Name: high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00
Duration: 7 min 47 s
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作者感谢 d 玻璃, h. Cira, a. 乔科斯, s. 瑞吉, 和 b. 他们的有用建议和施波尔曼实验室, 以获得他们的共聚焦显微镜的关键。此外, 作者还承认斯坦福生物 X 宝和 NSERC PGS 研究金、国家卫生研究院 (R21-AI-139941) 和美国癌症协会 (RSG-14-177-01) 的支持。

1. pDawn-Ag43 菌菌株的制备
<ol><li>将 pDawn-Ag43 转化成大肠杆菌的兴趣应变 (图 1)。<ol>
<li>培养克隆菌株宿主 pDawn-Ag43 质粒 (从质粒库获得) 通过接种在 LB 汤中的菌株补充与50微克/毫升大观霉素 (LB + 规格) 在文化管 (过夜在振动孵化器在 ~ 250 rpm, 37 °c)。然后, 使用小量提取试剂盒采集纯化的 pDawn-Ag43 质粒10。</li>
		<li>选择要被图案化的大肠杆菌菌株。到目前为止, pDawn-Ag43 已被证实在 MG16553和 BW25113 工作。</li>
		<li>使用既定的协议生成所选大肠杆菌菌株 (例如, MG1655) 的合格 (例如, 具有化学能力的11或 electrocompetent12) 库存。</li>
		<li>将 pDawn-Ag43 质粒转化为有能力的细菌11,12, 其次 1 h 恢复, 和板上 LB + 规格琼脂板。允许菌落在37摄氏度的夜间生长。</li>
	</ol>
</li>
	<li>储存 pDawn-Ag43 变形菌株。<ol>
<li>接种一个 pDawn-Ag43 从 lb + 规格琼脂板到 lb + 规格的肉汤在培养管, 并在振动孵化器 (约 250 rpm, 37 °c) 到指数阶段 (OD600 ~ 0.4-0.8)。</li>
		<li>在低温管中, 将1毫升的培养与1毫升50% 无菌甘油混合在一起, 在-80 摄氏度的时间内储存 pDawn-Ag43 转化的应变, 以获得25% 个甘油冷冻库。储存在-80 摄氏度的冰柜里。</li>
		<li>如果需要转换额外的质粒 (如荧光报告质粒), 则从 pDawn-Ag43 转换的应变中创建有能力的细胞11、12 , 并重复转换过程11,12根据需要提供额外的质粒。 注: 如果使用电穿孔8, 可以同时 cotransform 多个质粒 (包括 pDawn-Ag43);但是, 不建议使用化学变换方法同时进行转换, 因为 pDawn-Ag43 的大尺寸 (> 10 kB) 意味着转换效率降低。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 为照明细菌准备投影机光学设置
<ol><li>获得具有非透明墙壁的细菌培养箱和通过电缆的孔、可在细菌培养箱内安装和运行的便携式投影仪, 以及一台配备了演示投影软件的笔记本电脑 (参见表材料)。在选择投影机和孵化器时, 确保投影机的最小对焦距离小于孵化器的内部高度。</li>
	<li>将投影机放在底部的孵化器内, 光圈指向直接向上, 在天花板上, 在那里附着生物膜培养室 (图 2)。</li>
	<li>通过构建一个连接到垂直柱的光学面包板底座, 然后连接到投影机的水平柱 (图 2), 将投影机固定到位。请注意, 此设置可以根据投影仪/可用部件进行修改。最终, 关键要求是投影机牢固固定在孵化器底部附近, 光圈向上指向。</li>
	<li>通过显示屏电缆 (例如HDMI) 将笔记本电脑连接到孵化器内的投影仪。</li>
	<li>如果培养箱内部的表面 (特别是天花板) 是反光的 (例如金属抛光表面), 用深色哑光表面覆盖它们, 以最小化反射。</li>
	<li>使用胶带将一个空的 "假" 文化菜装到孵化器的天花板上。请注意, 与投影机一样, 有多种可接受的方式来附着培养皿;确保不覆盖培养室的透明底面 (其中照明发生)。</li>
	<li>通过转动对焦旋钮调整投影机的对焦, 使对焦平面与培养皿顶部的生物膜培养盘 (例如, 孔板) 的底面重合 (图 2)。投影机应照亮文化盘子底部的锐利、不模糊的图像。在优化投影后, 删除 "虚拟" 文化菜式。</li>
	<li>使用笔记本电脑软件, 通过呈现完整的蓝色幻灯片, 直接将投影机照亮整个视野, 并使用最大的蓝色照明 (例如, RGB = [0、0、255])。</li>
	<li>使用光学功率计测量投影机的照明强度, 方法是将光电探测器头放置在孵化器天花板上, 并读取校准到光波长 460 nm 的相应功率计的强度。按照所使用的特定功率计连接和校准光电探测器的说明进行操作。<ol>
<li>在进行光照强度测量之前, 尽量减少环境光 (例如, 关闭房间灯光或将孵化器远离光源)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用放置在投影机光圈处的可调节中性密度滤镜调整光照强度。旋转滤镜以调整功率计测量的光照强度, 直到蓝光投射区域中心的光照强度读数为50微瓦/厘米2。 注意: 虽然可以通过在软件端使用较低的蓝色 rgb 值来调整光照强度, 但在最大化蓝色 rgb 值时使用过滤器, 其优点是最大化光照与照明之间的系统的光学对比度。暗区域。</li>
	<li>使用笔记本电脑上的演示/投影仪软件绘制任意图案, 并使用投影机在孵化器的天花板上显示这些图案。 注: 应使用最大蓝色光照 (例如rgb = [0、0、255]) 绘制生物膜形成区域, 无光照的非生物膜形成区域 (例如, rgb = [0、0、0])。</li>
</ol>3. 培养图案生物膜
<ol><li>在照明之前, 准备 pDawn-Ag43 细菌, 从甘油冷冻库开始, 使它们在光照的晚期指数增长阶段得到可靠的诱导 (图 3A)。<ol>
<li>从甘油库存到 LB + 规格琼脂板的 pDawn-Ag43 菌株。允许菌落在夜间生长 (37 摄氏度)。 注意: 从这里直到照明文化步骤, 确保细胞在黑暗中尽可能多地停留-在环境照明的短暂周期 (例如, 对于 subdilution) 是可以接受的。</li>
		<li>在 LB + 规格肉汤中接种琼脂板中的 pDawn-Ag43 细菌, 并将其培养为固定相 (在 250 rpm, 37 摄氏度, 约16小时) 的振动孵化器中。</li>
		<li>Subdilute 的文化的比率 1:1, 000 与 LB + 规格肉汤 (例如, 添加1微升的过夜文化到1毫升新鲜 LB + 规格)。</li>
		<li>允许 subdiluted 培养, 直到晚期指数/早期固定相 (OD 〜 1.0, 约 6 h 在振动孵化器在 ~ 250 rpm, 37 °c)。</li>
		<li>在等待培养基生长的同时, 用 1x M63 盐、1 mM MgSO4、0.2% 葡萄糖、0.1% casamino 酸和50微克/毫升大观霉素在水中制备 M63 培养基 (确保成分无菌)。</li>
		<li>Subdilute 的晚期指数阶段培养的比率为 1:100, M63 培养基辅以50微克/毫升大观霉素。然后, 将稀释剂引入生物膜培养皿中 (例如, 将稀释后的样品移入孔板)。 注: 此 1:100 subdilution 所需的体积取决于所使用的培养皿 (例如, 如果使用6孔聚苯乙烯孔板 [非组织培养处理], 单个样品将需要增加20微升的培养到2毫升的 M63+spec, 因为6孔板的标准井容积为 ~ 2 mL)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>由于样品现在已准备好进行照明, 将培养皿胶带到孵化器的天花板上, 确保碟底的表面是透明的, 以便投影机下方的照明。 注意: 确保孵化器的天花板不反射, 以尽量减少杂散照明是很重要的。使用黑壁板作为培养皿也可以减少杂散照明, 虽然这不是绝对必要的-如果使用这种板材, 确保底部表面是透明的。</li>
	<li>允许生物膜在孵化器中的培养过夜 (16 小时, 没有震动, 在37摄氏度)。请注意, 某些投影仪在较高温度下变得不太可靠。如果是这种情况, 在较低温度下的培养 (例如, 30 摄氏度), 请记住, 孵育时间可能需要增加, 这取决于大肠杆菌菌株。</li>
</ol>4. 成像图案生物膜
<ol><li>在生物膜样品过夜生长后, 从孵化器中取出培养皿。这道菜将有生物膜细菌附着在其底部表面, 在那里被照亮, 以及浮游细菌分散在上面的液体介质。</li>
	<li>通过去除培养基中的液体培养基 (例如用移液器轻轻吸气), 丢弃浮游细胞。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 溶液冲洗样品 2x, 通过在 PBS 中轻轻移液去除剩余的浮游细胞 (图 3B), 然后吸入。</li>
	<li>如果细胞被荧光标记, 使用荧光显微镜13 (例如, 宽场13, 3 D 共焦14等) 直接成像样品。 注意: 荧光生物膜也可以使用自硬化安装介质进行保存。将一滴安装介质应用到生物膜样品中, 用玻璃盖玻片盖住, 注意不要捕捉下面的气泡, 并允许在成像前一夜硬化。</li>
	<li>如果使用的细菌细胞不是荧光标记的, 请应用水晶紫染色技术15 (图 3B), 在成像之前增强生物膜对比度。</li>
</ol>5. 协议修改/备选方案
<ol><li>在不同的表面生长 pDawn-Ag43 细菌。<ol>
<li>在添加细菌样品/光照之前, 将玻璃或聚二甲基硅氧烷 (pdms) (如盖玻片或薄条) 放在孔板上, 并遵循与之前相同的协议, 以在玻璃上 pDawn-ag43 生物膜和Pdms。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在透明封闭的培养室内生长 pDawn-Ag43 细菌。<ol>
<li>为 PDMS 生成培养室模具。<ol>
<li>对于一个基本的培养室, 通过将坚硬的长方形棱镜附着在平坦的表面上生成模具 (当模具铸造时, 棱镜将成为 PDMS 中用作培养室的腔体)。请注意, 更复杂的培养室模具可以使用软光刻16制造。</li>
		</ol>
</li>
		<li>将 pdms 浇注到模具中并允许其固化 (对于详细的软光刻协议, 请参阅朱庇特科学教育数据库16)。</li>
		<li>固化后, 修剪任何多余的 PDMS, 冲入腔体/培养腔中的进/出口通道, 将空穴固定在平坦表面 (如玻璃/聚苯乙烯), 方法是将 pdms 牢牢地压在平面上, 使表面与作为生物膜培养室的 PDMS 天花板。 注意: 基于等离子体处理的更持久的粘合16也可以使用, 但芯片将不会被重复使用。</li>
		<li>按照以前的文化协议, 使用带有钝头针头 (而不是移液器) 的注射器将细菌样本引入培养室/用 PBS 缓冲液冲洗 (图 3C)。<ol>
<li>如果使用暂时粘合的腔体, 则仅使用负压将液体拉出腔室, 以确保腔体不会与底层玻璃/聚苯乙烯表面无粘结。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用薄膜光掩模为结构化照明生长 pDawn-Ag43 细菌。<ol>
<li>使用与胶片光掩模打印机/打印服务兼容的 CAD 软件设计生物膜模式。光掩模薄膜的设计应该在生物膜要印刷的区域内清晰明了, 而在别处是黑色/不透明的。完成后, 将光掩模文件发送到打印机/打印服务, 等待物理光掩模的返回。</li>
		<li>使用笔记本电脑软件, 指示投影机以最大蓝光照明 (例如RGB = [0、0、255]) 照亮整个视野。</li>
		<li>从较大的薄膜光掩模中切出感兴趣的区域, 并将其直接贴到生物膜培养皿的底部, 然后再引入细菌样品过夜照明 (图 3D)。像以前一样培养生物膜, 在成像之前去除光掩模。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

鉴于需要的研究工具, 允许生物膜结构控制, 我们提出了一个易于使用的协议, 使用 pDawn-Ag43 光遗传学构造模式细菌生物膜。利用这种技术,大肠杆菌生物膜可以在各种表面环境 (包括封闭腔室) 上进行光学图案处理, 空间分辨率低于25微米。
总的来说, 本协议可分为四个主要部分: (1) 制备 pDawn-Ag43 菌, (2) 制备光学和培养装置的硬件, (3) 预光照细菌生长步骤, 以及 (4) 后光照冲洗和成像。
1节的关键部分是成功地将 pDawn-Ag43 质粒转化为感兴趣的大肠杆菌菌株。这是通过分离高质量纯化质粒和生成高质量的合格细胞进行转化 (表 1, 故障排除) 来促进的。
2节的关键部分是投影机设置的优化, 使照明强度调整到50微瓦/厘米2在 460 nm 波长, 和投影机正确地聚焦在生物膜样品高度。请注意, 在本协议中, 我们描述了一个倒置照明设置, 投影机从下面照射光线, 向上朝向生物膜样本。这种设置的优点是, 光只有在到达生物膜形成表面之前, 才需要穿过培养皿的底部。上面的照明意味着光必须穿过生物膜表面上方的液体介质, 在生长过程中, 它会与浮游细胞一起多云。除了这些关注之外, 在光学设置中尽量减少杂散光也很重要, 例如, 通过在孵化器内部覆盖反光表面, 这有助于获得更清晰的图案生物膜。在相关说明中, 还可以通过使用光掩模来控制光照模式 (图 3D、图 4C) 来获得更清晰的生物膜模式。需要故障排除的常见问题包括在较高温度下的投影机可靠性问题 (例如37 °c), 通过在较低温度 (例如30 摄氏度) 孵育生物膜生长, 以及计算机软件, 可将其降至最低。在隔夜增长期间导致操作系统更新或蓝光过滤 (表 1)。还需要注意的是, 根据使用的投影机和孵化器型号, 投影机产生的热量也可能会导致室内温度高于孵化器设定温度, 这可能需加以纠正。
3节的关键部分是获得可靠和可重复的细菌样本, 然后才被光照诱导。因此, 建议通过在琼脂板上将它们 pDawn-Ag43, 然后使用液体培养步骤, 以确保细菌在晚期指数生长阶段以可重复的速度照射/诱导, 从而获得克隆菌落。方式。
最后, 4 节的关键部分是彻底, 但也轻轻地, 洗去浮游细胞残留在生物膜模式协议之后;因此, 建议使用 PBS 执行多个温和的冲洗步骤。
与现有的细胞模式5,6的技术相比, 基于 pDawn-Ag43 的光学生物膜图案具有合理的低进入门槛, 因为它不需要微细加工、洁净室设施、复杂化学, 或表面预处理, 但仍然能够与高分辨率 (25 微米) 的模式, 通常与微细加工技术相关联。该方法扩展了以往细菌光刻技术控制基因表达17的工作。目前, pDawn-Ag43 质粒仅限于大肠杆菌, 因为它使用基于临市局的复制来源, 但 pDawn 和 Ag43 在其他 (革兰氏阴性) 细菌物种中都是相容的。遗传技术可用于潜在地引入不同细菌物种的光调节生物膜形成, 并代表未来研究的一个可能方向。该技术的另一个潜在限制是, 它的工作原理是增加生物膜形成在弱原生生物膜形成的菌株 (例如, MG1655大肠杆菌)。然而, 具有强原生生物膜形成的菌株具有生物膜形式, 无论光照条件如何, 使用 pDawn-Ag43 排除图案生物膜形成;然而, 光遗传学技术可能仍然适用于调节生物膜的形成。我们注意到, 在其他情况下, 可以使用替代的生物膜模式方法, 例如通过光学 c-二-GMP 调制18。
总体而言, 基于 pDawn-Ag43 的模式将适用于研究生物膜结构对功能1的影响的应用, 因此, 可以从可调谐控制生物膜模式中获益--特别相关其中突出的例子是生物膜中微生物生态学的研究2。未来的方向包括制作图案生物材料8、9和/或结构化细菌群落。这种可访问的协议的替代应用还包括生物艺术19, 考虑到明确的美学潜力, 以及正规和非正规生命科学教育 20,21,22。从教育的角度来看, 这里描述的协议结合了许多相关技术 (细菌培养, 转化, 光学/光遗传学), 也模块化可扩展 (例如, 包括微流体)。

生物膜是微生物的表面附着群落, 以其强大的结构-功能耦合而闻名。生物膜的空间几何和图案在整体群落功能中发挥着重要作用 (反之亦然)1。生物膜结构中涉及的小长度尺度--以2微米的顺序--使生物膜模式的可调谐和方便控制成为一个具有挑战性的问题。在这里, 我们演示了一个协议, 允许生物膜精确地在任意几何形状, 基于光照明。
这里提出的协议使用 pDawn-Ag433, 一种光遗传学的结构, 夫妻生物膜形成在大肠杆菌细菌到光照明通过驱动 Ag43 的表达 (黏附基因负责表面黏附和生物膜pDawn4 (由光学照明控制的转录调节器) 的控制下形成。该方法使用方便, 可在各种表面环境 (包括封闭 (透明) 培养室) 中进行生物膜的图案化。与现有的细胞沉积方法相比, 如液滴沉积5或表面 prepatterning/处理6, pDawn-Ag43 不需要微细加工或洁净室设施, 不需要材料超出那些可供典型微生物学实验室使用。它能够以低于25微米的空间分辨率进行模式, 接近自然存在的生物膜2中独立王国的空间尺寸。总的来说, 这项技术提供了操作生物膜结构的能力, 然后开辟了许多途径来研究细菌群落中的微生态学7。此外, 图案生物膜可以提供一个方便的平台, 以设计有用的生物材料8,9。在本文中, 我们讨论了使用 pDawn-Ag43 进行阵列生物膜所需的基本协议, 并解决了与该方法相关的潜在修改和故障排除问题。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>107742</td>
			<td>DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG1655 E. coli</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td>
			<td>CGSC #6300</td>
			<td>MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP expression plasmid</td>
			<td>iGEM biobricks</td>
			<td>J04450-pSB4K5bb</td>
			<td>Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75852</td>
			<td>Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin to get sterile LB+spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75851</td>
			<td>Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>431760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab141968</td>
			<td>Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 media salts 5X solution</td>
			<td>Bio-world</td>
			<td>705729</td>
			<td>Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet&#160;</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>212120250</td>
			<td>Dilute to 0.1% in water prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-hardening mounting media (Shandon immumount)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can also use PBS prepared from powder / tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>351146</td>
			<td>Used as biofilm culture dish for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td>For use with liquid handling with enclosed microchambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tip needle</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-23-050</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-901</td>
			<td>Use to attach culture chamber to incubator ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Sheldon Manufacturing</td>
			<td>SMI6</td>
			<td>Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable projector</td>
			<td>Ivation</td>
			<td>IV-PJ-PRO-4-1</td>
			<td>Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MSB6</td>
			<td>Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR8</td>
			<td>2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post right-angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Connects vertical and horizontal posts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Connects optical breadboard base and vertical post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td>Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 set-screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SS25E63D</td>
			<td>Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>840</td>
			<td>Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter detector</td>
			<td>Newport</td>
			<td>818-UV</td>
			<td>Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable ND filter</td>
			<td>K&#38;F Concept</td>
			<td>SKU0689</td>
			<td>Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presentation-projector software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Powerpoint</td>
			<td>Any software that allows drawing / presentation will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk&#160;</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Many photomask printer services exist for high resolution (&#62;30000DPI) film photomask printing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43

空间结构和图案在细菌生物膜中起着重要的作用。在这里, 我们演示了一种可访问的方法, 将大肠杆菌生物膜培养成任意空间模式的高空间分辨率。该技术使用基因编码的光遗传学 construct—pDawn-Ag43—that 夫妇生物膜形成在大肠杆菌中蓝光的光刺激。我们详细介绍了用 pDawn-Ag43 转化大肠杆菌的过程, 准备所需的光学设置, 以及使用 pDawn-Ag43 细菌培养图案生物膜的协议。使用此协议, 空间分辨率低于25微米的生物膜可以在不同的表面和环境 (包括封闭腔室) 上进行图案化, 无需加工、洁净室设施或表面预处理。该技术适用于研究生物膜结构效果的应用, 对生物膜模式提供可调谐控制。更广泛地说, 它在生物材料、教育和生物艺术方面也有潜在的应用。

如图 4A所示, pDawn-Ag43 细菌被用于在聚苯乙烯井板上生成生物膜图案, 投影仪照明 (投影机设置为照亮圆点图案), 通过明场显微镜与晶体成像紫渍作为造影剂, 荧光显微镜使用红色荧光蛋白表达细菌。荧光生物膜样品也可以使用共聚焦显微镜14成像, 以获得3维生物膜的图像 (图 4B)。在图 4C中, 我们通过使用胶片光掩模为生物膜样本提供图案照明来说明可能的高分辨率图案。最后, 在图 4D和4E中, 我们演示了玻璃和 pdms 表面上的图形化示例, 以及封闭式 PDMS 培养室-这些说明了可应用 pDawn-Ag43 模式的不同类型的环境。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> 图 1: pDawn-Ag43 细菌的制备 (协议第1节).制备能够进行光调节生物膜形成的 pDawn-Ag43 细菌, 包括从宿主克隆菌株中纯化 pDawn-Ag43 质粒, 将其转化为感兴趣的大肠杆菌菌株, 并建立长期的细菌冷冻库。存储。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> 图 2: 制备生物膜样品照明的光学装置 (协议第2节).光学设置位于细菌培养箱内, 由计算机连接的投影仪照亮生物膜样品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> 图 3: 模式生物膜的区域性协议 (协议第3节).(A) 在照明之前, pDawn-Ag43 细菌是在模式之前制备的, 以便在适当的生长阶段可靠地诱导它们。(B) 在夜间光照生长后, 培养皿底部会出现一种图案生物膜, 以及液体介质中的浮游细胞, 经过一些进一步的处理后, 生物膜已准备好进行成像。(C) 作为孔板的替代品, 生物膜可以在封闭的培养室中培养, 如模压的 PDMS 腔。在这种情况下, 附着在钝头针头上的注射器可以用来介绍样品并将液体从室内排出。(D) 作为一种替代投影机的照明模式, 也可以通过将胶片光掩模直接贴在生物膜培养室底部来生成图案。在这种情况下, 投影机应设置为照亮整个领域的蓝光。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> 图 4: 使用 pDawn-Ag43 的生物膜图案的代表性结果.所有的结果都是使用 MG1655大肠杆菌宿主菌株获得的。(A) 使用 pDawn-Ag43 细菌在聚苯乙烯井板中生成生物膜图案, 投影机照明 (投影机设置为照亮圆点图案), 通过明场显微镜成像, 以水晶紫罗兰色染色作为造影剂和荧光显微术使用红色荧光蛋白表达细菌。(B) 用共聚焦显微镜成像荧光生物膜样品, 获得生物膜的3维图像。(C) 高分辨率生物膜可以用薄膜光掩模图案, 为生物膜样品提供图案照明。(D) 生物膜可以在玻璃和 PDMS 表面上进行图案化。(E) 生物膜可以在封闭的培养室中进行图案化。这个数字已经从以前的工作3改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>问题</td>
			<td>潜在原因/解决方案</td>
		</tr>
<tr>
<td>转换 pDawn-Ag43 成寄主菌株-无菌落</td>
			<td>低质粒浓度-检查光谱仪中的质粒浓度。典型的小量提取 pDawn-Ag43 应产生至少 100 ng/微升;使用高达 10-100 ng 进行转换</td>
		</tr>
<tr>
<td>检查/重塑有能力的细胞: 有能力的细胞应具有转化效率至少 10 ^ 6 µg 使用标准质粒 (如 pUC19) 进行验证-如果没有, 则重新改造主管细胞</td>
		</tr>
<tr>
<td>在 LB 琼脂板上的抗生素错误 (水平)-确保使用50微克/毫升大观霉素进行选择</td>
		</tr>
<tr>
<td>投影机照明在一夜之间熄灭/不一致</td>
			<td>禁用有问题的软件, 如: 自动过夜软件/OS 更新, 夜间蓝光过滤器</td>
		</tr>
<tr>
<td>投影机在打开投影机时, 可能会过热-设置孵化器以降低温度 (例如30°c 而不是37摄氏度)-注投影机作为热源可以过热孵化器超出设定点</td>
		</tr>
<tr>
<td>从孵化器中去除不必要的湿度来源, 因为这些可能会影响投影机电子</td>
		</tr>
<tr>
<td>无/低水平的生物膜形成后夜间照明, 没有浮游细胞生长 (即液体是明确的)</td>
			<td>错误 (水平) 抗生素-确保使用50微克/毫升大观霉素</td>
		</tr>
<tr>
<td>检查一切都被添加到 M63 食谱正确</td>
		</tr>
<tr>
<td>夜间光照后形成的生物膜不/低水平, 只有浮游细胞 (即液体多云)</td>
			<td>检查光电平, 投影机应照亮蓝光在50微瓦/厘米 ^ 2 在 460 nm 波长</td>
		</tr>
<tr>
<td>在添加到 M63 之前, 试着让细菌在1:1000 磅 subdilution 步骤后的短/更长时间里生长</td>
		</tr>
<tr>
<td>在 LB 板上 Restreak 细菌, 从新鲜菌落开始生成过夜固定相培养</td>
		</tr>
<tr>
<td>确保投影机在一夜之间持续工作-见上文点</td>
		</tr>
<tr>
<td>模糊生物膜模式, 高水平的背景噪声</td>
			<td>减少光照明系统中的杂散光, 在孵化器内部覆盖反射面</td>
		</tr>
<tr>
<td>考虑使用基于光掩模的 (而不是基于投影机的) 结构照明</td>
		</tr>
<tr>
<td>检查投影机是否正确聚焦于生物膜培养室的底部表面</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 常见故障排除问题。

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High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

通过对基因编码表面粘附结构的光学刺激, 证明了在任意空间模式下以高分辨率沉积大肠杆菌细菌生物膜的方法。

使用 pDawn-Ag43 的高分辨率图案生物膜沉积

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

我们开发了一种叫做生物膜光刻的方法，将光线照射到表面，细菌会积聚在光的位。这种方法将使我们能够回答生物膜研究中的一些关键问题，例如空间结构如何影响社区功能。这种方法有很多优点。例如，它工作在25微米的非常高的分辨率，它不需要表面预模式，也工作在封闭的流体器件内。虽然该方法可以洞察天然生物膜的结构-功能关系，但也可以应用于生物膜工程、生物材料和多细胞合成生物学等学科。此方法的可视化演示至关重要，因为在生物膜模式化之前，有关键的初步步骤来准备光学培养装置和细菌样本。首先，将pDawn-Ag43质粒转化为感兴趣的大肠杆菌菌株，并板到用斑点霉素补充的LB阿加子板上。在培养管中用斑点霉素将单个菌落接种到LB肉汤中，并在250转/小时和37摄氏度的摇晃培养箱中将细胞形成指数级。接种后，在低温管中将一毫升50%无菌甘油与一毫升培养力混合，准备25%的pDawn-Ag43转化菌株的25%甘油。将库存存放在零下 80 摄氏度的冰柜中。接下来，开始准备光学设置，将便携式投影仪放置在细菌培养箱的底部，孔径直接指向天花板，生物膜培养室将在那里连接。通过显示电缆将笔记本电脑连接到孵化器内的投影仪。使用胶带将空的虚拟培养皿连接到孵化器的天花板上。通过转动对焦旋钮调整投影机的对焦，使对焦平面与连接到孵化器天花板的生物膜培养盘的底部表面重合。投影机应在文化盘的底部照亮锐利、非模糊的图像。优化投影后，移除虚拟培养皿。使用便携式计算机软件，通过呈现全蓝色幻灯片，引导投影仪以最大的蓝色照明照亮整个视野。将光电检测器头置于孵化器天花板并读取校准为 460 纳米光波长的相应功率计的强度，使用光学功率计测量投影机的照明强度。接下来，使用放置在投影仪孔径上的可调中性密度滤波器调整照明强度。旋转滤光片以调整功率计测量的照明强度，直到蓝光投影区域中心的照明强度为每厘米平方 50 微瓦。使用位于培养箱天花板的校准光电探测器确保照明强度设置为适当的水平非常重要。这允许通过旋转中性密度滤波器对照明强度进行精确调谐。现在，使用笔记本电脑上的演示投影仪软件绘制任意图案，并使用投影仪在孵化器的天花板上显示这些图案。在照明之前，将甘油库存中的 pDawn-Ag43 应变条纹到 LB+规格的加糖板上。让殖民地在37摄氏度下过夜生长。从 LB+规格汤中的阿加糖板中接种一组 pDawn-Ag43 细菌，并在 250 rpm 和 37 摄氏度的摇晃培养箱中，在一夜之间将培养物生长到静止阶段。第二天，在LB汤中，用斑点霉素以1比1000的比例对培养子进行分维。允许亚稀释培养物在6小时以250转/时和37摄氏度的速度在摇晃的培养箱中生长，直到后期指数、早期静止阶段。在照明之前，对隔夜文化进行回稀释并增长到晚指数阶段非常重要。这可确保细菌在诱导时可靠健康和活性。孵育后，以1比100的比例对晚期指数期培养，用先前准备的M63培养剂辅以每毫升50微克的亚丁霉素。然后，将稀释引入生物膜培养皿中。由于样品现在已准备就绪，请将培养皿贴到培养箱的天花板上，确保培养皿底部的表面透明，以便由投影仪从下方进行照明。生物膜样品过夜生长后，从培养箱中取出培养皿。该盘将有生物膜细菌连接到其底部表面，它已被照亮，以及浮游生物细菌分散在上面的液体介质。从培养皿中去除液体介质，丢弃浮游细胞。接下来，用PBS冲洗样品两次，通过轻轻移液在PBS中去除剩余的浮游细胞，然后吸气。如果细胞被荧光标记，则使用荧光显微镜直接对样品进行成像。如这里看到的，pDawn-Ag43细菌被用来产生生物膜模式在聚苯乙烯井板与投影仪照明。生物膜可以使用水晶紫罗兰染色或荧光显微镜（如果使用荧光细菌）进行可视化。荧光生物膜样品也可以使用共生显微镜进行成像，以3D获得生物膜的图像。通过使用胶片光掩膜为生物膜样品提供图案照明，可以进行高分辨率图案化。此处显示了玻璃和 PDMS 表面上的图案示例以及封闭的 PDMS 培养室，并说明了可以应用 pDawn-Ag43 图案的不同类型的环境。在尝试此过程时，首先将 pDawn-Ag43 转换为您感兴趣的应变，然后正确聚焦和校准投影机，最后按照所需的培养和背稀释步骤进行心理测试，为细菌的照明做好准备，这一点很重要。按照这种方法，可以部署其他技术，例如，在不同的培养条件下长期监测生物膜。这样，我们可以理解生物膜结构如何影响其功能。这项技术将广泛应用，例如，用于合成生物学和材料研究，用于设计生物膜的各种应用。

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