細胞療法製品として開発される可能性があります。

多層幹細胞シート工法の模式図は、図 1に表示されます。PLA2 decellularization 法による細胞シート培養足場を準備する最初のステップです。足場に基づき、一時 3 D セル構造は、RAD16 1 ペプチド ハイドロゲルと幹細胞を混合することによって構築されます。有利な幹細胞の生物活性と最適な強度、多層の細胞シートを取得するために動的な?...

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Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

この資料では、プロパティが有利な幹細胞幹細胞の多層シートを構築するため効率的かつ実行可能な方法を提供します。

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

幹細胞療法は、多くの疾患に対する有望な治療法として広く報告されている。そして、細胞シート技術は、細胞の保持とターゲット内の生存率を向上させるために開発されています。細胞シートの構築中、不十分な栄養供給は、幹細胞の機能の喪失のための重要な問題であり、不十分な幹細胞の特性は、最終的に生体内の治療効果に影響を与えるだろう。利用可能な多層幹細胞シート製品を準備することを目的として、当社のチームは、細胞化された極大、心膜および細胞シート足場を開発しました。足場に基づいて、多層細胞スターターは、すぐに非ペプチド水素で構築され、動力学灌流システムは、インビトロで幹細胞の栄養供給を確保するために使用されます。乾燥したDBP足場を取り出し、黒いベースの中央に置きます。DBP足場に白い張力リングを置き、ティッシュキャリアに貼り付けます。DBP足場が組織キャリアに完全に固定されていることを確認してください。DBP足場に100マイクロリットルの培養培地を加えます。スキャフォールドを摂氏37度のインキュベーターに入れ、15分間浸します。培養器から細胞を取り出し、培養皿から培養液を取り出し、2ミリリットルの温かいPBSで細胞を軽く洗う。培養皿からすべてのPBSを取り出し、液体が残らないようにします。皿に1.25%トリプシン溶液に2ミリリットルを加え、3分間細胞をインキュベートします。2ミリリットルの培養培地を添加してトリプシン効果を停止する。皿から細胞をそっと洗います。新しい15ミリリットルの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。重力220倍の重力で細胞を5分間遠心し、細胞沈積物を得る。上清を取り出し、細胞堆積物を拭き取ります。3ミリリットル10%スクロース溶液で細胞を再中断します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引し、コンテンツ細胞数はヘモサイトメーターを読み取り、300万個の細胞を抽出し、新しい1.5ミリリットル遠心管で移送します。5分間、220平方根の細胞を遠心分離し、上清を完全に除去し、細胞沈降物を得る。20マイクロリットル10%スクロース溶液を調製します。細胞を穏やかに再中断し、均一な懸濁液を得る。懸濁液の上部に20マイクロリットルのペプチドハイドロゲルを加え、Tと懸濁液を細胞に加え、DBP足場を取り出し、組織キャリアを離れ、混合物をT.吸引して微積分中央値を穏やかに吸引し、DBP足場に均等に加えます。組織キャリアの底に1ミリリットルのカルシウムメデテートを加えます。培養皿に4ミリリットルの文化培地をそっと加え、細胞シートを現れます。培養器に細胞を2時間入れて培養する。動的灌流系には、ガス交換用の灌流培養容器とガラス瓶が含まれる。図に示すように、組立体は動的灌流システムである。ガラス瓶に2つの水力ミリリットル培養中央値を加えます。培養容器のチャンバーに細胞シートを挿入し、容器内に3ミリリットル培養中央値を加え、培養器に動的灌流システムを入れて、ポンプを開始する。バイポジティブリカンベントで培養コンテナを開きます。培養容器から細胞シートを取り出し、培養皿に入れます。1つの鉗子を使用して組織キャリアを固定し、別の2つの鉗子を使用して白い張力リングを黒いベースから分離します。最後に、多層セルシートを取得する。DBP足場は透明である。SEMの再販は、大学がキャプチャされ、コンポーネントが完全に予約されていることを示しています。細胞シートは、短い保存のために鉗子によって得られ、保持することができる。これらの細胞シートは、1.5ミリリットルの円筒形チューブに移すことができる。例えば、幹細胞マーカーCD9OおよびCD29に対するBMFCの高陽性の細胞示しから始まるモデルとして。セル構築後、BMFCはセルシートを離れ、CD 90とCD29の高い膨張レベルを維持する。多層セル構造の構築は、プロトコルの重要なステップです。このパン時間は、PH値がSAから中性に変化する場合に4つのヒドロゲルを必要とし、したがって、表面イオンを除去するためにスクロース溶液で細胞を洗浄することが重要である。また、細胞懸濁液とパンチヒドロゲルの体積比は、一時的な多層構造を構築するための良好な味方ではない。3D幹細胞構造の形成後、多層構造を安定させるとともに幹細胞の生存能力を維持するためには、動的灌流システムが重要であることがわかります。培養中中央値の動的浸潤は、幹細胞が多層構造内で細胞のコンテキストを増殖し、外挿することを容易にし、また、動的培養温度計は、異なる幹細胞タイプに応じて調整されるべきである。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...