Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (bevilgning nummer 31771064); Vitenskap og teknologi planlegging prosjektet av Guangdongprovinsen (grant tall 2013B010404030, 2014A010105029 og 2016A020214012); Vitenskap og teknologi planlegging prosjektet Guangzhou (bevilgning nummer 201607010063); og undervisning innovasjon og entreprenørskap treningsprogram (bevilgning nummer 201610559028); National Science Foundation for unge forskere i Kina (gi nummer 31800819).

Alle stilk cellen og dyr prosedyrer ble gjennomført i henhold til etiske retningslinjer for nasjonale og bruk av forsøksdyr og godkjent av Jinan University Animal Care og bruk Committee (Kroatia).
1. utarbeidelse av DPP stillaset med PLA2 Decellularization metode14
Merk: Se figur 1A for en skjematisk av metoden PLA2 decellularization.
<ol><li>Forberede 100 mL 200 U/mL PLA2 lø...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

Nåværende protokollen rapporterer en effektiv metode for å lage en flerlags MSC ark. Denne cellen ark utstillinger optimal mekanisk styrke, høyt seeding tetthet og gunstige stamcelleforskningen bioactivity. Bruker BMSCs som et eksempel, 3D cellestrukturen er raskt konstruert med RAD16-jeg peptid hydrogel. Etter blir kultivert i dynamiske perfusjon systemet, flerlags BMSC arket er med hell fått og BMSCs opprettholde en høy uttrykk for stamcelleforskningen markører.
Opprette midlertidige ...

Stilk cellen terapi har blitt rapportert som en effektiv behandling for mange sykdommer; lav celle oppbevaring og dårlig overlevelse innenfor målsonen beholdes imidlertid kritiske problemer etter tradisjonelle stamcelleforskningen injeksjon. For å løse dette problemet, utviklet vev engineering forskere celle ark teknikken. Et monolayered celle ark med intakt ekstracellulær matrix ble først utarbeidet ved hjelp av temperatur-svar kultur parabol1, og dens oppfølgingsstudier rapportert betydelige forbedringer av stilk cellen bevaring og overlevelse i den infarcted området2,3. Blant metodene, har konstruere flerlags celle arket blitt rapportert som en effektiv strategi for å forbedre celle overlevelse og celle ark terapeutisk effekt3,4. Siden da har forskere jobbet med å utvikle ulike celle ark konstruksjonsmetoder for å øke celle beløpet, Stamcelle eiendom og mekanisk-egenskapen for cellen arkene. Så langt, visse typer celle ark er konstruert og studerte i behandlingen av hjerteinfarkt5, brusk skade6, og huden sår7.
Bioactivity av stamceller før transplantasjon viste en voksende innflytelse på skadet vev gjenfødelse, og ulike celle ark bygging strategier har ulike effekter på stamceller. På den ene siden confluent celle ark bare besto av høy tetthet stamceller og naturlig ekstracellulære matriser kan skaffes ved stabling monolayered celle ark8 eller magnetiske tissue engineering teknikker9. På den annen side, utviklet forskere ulike stillaser for å gi tilstrekkelig mekanisk styrke og støtte celle vekst10,11,12, som tillot en lav stamcelleforskningen seeding tetthet for å sikre ernæring Angi. Til tross for disse tilnærmingene imidlertid lav effektiv ernæring levering innen flerlags ark cellestrukturen et stort problem under bygging i vitro . Derfor er en effektiv og mulig celle ark bygging systemet raskt påkrevd.
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å forberede en multilayeredmesenchymal stilk cellen (MSC) cellen ark. I dette bygging systemet, er celle ark mekanisk styrke levert av en DPP. Basert på denne skafottet, 3D cellestrukturen raskt konstrueres med RAD16-jeg peptid hydrogel, og en dynamisk perfusjon system brukes til kultur flerlags celle arket, for å stabilisere ark for 3D cellestruktur og gi tilstrekkelig ernæring tilførsel til cellene. Bruke dette systemet, et flerlags BMSC ark var er forberedt og utstilt en optimal terapeutisk effekt på rotte hjerteinfarkt modell13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Stilk cellen terapi viser en lovende fremtid regenererer skadet orgel og vev, og cellen ark teknikken har blitt utviklet for å forbedre lav celle oppbevaring og dårlig overlevelse innenfor målsonen. Men under byggeprosessen i vitro en løsning for å opprettholde stilk cellen bioactivity og øke celle i cellen arket er et presserende behov. Her gir denne protokollen en metode for å konstruere et flerlags celle ark med gunstige stilk cellen bioactivity og optimal brukbarhet. Decellularized svin pericardium (DPP) er utarbeidet av fosfolipase2 (PLA2) decellularization metode som cellen ark stillaset, og rotta benmarg mesenchymal stamceller (BMSCs) er isolert og utvidet som seeded cellene. Midlertidig flerlags ark cellestrukturen er konstruert ved hjelp av RAD16-jeg peptid hydrogel. Endelig celle arket er kultivert med en dynamisk perfusjon å stabilisere tredimensjonale (3D) strukturen, og cellen arket kan hentes etter en 48-timers kultur i vitro. Denne protokollen gir en effektiv og mulig metode for å konstruere et flerlags stamcelleforskningen ark, og cellen arket kunne utvikles som gunstige stilk cellen terapi produkt i fremtiden.

Skjematisk av flerlags stamcelleforskningen ark konstruksjonen er vist i figur 1. Forbereder celle ark stillaset av PLA2 decellularization metoden er første skritt. Basert på skafottet, er en midlertidig 3D celle-struktur konstruert ved å blande stamceller med RAD16-1 peptid hydrogel. For å få et flerlags celle ark med gunstige stilk cellen bioactivity og optimal mekanisk styrke, er celle arket kultivert i et dynamisk perfusjon system. Under d...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggingen av et flerlags Mesenchymal stamceller ark med en 3D dynamisk kultur-systemet

Denne artikkelen gir en effektiv og mulig måte for å konstruere flerlags stamcelleforskningen ark med gunstige stamcelleforskningen eiendom.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Stamcellebehandling har blitt mye rapportert som en lovende behandling for mange sykdommer. Og cellearkteknikkene er utviklet for å forbedre cellens oppbevaring og overlevelse i målene også. Under cellearkkonstruksjonen forblir den utilstrekkelige ernæringsforsyningen et viktig problem for tap av stamcellefunksjonen, og er en utilfredsstillende stamcelleegenskap vil endelig påvirke de terapeutiske effektene in vivo.Vårt formål å forberede tilgjengelig flerlags stamcelleark produkt, utviklet vårt team cellisert polesized, pericardium og celle ark stillas. Basert på stillaset flerlags celler starteren ville bli raskt konstruert med nonapeptid Hydrogen og en dynamikk perfusjon system brukes til å sikre stamcellen ernæring forsyning in vitro. Ta ut et tørket DBP-stillas og legg det i midten av den svarte basen.Sett en hvit spenningsring på DBP-stillaset, og fest den i vevsbæreren. Kontroller at DBP-stillaset er helt festet i vevsbæreren. Legg til 100 mikroliter kulturmedium på DBP-stillaset.Sett stillaset i 37 grader Celsius inkubator, og la det suge i 15 minutter. Ta cellene ut av inkubatoren, fjern kulturmediene fra kulturfatet, vask forsiktig cellene med to milliliter varm PBS. Fjern alle PBS fra kulturretten, og sørg for at ingen væske forblir.Tilsett to milliliter til 1,25% trypsinløsning til parabolen, og inkuber cellene i tre minutter. Stopp trypsin effekten ved å legge til to milliliter kultur medium. Vask cellene forsiktig fra parabolen.Overfør cellesuspensjonene i et nytt 15 milliliter sentrifugalrør. Centrifugate cellene på 220 ganger tyngdekraften i fem minutter, og få cellesedimenter. Fjern det overnaturlige, og tørk ut cellesedimentet.Re suspendere cellene med tre milliliter 10% sukrose løsning. Aspirer 10 mikroliter celle suspensjon, og innholdet cellenummeret leser en hemocytometer, trekke ut tre millioner celler og overføre i din nye 1,5 milliliter sentrifugal tube. Centrifugate cellene ved 220 ganger kvadratrot i fem minutter, fjern helt supernativa og få cellene sediment.Forbered 20 mikroliter 10% sukroseløsning. Forsiktig re-suspendere cellene og få en jevn suspensjon. Tilsett 20 mikroliterpeptidhydrogel på toppen av suspensjonen forsiktig blande peptid hydro gel, og cellene suspensjon med T, ta ut DBP stillas, forlater vev bærer, og deretter forsiktig aspirere kalkulu median med en T.Aspirate blandingen blandingen og jevnt legge på DBP stillaset.Tilsett en milliliter kalsiumedetat til bunnen av vevsbæreren. Tilsett forsiktig fire milliliter kulturelle medier i kulturretten og kom deretter ut av cellearket. Sett cellene i inkubatoren i to timer la det kultur.Det dynamiske perfusjonssystemet inkluderer en perfusjonskulturbeholder gassen som utveksler recrement og en glassflaske. Monterer er dynamiske perfusjonssystemer som figuren som vises. Tilsett to hydro milliliter kultur medianer i glassflasken.Sett cellearket inn i kammeret til kulturbeholderen, tilsett tre milliliter kulturmedianer i beholderen, legg de dynamiske perfusjonssystemene i inkubatorene og begynn å pumpe. Åpne kulturbeholderen i den bipositive liggende hendebenten. Ta ut cellearket fra kulturbeholderen og legg det i kulturrett.Bruk en tang til å immobilisere vevsbæreren og bruk ytterligere to tang for å skille den hvite spenningsringen fra den svarte basen. Til slutt får du det flerlags cellearket. DBP stillas er gjennomsiktig.SEM videreselgere viser at høyskoler fanget og komponentene er helt reservert. Cellearkene kan oppnås og holdes av tang for kort bevaring. Disse celleark kan overføres til 1,5 milliliter sylindriform rør.Som en modell for eksempel starter med cellevisninger av BMFC er svært positiv for stamcellemarkøren CD 9O og CD 29. Etter cellekonstruksjon bmfc forlater cellearket forblir høye ekspansjonsnivåer av CD 90 og CD 29. Å konstruere den flerlags cellestrukturen er det kritiske trinnet i protokollen.Pantiden krever fire hydrogel når PH-verdien endres fra SA til nøytral, derfor er det viktig å vaske cellen med sukroseløsning for å fjerne overflateionene. Også volumet forholdet mellom celle suspensjon og panthihydrogel er ikke god venn for å konstruere den midlertidige flerlagsstrukturen. Etter dannelsen av 3D stamcellestruktur, vil du se den dynamiske perfusjonssystemet er viktig for å stabilisere flerlagsstrukturen, samt opprettholde stamcellesynlighetene.Den dynamiske infiltrasjonen av kulturmedianen kan lette stamceller til å spre seg og ekstrapolere cellekonteksten i flerlagsstrukturen, også de dynamiske kulturtermometrene bør justeres i henhold til ulike stamcelletyper.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Utarbeidelse av 3D Fibrin stillaser for Stem Cell Kultur Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Bygging av en Flercellede 3D Stillas for levering av Lagdelte Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...