Name: construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (licensnummer 31771064); Vetenskap och teknik planering projekt i provinsen Guangdong (grant nummer 2013B010404030, 2014A010105029 och 2016A020214012); Vetenskap och teknik planering projekt i Guangzhou (licensnummer 201607010063); och grundutbildning Innovation och entreprenörskap träningsprogram (licensnummer 201610559028); National Science Foundation för unga forskare i Kina (bevilja nummer 31800819).

Alla stamceller och djurförsök förfaranden utfördes enligt de etiska riktlinjerna av den nationella Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkänts av Jinan University djur vård och användning kommittén (Guangzhou, Kina).
1. beredning av DPP ställningen med de PLA2 Decellularization metod14
Obs: Se figur 1A för en schematisk av metoden PLA2 decellularization.
...

<ol>
	<li>Miyahara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayered+mesenchymal+stem+cells+repair+scarred+myocardium+after+myocardial+infarction.">Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-sheet+technique+eliminates+arrhythmogenicity+of+skeletal+myoblast-based+therapy+to+the+heart+with+enhanced+therapeutic+effects.">The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeutic effects.</a> International Journal of Cardiology. 168 (1), 261-269 (2013).</li><li>Narita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Scaffold-free+Cell+Sheet+Technique+to+Refine+Mesenchymal+Stromal+Cell-based+Therapy+for+Heart+Failure.">The Use of Scaffold-free Cell Sheet Technique to Refine Mesenchymal Stromal Cell-based Therapy for Heart Failure.</a> Molecular Therapy. 21 (4), 860-867 (2013).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+Piled-Up+Cardiac+Tissue-Like+Sheets+With+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cells+Robustly+Promotes+Cell+Engraftment+and+Ameliorates+Cardiac+Dysfunction+After+Myocardial+Infarction.">Efficiently Piled-Up Cardiac Tissue-Like Sheets With Pluripotent Stem Cell-Derived Cells Robustly Promotes Cell Engraftment and Ameliorates Cardiac Dysfunction After Myocardial Infarction.</a> Circulation. 128 (22), (2013).</li><li>Alshammary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cardiac+stem+cell+sheet+transplantation+on+myocardial+infarction.">Impact of cardiac stem cell sheet transplantation on myocardial infarction.</a> Surgery Today. 43 (9), 970-976 (2013).</li><li>Chen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+novel+PLGA+fiber/collagen+composite+web+as+a+scaffold+for+engineering+of+articular+cartilage+tissue+with+adjustable+thickness.">The use of a novel PLGA fiber/collagen composite web as a scaffold for engineering of articular cartilage tissue with adjustable thickness.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67a (4), 1170-1180 (2003).</li><li>Cerqueira, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose+Stem+Cells+Cell+Sheet+Constructs+Impact+Epidermal+Morphogenesis+in+Full-Thickness+Excisional+Wounds.">Human Adipose Stem Cells Cell Sheet Constructs Impact Epidermal Morphogenesis in Full-Thickness Excisional Wounds.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).</li><li>Sasagawa, T., Shimizu, T., Sekiya, S., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+angiogenic+potential+between+prevascular+and+non-prevascular+layered+adipose-derived+stem+cell-sheets+in+early+post-transplanted+period.">Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (2), 358-365 (2014).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayered+adipose-derived+regenerative+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+myocardial+infarction.">Multilayered adipose-derived regenerative cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for myocardial infarction.</a> International Journal of Cardiology. 175 (3), 545-553 (2014).</li><li>Godier-Furnemont, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanofibrous+sheets+of+collagen/elastin/polycaprolactone+improve+cardiac+repair+after+myocardial+infarction.">Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction.</a> American Journal of Translational Research. 8 (4), 1678-1694 (2016).</li><li>Arana, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+delivery+of+collagen+patches+with+adipose-derived+stem+cells+in+rat+and+minipig+models+of+chronic+myocardial+infarction.">Epicardial delivery of collagen patches with adipose-derived stem cells in rat and minipig models of chronic myocardial infarction.</a> Biomaterials. 35 (1), 143-151 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+high+bioactivity+multilayered+bone-marrow+mesenchymal+stem+cell+sheets+for+myocardial+infarction+using+a+3D-dynamic+system.">Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system.</a> Acta Biomaterialia. 72, 182-195 (2018).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phospholipase+A(2)+to+prepare+acellular+porcine+corneal+stroma+as+a+tissue+engineering+scaffold.">The use of phospholipase A(2) to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold.</a> Biomaterials. 30 (21), 3513-3522 (2009).</li><li>Degano, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+on+mouse+embryonic+fibroblast+implantation+and+proliferation.">The effect of self-assembling peptide nanofiber scaffolds on mouse embryonic fibroblast implantation and proliferation.</a> Biomaterials. 30 (6), 1156-1165 (2009).</li><li>Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+stem+cell+niches+from+the+molecule+up+through+engineered+peptide+materials.">Building stem cell niches from the molecule up through engineered peptide materials.</a> Neuroscience Letters. 519 (2), 138-146 (2012).</li><li>Cui, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+with+Self-Assembling+Polypeptide+Scaffolds+Is+Conducive+to+Treating+Myocardial+Infarction+in+Rats.">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells with Self-Assembling Polypeptide Scaffolds Is Conducive to Treating Myocardial Infarction in Rats.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 222 (4), 281-289 (2010).</li><li>Jun, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Assembled+Bilayer+Cell+Sheets+of+Stem+Cells+and+Endothelial+Cells+Using+Thermosensitive+Hydrogels+for+Therapeutic+Angiogenesis.">Spatially Assembled Bilayer Cell Sheets of Stem Cells and Endothelial Cells Using Thermosensitive Hydrogels for Therapeutic Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (9), (2017).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+tissue+grafts+sandwiched+with+multilayered+mesenchymal+stromal+cell+sheets+induce+tissue+regeneration+for+cardiac+repair.">Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 88-95 (2008).</li></ol>

Protokolls rapporterar en effektiv metod för att konstruera ett multilayered MSC-blad. Detta cellagret uppvisar optimal mekanisk hållfasthet, hög celldensitet sådd och gynnsamma stamceller bioaktivitet. Använda BMSCs som ett exempel, 3D cellens struktur byggs snabbt med RAD16-jag peptid hydrogel. Efter att vara odlade i systemets dynamiska perfusion, bladet multilayered BMSC erhålls framgångsrikt och BMSCs upprätthålla ett högt uttryck av stamceller markörer.
Att bygga tillfälliga ...

Stamcellsterapi har rapporterats som en effektiv behandling för många sjukdomar. dock fortfarande låg cell lagring och dålig överlevnad inom träningszonen kritiska problem efter traditionella stamceller injektion. För att lösa problemet, utvecklat tissue engineering forskare cell ark tekniken. En monolayered cellagret med intakt extracellulärmatrix förbereddes för det första genom att använda temperatur-svar kultur maträtt1, och dess uppföljande studier rapporterade betydande förbättringar av stamceller retention och överlevnad inom den infarcted område2,3. Bland metoderna, har konstruera multilayered cellagret rapporterats som en effektiv strategi för att förbättra cellöverlevnad och den cell blad terapeutiska effekt3,4. Sedan dess har forskare arbetat på utveckla annan cell ark byggmetoder för att öka den cell belopp, stamceller egendom och mekaniska egenskaper av cell täcker. Hittills har vissa typer av cellagret har konstruerats och studerade vid behandling av hjärtinfarkt5, brosk skada6, och hud sår7.
Bioaktiviteten av stamceller före transplantation visade en framväxande påverkan på skadade vävnadsregenerering och annan cell blad konstruktion strategier har olika effekter på stamcellerna. Å ena sidan, konfluenta cell ark endast bestod av högdensitets stamceller och naturliga extracellulära matriser kan förvärvas genom att stapla monolayered cell ark8 eller med hjälp av magnetiska tissue engineering tekniker9. Å andra utvecklat forskare olika ställningar för att ge tillräcklig mekanisk styrka och stöd cell tillväxt10,11,12, som får en låg stamcell sådd densitet för att säkerställa näringen leverans. Trots dessa synsätt dock låg effektiv näring leverans inom multilayered ark cellstrukturen en stor oro under in vitro- byggandet. En effektiv och genomförbar cell ark byggsystem är därför angeläget.
Det här protokollet beskriver stegen för att förbereda en multilayeredmesenchymal stamceller (MSC) cellagret. I detta byggsystem tillhandahålls cell ark mekaniska styrka av en DPP. Baserat på denna byggnadsställning, 3D cellens struktur kan snabbt byggas med RAD16-jag peptid hydrogel och en dynamisk perfusion systemet används till kultur multilayered cellagret, för att stabilisera 3D ark cellstruktur och ge tillräcklig näring utbudet för cellerna. Med detta system, ett multilayered BMSC ark var förberetts och ställde ut en optimal terapeutisk effekt på råtta hjärtinfarkt modell13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Phospholipase A2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6534</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">89033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin streptomycin / amphotericin&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">15640055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buffer bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C3041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Table concentrator</td>
			<td style="width:108px;">Changzhou Aohua Instrument Co.</td>
			<td style="width:167px;">KT20183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium(DMEM)</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">10-014-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">South American fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Gibco BRL</td>
			<td style="width:167px;">10270-106/P30-3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td>
			<td style="width:108px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:167px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">AC2-2S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Constant temperature incubator&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Esco,Singapore</td>
			<td style="width:167px;">CLS-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EP tube</td>
			<td style="width:108px;">Axygen</td>
			<td style="width:167px;">31617934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifugal machine</td>
			<td style="width:108px;">TOMOS</td>
			<td>1-16R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">S9378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pura Matrix&#160;</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:216px;">Dynamic perfusion culture system</td>
			<td style="width:108px;">Minucells and Minutissue</td>
			<td style="width:167px;">D-93077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">IPC N8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pump tubing</td>
			<td style="width:108px;">Ismatec</td>
			<td style="width:167px;">Nr.1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1300&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>tissue carrier components&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>dynamic perfusion system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0006</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>gas exchange equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 0002</td>
			<td style="width:108px;">Regensburg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>500 mL glass bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MINUSHEET 1301</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>perfusion culture container&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of a multilayered mesenchymal stem cell sheet with a 3d dynamic culture system

Stamcellsterapi visar en lovande framtid i regenererande skadade organ och vävnader, och cellen ark tekniken har utvecklats för att förbättra lågt retention och dålig överlevnad inom träningszonen. Dock under in vitro- byggprocessen behövs en lösning för att upprätthålla stamceller bioaktivitet och ökar cell inom cellagret snarast. Här, presenterar detta protokoll en metod för att konstruera ett multilayered cellagret med gynnsamma stamceller bioaktivitet och optimal funktion. Cell-lösa svin hjärtsäck (DPP) är utarbetad av fosfolipas en2 (PLA2) decellularization metod som cellen ark schavotten, och råtta benmärgen mesenkymala stamceller (BMSCs) är isolerade och expanderade som seedade cellerna. Tillfälliga multilayered ark cellstrukturen konstrueras genom att använda RAD16-jag peptid hydrogel. Slutligen, cellagret är odlade med en dynamisk perfusion-system för att stabilisera den tredimensionella (3D) strukturen och cellagret kunde erhållas efter en 48-timmars kultur i vitro. Detta protokoll ger en effektiv och genomförbar metod för att konstruera ett multilayered stamceller blad och cellagret skulle kunna utvecklas som en gynnsam stamceller behandling produkt i framtiden.

Schematiskt av multilayered stamceller ark konstruktionen visas i figur 1. Förbereda cell ark ställningen av metoden PLA2 decellularization är det första steget. Baserat på schavotten, är en tillfällig 3D cellstruktur konstruerad genom att blanda stamcellerna med den RAD16-1 peptid hydrogel. För att erhålla ett multilayered cellagret med gynnsamma stamceller bioaktivitet och optimal mekanisk styrka, är cellagret odlade i en dynamisk perfu...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System at JoVE.com

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggandet av ett Multilayered mesenkymala stamceller blad med ett 3D dynamisk kultur System

Denna artikel ger en effektiv och genomförbar metod för att konstruera multilayered stamceller ark med gynnsamma stamceller boende.

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Stamcellsterapi har rapporterats allmänt som en lovande behandling för många sjukdomar. Och cellarkteknikerna har utvecklats för att förbättra cellens bibehållande och överlevnaden inom målen också. Under cell ark konstruktion, den otillräckliga näring utbudet förblir ett viktigt problem för förlusten av stamceller funktion, och är en otillfredsställande stamcellsegenskap skulle slutligen effekt de terapeutiska effekterna in vivo.Vårt syfte att förbereda tillgängliga flerskiktade stamceller ark produkt, vårt team utvecklat den cellularized polesized, hjärtsäck och cell ark byggnadsställning. Baserat på byggnadsställningen multilayer celler starter skulle snabbt konstrueras med nonapeptid Väte och en dynamik perfusion system används för att säkerställa stamceller näring utbudet in vitro. Ta ut en torkad DBP-byggnadsställning och lägg den i mitten av den svarta basen.Sätt en vit spänningsring på DBP-ställningen, och fäst den i vävnadsbäraren. Se till att DBP-ställningen är helt fast i vävnadsbäraren. Lägg till 100 mikroliters odlingsmedier på DBP-ställningen.Sätt ställningen i 37 grader Celsius inkubator, och låt den suga i 15 minuter. Ta ut cellerna ur inkubatorn, ta bort odlingsmedierna från odlingsfatet, tvätta försiktigt cellerna med två milliliter varm PBS. Ta bort alla PBS från odlingsfatet, och se till att ingen vätska förblir.Tillsätt två milliliter till 1,25%trypsin lösning till skålen, och inkubera cellerna i tre minuter. Stoppa trypsineffekten genom att lägga till två milliliters odlingsmedium. Tvätta försiktigt cellerna från skålen.Överför cellupphängningar i en ny 15 milliliter centrifugalrör. Centrifugera cellerna vid 220 gånger gravitationen i fem minuter, och erhålla cellsediment. Ta bort supernatanten och utplåna cellsedimentet.Re suspend cellerna med tre milliliter 10%sackaros lösning. Aspirera 10 mikroliters cell suspension, och innehållet cellnummer läser en hemocytometer, extrahera tre miljoner celler och överföring i din nya 1,5 milliliter centrifugalrör. Centrifugera cellerna på 220 gånger kvadratrot i fem minuter, helt ta bort supernatanterna och få cellerna sediment.Förbered 20 mikroliter 10%sackaroslösning. Försiktigt åter upphäva cellerna och få en enhetlig suspension. Tillsätt 20 microliter peptidhydralegel i toppen av suspensionen blanda försiktigt peptidhydragelen, och cellerna suspension med T, ta ut DBP-byggnadsställningen, lämnar vävnadsbäraren, och aspirat sedan försiktigt calculi median med en T.Aspirate blandningen blandningen och jämnt lägga på DBP-byggnadsställningen.Tillsätt en milliliter kalciumedetate till botten av vävnadsbäraren. Tillsätt försiktigt fyra milliliter kulturellt medium i kultur skålen och sedan dyka upp cellen arket. Lägg cellerna i inkubatorn i två timmar låt det kultur.Den dynamiska perfusion systemet inkluderar en perfusion kultur behållare gasen utbyta rening och en glasflaska. Assembles är dynamiska perfusionssystem som figuren visas. Lägg till två hydro milliliter kultur medianer i glasflaska.Sätt in cellarket i kammaren i odlingsbehållaren, tillsätt tre milliliters odlingsmedians i behållaren, lägg de dynamiska perfusionssystemen i inkubatorerna och börja pumpa. Öppna odlingsbehållaren i den bipositiva recumbenten. Ta ut cellen arket från odlingsbehållaren och lägg den i kultur skålen.Använd en tång för att immobilisera vävnadsbäraren och använd ytterligare två tång för att separera den vita spänningsringen från den svarta basen. Slutligen, erhålla den flerskiktade cellen ark. DBP-ställningen är genomskinlig.SEM säljer vidare visar att college fångas och komponenterna är helt reserverade. Cellen täcker kan erhållas och rymdes av tlysna för kort bevarande. Dessa cellark kunde överföras till 1.5 milliliter cylindriform rör.Som en modell till exempel börjar med cell visningar av BMFC: s mycket positiva för stamceller markör CD 9O och CD 29. Efter cellkonstruktion BMFC' Lämnar cellen arket förblir höga expansionsnivåer av CD 90 och CD 29. Konstruera den flerskiktade cellstrukturen är det kritiska steget i protokollet.Pan tiden kräver fyra hydro gel när PH-värdet ändras från SA till neutral, därför är det viktigt att tvätta cellen med sackaros lösning för att avlägsna ytan joner. Också, volymförhållandet av cellfjädring och panthihydrogel är inte god vän för att konstruera den tillfälliga flerskiktsstrukturen. Efter bildandet av 3D stamcellsstruktur, kommer du att se den dynamiska perfusion systemet är viktigt för att stabilisera den flerskiktade strukturen samt upprätthålla stamceller viabilities.Den dynamiska infiltrationen av kulturmedian kunde göra stamcellerna lättare att föröka sig och extrapolera cellsammanhang inom den flerskiktade strukturen även de dynamiska odlingstermometraren bör justeras efter olika stamcellstyper.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Mikrofabricerade Plattformar för Mekaniskt Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Beredning av 3D Fibrin ställningar för Kultur Stem Cell Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Tissue Engineering: Konstruktion av en flercellig 3D Scaffold för Leverans av Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning och montering av 3D mikrokärl

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Avstämbar Hydrogeler från Lung Extracellulär Matrix för 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...