Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número 31771064); la ciencia y tecnología de planificación proyecto de la provincia de Guangdong (grant números 2013B010404030, 2014A010105029 y 2016A020214012); la ciencia y la tecnología de planificación proyecto de Guangzhou (número 201607010063); y el grado de innovación y programa de formación empresarial (número 201610559028); la Fundación Nacional de ciencia para jóvenes científicos de China (la concesión número 31800819).

Todos los procedimientos de experimento animal y la célula de vástago se llevó a cabo según las normas éticas de la guía nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por la Universidad de Jinan Animal cuidado y uso (Guangzhou, China).
1. preparación del andamio DPP con la descelularización de PLA2 método14
Nota: Ver figura 1A para un esquema del método de descelularizac...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

El presente Protocolo informa un método eficiente para la construcción de una hoja de varias capas de MSC. Esta hoja celular exhibe óptima resistencia mecánica, alta siembra densidad celular y células madre favorable bioactividad. Utilizando BMSCs como ejemplo, la estructura 3D de la célula rápidamente se construye con RAD16-I péptido hidrogel. Después de ser cultivadas en el sistema de perfusión dinámica, la hoja de varias capas de CMMo se obtiene con éxito y las BMSCs mantienen una alta expresión de marcad...

Terapia de células madre se ha divulgado como un tratamiento efectivo para muchas enfermedades; sin embargo, retención celular baja y pobre supervivencia dentro de la zona de destino siguen siendo cuestiones críticas después de la inyección de células madre tradicional. Para resolver este problema, científicos ingeniería tejido desarrollado la técnica de la hoja de la célula. Una hoja monolayered célula con la matriz extracelular intacta en primer lugar se preparó utilizando la temperatura de respuesta cultura plato1, y sus seguimiento estudios informaron mejorías significativas de la célula de vástago de retención y sobrevivencia en el infartado zona2,3. Entre los métodos, construcción de la hoja de varias capas de células se ha divulgado como una estrategia efectiva para mejorar la supervivencia de la célula y la célula hoja efecto terapéutico3,4. Desde entonces, los científicos han trabajado en el desarrollo de métodos de construcción de hoja de diferentes células con el fin de aumentar la cantidad de celulares, propiedad de la célula de vástago y propiedades mecánicas de las hojas de la célula. Hasta ahora, ciertos tipos de hoja de la célula han sido construidos y estudiados en el tratamiento del infarto de miocardio5, cartílago lesión6, y7de la herida de la piel.
La actividad biológica de células antes del trasplante demostró una influencia emergente sobre la regeneración del tejido lesionado, y estrategias de construcción de hoja de diferentes células tienen diferentes efectos sobre las células madre. Por un lado, hojas de células confluentes sólo consistieron de alta densidad de las células madre y matrices extracelulares naturales podían ser adquiridos por apilamiento de hojas monolayered celular8 o mediante el uso de técnicas ingeniería de tejido magnético9. Por otra parte, los investigadores desarrollaron diferentes andamios para proporcionar una resistencia mecánica adecuada y apoyo celular crecimiento10,11,12, que permitió una baja siembra densidad para asegurar la nutrición la célula de vástago de la fuente. Sin embargo, a pesar de estos enfoques, la fuente de baja nutrición eficiente dentro de la estructura de la hoja de varias capas de la célula sigue siendo una preocupación importante durante la construcción en vitro . Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de construcción de hoja celular eficiente y factible.
Este protocolo describe los pasos para preparar una hoja de células multilayeredmesenchymal la célula de vástago (MSC). En este sistema de construcción, la resistencia mecánica de la hoja de la célula proviene de una DPP. Partiendo de este andamio, la estructura 3D de la célula puede rápidamente construir con RAD16-I hidrogel de péptido y un sistema de perfusión dinámica se utiliza para la hoja de varias capas de células, con el fin de estabilizar la estructura de la hoja de celular 3D y proporciona nutrición suficiente de la cultura fuente para las células. Usando este sistema, una hoja de varias capas de CMMo se preparó con éxito y exhibe un efecto terapéutico óptimo en el infarto de miocardio de rata modelo13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Terapia con células madre muestra un prometedor futuro en regenerar las heridas órganos y tejidos, y la técnica de la hoja de la célula ha sido desarrollada para mejorar la retención baja celular y la supervivencia pobre dentro de la zona de destino. Sin embargo, durante el proceso de construcción en vitro , una solución para mantener la actividad biológica de células madre y aumento de la cantidad de células dentro de la hoja de la célula es urgente. Aquí, este protocolo presenta un método para la construcción de una hoja de varias capas de células con células madre favorable bioactividad y óptima operatividad. Pericardio porcino decellularized (DPP) es preparado por fosfolipasa un método de descelularización2 (PLA2) como el andamio de la hoja de la célula, y rata médula ósea las células madre mesenquimales (BMSCs) son aisladas y ampliadas como las células sembradas. La estructura de la hoja temporal varias capas celulares se construye mediante el uso de RAD16-I péptido hidrogel. Finalmente, la hoja de la célula se cultiva con un sistema de perfusión dinámica para estabilizar la estructura tridimensional (3D), y la hoja de la célula podría obtenerse después de un cultivo de 48-horas en vitro. Este protocolo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de una hoja de varias capas de células, y la hoja de la célula podría desarrollarse como un producto de terapia de células madre favorable en el futuro.

El esquema de la construcción de la hoja de varias capas de células madre se muestra en la figura 1. Preparando el andamio de la hoja de la célula por el método de descelularización de2 PLA es el primer paso. Basado en el andamio, una estructura temporal celular 3D se construye mediante la mezcla de las células madre con el hidrogel del péptido RAD16-1. Para obtener una hoja de varias capas de células con células madre favorable bioactivid...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D

Este artículo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de hojas de varias capas de células madre con células madre favorable propiedad.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Terapia con células madre se ha divulgado ampliamente como un tratamiento prometedor para muchas enfermedades. Y las técnicas de la hoja celular se han desarrollado con el fin de mejorar la retención de la célula y la supervivencia dentro de los objetivos, también. Durante la construcción de láminas celulares, el suministro de nutrición insuficiente sigue siendo un problema clave para la pérdida de la función de las células madre, y es una propiedad de células madre insatisfactorias que finalmente afectaría los efectos terapéuticos in vivo.Nuestro propósito de preparar el producto de lámina de células madre multicapa disponibles, nuestro equipo desarrolló el andamio de láminas celularizadas, pericardio y láminas celulares. Sobre la base del andamio, el arrancador de células multicapa se construiría rápidamente con hidrógeno nonapéptido y se utiliza un sistema de perfusión dinámica para garantizar el suministro de nutrición de la célula madre in vitro. Saque un andamio DBP seco y colótelo en el centro de la base negra.Coloque un anillo de tensión blanco en el andamio DBP y colócalo en el soporte de tejido. Asegúrese de que el andamio DBP esté totalmente fijado en el soporte de tejido. Agregue 100 medios de cultivo de microlitros en el andamio DBP.Coloque el andamio en la incubadora de 37 grados Celsius y déjelo remojar durante 15 minutos. Saque las células de la incubadora, retire los medios de cultivo del plato de cultivo, lave suavemente las células con dos mililitros de PBS caliente. Retire todo el PBS del plato de cultivo y asegúrese de que no quede líquido.Añadir dos mililitros a 1.25%solución de trippsina al plato, e incubar las células durante tres minutos. Detenga el efecto de la trippsina añadiendo dos mililitros de cultivo medio. Lave suavemente las células del plato.Transfiera las suspensiones celulares en un nuevo tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la gravedad durante cinco minutos, y obtener sedimentos celulares. Retire el sobrenadante y acabe con el sedimento celular.Re suspenda las células con una solución de tres mililitros de 10%sacarosa. Aspirar 10 microlitros suspensión celular, y el número de celda de contenido lee un hemocicómetro, extraer tres millones de células y transferir en su nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la raíz cuadrada durante cinco minutos, eliminar completamente los sobrenadantes y obtener el sedimento de las células.Preparar 20 microlitros 10%solución de sacarosa. Reabrir suavemente las células y obtener una suspensión uniforme. Añadir 20 microlitro péptidos hidro gel en la parte superior de la suspensión mezclar suavemente el gel de péptido hidro, y las células suspensión con la T, sacar el andamio DBP, dejando el portador del tejido, y luego aspirar suavemente la mediana de calculi con un T.Aspirar la mezcla la mezcla y añadir uniformemente al andamio DBP.Añadir un mililitro de esteliceto de calcio en la parte inferior del portador del tejido. Agregue suavemente un medio cultural de cuatro mililitros en el plato de cultivo y luego emerja la hoja de celda. Ponga las células en la incubadora durante dos horas para que se escaren.El sistema de perfusión dinámica incluye un recipiente de cultivo de perfusión, el recremento de intercambio de gas y una botella de vidrio. Los ensamblados son sistemas de perfusión dinámicos como se muestra en la figura. Añadir dos medios de cultivo hidrolilitros en la botella de vidrio.Inserte la hoja celular en la cámara del recipiente de cultivo, agregue tres medianas de cultivo de mililitros en el recipiente, coloque los sistemas de perfusión dinámica en las incubadoras y comience a bombear. Abra el contenedor de referencia cultural en el recumbent bipositivo. Saque la hoja de celda del recipiente de cultivo y colóquela en un plato de cultivo.Utilice un fórceps para inmovilizar el portador del tejido y utilice otros dos fórceps para separar el anillo de tensión blanca de la base negra. Por último, obtenga la hoja de celda multicapa. El andamio DBP es transparente.El SEM revende muestra que las universidades capturadas y los componentes están completamente reservados. Las hojas celulares se pueden obtener y mantener por fórceps para su conservación corta. Estas láminas celulares podrían transferirse a un tubo cilindriforme de 1,5 mililitros.Como modelo, por ejemplo, comenzando con muestras de células de BMFC altamente positivas para el marcador de células madre CD 9O y el CD 29. Después de la construcción de la célula, el BMFC está dejando la hoja celular sigue siendo altos niveles de expansión de CD 90 y el CD 29. La construcción de la estructura de celdas multicapa es el paso crítico del protocolo.El tiempo de la sartén requiere cuatro geles hidroeléctricos cuando el valor PH cambia de SA a neutro, por lo tanto, es importante lavar la célula con solución de sacarosa para eliminar los iones de superficie. Además, la relación de volumen de la suspensión celular y el panthihidrogel no es buena amiga para la construcción de la estructura multicapa temporal. Después de la formación de la estructura de células madre 3D, verá que el sistema de perfusión dinámica es importante para estabilizar la estructura multicapa, así como para mantener las viabilidades de las células madre.La infiltración dinámica de la mediana de cultivo podría facilitar que las células madre proliferen y extrapolar el contexto celular dentro de la estructura multicapa también los termómetros de cultivo dinámicos deben ajustarse de acuerdo con diferentes tipos de células madre.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Investigación

Bioingeniería

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...