Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 31771064); a ciência e a tecnologia planejamento projeto da província de Guangdong (concessão números 2013B010404030, 2014A010105029 e 2016A020214012); a ciência e a tecnologia planejamento projeto de Guangzhou (número de concessão 201607010063); e a inovação de graduação e programa de formação de empreendedorismo (número de concessão 201610559028); a National Science Foundation para jovens cientistas da China (conceder número 31800819).

Todas as células-tronco e experimento animal procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do guia nacional para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de uso (Guangzhou, China) e cuidado de Animal de Universidade de Jinan.
1. preparação do cadafalso DPP com o PLA2 Decellularization método14
Nota: Ver figura 1A para um esquema do método PLA2</...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

O presente protocolo relata um método eficiente para a construção de uma folha MSC em várias camadas. Esta folha de célula apresenta ótima resistência mecânica e densidade de semeadura de pilha alta Bioatividade favorável células-tronco. Usando BMSCs como exemplo, a estrutura celular 3D rapidamente é construída com RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Depois a ser cultivada no sistema de perfusão dinâmico, folha de várias camada BMSC é obtida com êxito e os BMSCs mantêm uma alta expressão de marcadores de c...

Terapia de células-tronco tem sido relatada como um tratamento eficaz para muitas doenças; no entanto, a célula baixa retenção e sobrevivência pobre dentro da zona alvo permanecem questões críticas depois da injeção de células-tronco tradicional. Para resolver esse problema, cientistas engenharia de tecido desenvolveram a técnica de folha de célula. Uma folha de monolayered células com matriz extracelular intacta em primeiro lugar foi preparada usando o prato de cultura de temperatura-resposta1, e seus estudos de seguimento relataram as melhorias significativas da retenção de células-tronco e sobrevivência dentro o enfartado área2,3. Entre os métodos, a construção de camada de células em várias camadas tem sido relatado como uma estratégia eficaz para melhorar a sobrevivência da célula e a célula folha efeito terapêutico3,4. Desde então, cientistas têm trabalhado no desenvolvimento de métodos de construção de folha de célula diferente a fim de aumentar a quantidade de células, células-tronco Propriedade e propriedade mecânica das folhas de célula. Até agora, foram construídos e estudados no tratamento de infarto do miocárdio5, lesão de cartilagem6, certos tipos de folha de célula e pele ferida7.
A bioatividade de células-tronco antes do transplante mostrou uma influência emergente na regeneração do tecido lesado, e estratégias de construção de folha de célula diferentes têm efeitos diferentes sobre as células-tronco. Por um lado, folhas de célula confluente consistiam apenas de células-tronco de alta densidade, e matrizes extracelulares naturais poderiam ser adquiridas por empilhamento de folhas de célula monolayered8 ou por meio de técnicas engenharia de tecido magnético9. Por outro lado, os pesquisadores desenvolveram diferentes andaimes para fornecer resistência mecânica adequada e apoio celular crescimento10,11,12, que permitiu uma célula-tronco baixa densidade para garantir a nutrição de semeadura abastecimento. No entanto, apesar dessas abordagens, o fornecimento de baixa nutrição eficiente dentro da estrutura da folha em várias camadas de células continua a ser uma grande preocupação durante a construção em vitro . Portanto, um sistema de construção de folha célula eficiente e viável é urgentemente necessário.
Este protocolo descreve as etapas para preparar uma camada de células multilayeredmesenchymal células-tronco (MSC). Neste sistema de construção, a resistência mecânica de folha de célula é fornecida por um DPP. Baseia este andaime, a estrutura celular 3D pode ser rapidamente construída com RAD16-eu hidrogel peptídeo e um sistema dinâmico de perfusão é usado para cultura folha de várias camadas de células, a fim de estabilizar a estrutura da folha célula 3D e fornecer nutrição suficiente fornecimento para as células. Usando este sistema, uma folha BMSC várias camada com êxito foi preparada e exibiu um efeito terapêutico ideal no rato do miocárdio modelo13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Terapia de células-tronco mostra um promissor futuro em regenerar órgãos feridos e tecidos, e a técnica de folha célula foi desenvolvida para melhorar a retenção de cela baixa e pobre sobrevivência dentro da zona alvo. No entanto, durante o processo construção in vitro , uma solução para a manutenção de células-tronco Bioatividade e aumentando a quantidade de células dentro da camada de células é urgentemente necessária. Aqui, este protocolo apresenta um método para a construção de uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e operabilidade ideal. Decellularized Pericárdio Porcino (DPP) é preparado pela fosfolipase um método de decellularization2 (PLA2) como o andaime de folha de célula, e rato medula células-tronco mesenquimais (BMSCs) são isoladas e expandiu-se como as células semeadas. O organelo várias camadas folha temporária é construído usando RAD16-eu hidrogel de peptídeo. Finalmente, a camada de células é cultivada com um sistema dinâmico de perfusão para estabilizar a estrutura tridimensional (3D), e a camada de células poderia ser obtida após uma cultura de 48 horas em vitro. Este protocolo fornece um método eficiente e viável para a construção de uma folha de células-tronco em várias camadas, e a camada de células poderia ser desenvolvida como um produto de terapia de células-tronco favorável no futuro.

O esquema da construção folha várias camadas de células estaminais é mostrado na Figura 1. Preparar o andaime de folha célula pelo método de decellularization PLA2 é o primeiro passo. Com base no cadafalso, uma estrutura temporária celular 3D é construída misturando as células-tronco com o hidrogel de peptídeo RAD16-1. A fim de obter uma folha de várias camadas de células com bioatividade de células-tronco favorável e ótima resist...

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Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

Este artigo fornece um método eficiente e viável para a construção de várias camadas de células estaminais folhas com propriedade de célula-tronco favorável.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A terapia com células-tronco tem sido amplamente relatada como um tratamento promissor para muitas doenças. E as técnicas de folha de celular foram desenvolvidas para melhorar a retenção da célula e a sobrevivência dentro dos alvos, também. Durante a construção de folhas de células, o suprimento nutricional insuficiente continua sendo um problema fundamental para a perda da função das células-tronco, e é uma propriedade insatisfatória de células-tronco que finalmente afetaria os efeitos terapêuticos in vivo.Nosso propósito de preparar o produto disponível de folha de células-tronco multicamadas, nossa equipe desenvolveu o andaime de postesização celularizada, pericárdio e folha de células. Com base no andaime, a entrada de células multicamadas seria rapidamente construída com hidrogênio não-inepto e um sistema de perfusão dinâmica é usado para garantir o fornecimento nutricional da célula-tronco in vitro. Pegue um andaime DBP seco e coloque-o no centro da base negra.Coloque um anel de tensão branco no andaime DBP e afixe-o no porta-tecidos. Certifique-se de que o andaime DBP está totalmente fixado no porta-tecidos. Adicione 100 microliters de cultura no andaime DBP.Coloque o andaime na incubadora Celsius de 37 graus e deixe-o de molho por 15 minutos. Retire as células da incubadora, remova os meios de cultura do prato de cultura, lave suavemente as células com dois mililitros de PBS quente. Remova todo o PBS do prato de cultura, e certifique-se de que nenhum líquido permanece.Adicione dois mililitros a 1,25% de solução de trippsina ao prato e incuba as células por três minutos. Pare o efeito trippsina adicionando dois mililitros de cultura. Lave suavemente as células do prato.Transfira as suspensões celulares em um novo tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar as células a 220 vezes a gravidade por cinco minutos, e obter sedimentos celulares. Remova o supernatante e elimine o sedimento celular.Suspender as células com três mililitros 10% de solução de sacarose. Aspirar 10 microliters suspensão celular, e o número de célula de conteúdo lê um hemótmetro, extrair três milhões de células e transferir em seu novo tubo centrífugo de 1,5 mililitro. Centrifugar as células a 220 vezes a raiz quadrada por cinco minutos, remover completamente os supernacantes e obter o sedimento das células.Prepare 20 microliters 10% solução de sacarose. Suspenda suavemente as células e obtenha uma suspensão uniforme. Adicione 20 microliter peptídeos de gel hidráulico na parte superior da suspensão misture suavemente o gel hidráulico peptídeo, e as células suspensão com o T, retire o andaime DBP, deixando o porta-tecidos e, em seguida, aspire suavemente a mediana do cálculo com um T.Aspire a mistura a mistura e adicione uniformemente ao andaime DBP.Adicione um mililitro de cálcio na parte inferior do porta-tecidos. Adicione suavemente quatro mililitros culturais no prato de cultura e, em seguida, emergir a folha de células. Coloque as células na incubadora por duas horas deixe-a cultivar.O sistema dinâmico de perfusão inclui um recipiente de cultura de perfusão o recreamento de troca de gás e uma garrafa de vidro. Montagens são sistemas dinâmicos de perfusão, como mostra a figura. Adicione duas medianas de cultura de hidrolitários na garrafa de vidro.Insira a folha de células na câmara do recipiente de cultura, adicione três medianas de cultura mililitros no recipiente, coloque os sistemas dinâmicos de perfusão nas incubadoras e comece a bombear. Abra o recipiente de cultura no recumbent bipositivo. Retire a folha de celular do recipiente de cultura e coloque-a no prato de cultura.Use um fórceps para imobilizar o portador do tecido e use outros dois fórceps para separar o anel de tensão branca da base negra. Finalmente, obtenha a folha de células multicamadas. O andaime DBP é transparente.O SEM revende mostra que as faculdades capturadas e os componentes estão completamente reservados. As folhas de células podem ser obtidas e mantidas por fórceps para preservação curta. Estas folhas de celular podem ser transferidas para tubo cilíclita de 1,5 mililitro.Como modelo, por exemplo, começando com exibições de células de BMFC's altamente positivos para as células-tronco marcador CD 9O e o CD 29. Após a construção da célula, o BMFC's que sai da folha de células permanece com altos níveis de expansão do CD 90 e do CD 29. Construir a estrutura celular multicamadas é o passo crítico do protocolo.O tempo da panela requer quatro gel hidráulico quando o valor PH muda de SA para neutro, portanto, é importante lavar a célula com solução de sacarose para remover os íons superficiais. Além disso, a razão de volume de suspensão celular e panthihidrogel não é boa amiga para a construção da estrutura multicamada temporária. Após a formação da estrutura de células-tronco 3D, você verá que o sistema dinâmico de perfusão é importante para estabilizar a estrutura multicamadas, bem como manter as viabilidades das células-tronco.A infiltração dinâmica da mediana da cultura poderia facilitar que as células-tronco se proliferassem e extrapolassem o contexto celular dentro da estrutura multicamadas também os termômetros de cultura dinâmica devem ser ajustados de acordo com diferentes tipos de células-tronco.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengenharia

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

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Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

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Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

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