Name: high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00
Duration: 7 min 47 s
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लेखकों ने डी ग्लास, एच किम, एन Cira, ए Choksi, एस राजन, और उनके सहायक सुझावों के लिए बी चाबियां और उनके फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग के लिए Spormann लैब धंयवाद । इसके अलावा, लेखकों स्टैनफोर्ड जैव से समर्थन स्वीकार एक्स Bowes और NSERC PGS फैलोशिप, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21-AI-१३९९४१), और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-14-177-01) ।

<ol>
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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

अनुसंधान उपकरण है कि फिल्म संरचना नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए की जरूरत के प्रकाश में, हम एक आसान करने के लिए उपयोग के लिए pDawn-Ag43 optogenetic निर्माण का उपयोग बैक्टीरियल फिल्म पैटर्न के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस तकनीक के साथ, ई. कोलाई के साथ एक विशेष प्रस्ताव के नीचे के साथ संलग्न कक्षों, सहित विभिंन सतह के वातावरण पर ऑप्टिकली पैटर्न किया जा सकता है माइक्रोन ।
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल नीचे चार मुख्य वर्गों में तोड़ा जा सकता है: (1) pDawn-Ag43 बैक्टीरिया की तैयारी, (2) ऑप्टिकल और संस्कृति सेट अप हार्डवेयर की तैयारी, (3) पूर्व दीप्ति बैक्टीरियल विकास कदम, और (4) के बाद रोशनी कुल्ला और इमेजिंग ।
खंड 1 के महत्वपूर्ण भाग pDawn के सफल परिवर्तन-Ag43 प्लाज्मिड हित के ई. कोलाई तनाव में है । यह उच्च गुणवत्ता शुद्ध प्लाज्मिड अलग और परिवर्तन (तालिका 1, समस्या निवारण) के लिए उच्च गुणवत्ता सक्षम कोशिकाओं को पैदा करने से सुविधा है ।
खंड 2 के महत्वपूर्ण भाग के प्रोजेक्टर सेट का अनुकूलन है, ताकि रोशनी की तीव्रता ४६०-एनएम तरंग दैर्ध्य पर ५० μW/cm2 में समायोजित किया जाता है, और प्रोजेक्टर ठीक से फिल्म नमूना ऊंचाई पर ध्यान केंद्रित है । ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल में, हम एक औंधा रोशनी सेट-अप का वर्णन जहां प्रोजेक्टर नीचे से प्रकाश चमकता है, ऊपर की ओर फिल्म नमूना । इस सेट का लाभ यह है कि प्रकाश केवल संस्कृति डिश के नीचे के माध्यम से फिल्म निर्माण की सतह तक पहुंचने से पहले यात्रा की जरूरत है । ऊपर से रोशनी का मतलब है कि प्रकाश के लिए है, जो विकास के दौरान, planktonic कोशिकाओं के साथ बादल हो जाता है के दौरान फिल्म सतह, जो, के ऊपर तरल मीडिया के माध्यम से यात्रा करनी होगी । इन चिंताओं के अलावा, यह भी करने के लिए ऑप्टिकल सेट में आवारा रोशनी को कम करने के रूप में संभव के रूप में ज्यादा महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, मशीन के इंटीरियर पर चिंतनशील सतहों को कवर करके-इस तेज नमूनों को प्राप्त करने में मदद करता है । एक संबंधित नोट पर, तेज फिल्म पैटर्न भी रोशनी पैटर्न (चित्रा 3d, चित्रा 4c) को नियंत्रित करने के लिए एक photomask का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । समस्या निवारण की आवश्यकता वाले सामान्य समस्याओं में उच्च तापमान (उदा., ३७ ° c) पर प्रोजेक्टर विश्वसनीयता समस्याएँ शामिल होती हैं, जिन्हें कम तापमान पर (उदा., 30 डिग्री सेल्सियस), साथ ही कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर की मशीनिंग से कम किया जा सकता है । ऑपरेटिंग सिस्टम अद्यतन या रात भर विकास (तालिका 1) के दौरान नीले प्रकाश फ़िल्टरिंग के कारण होता है । यह भी ध्यान दें कि, प्रोजेक्टर और मशीन के आधार पर इस्तेमाल किया मॉडल पर निर्भर करता है, यह भी संभव है कि गर्मी प्रोजेक्टर से उत्पंन एक उच्च इंटीरियर तापमान में परिणाम होगा की तुलना में मशीन सेट तापमान है, जो सही करने की आवश्यकता हो सकती है ।
अनुभाग 3 के महत्वपूर्ण हिस्सा विश्वसनीय और दोहराने बैक्टीरियल नमूने प्राप्त करने से पहले वे रोशनी से प्रेरित कर रहे हैं । इस कारण से, यह pDawn-Ag43 बैक्टीरिया की क्लोनिंग उंहें एक आगर प्लेट पर बाहर लकीर से प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है और फिर तरल संस्कृति कदम का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया प्रबुद्ध/देर घातीय विकास चरण में एक दोहराने में प्रेरित कर रहे है तरीके.
अंत में, धारा 4 के महत्वपूर्ण भाग के लिए अच्छी तरह से है, लेकिन यह भी धीरे, दूर planktonic के बाद शेष कोशिकाओं धो फिल्म पैटर्न प्रोटोकॉल; इस प्रकार, यह पंजाब के साथ कई कोमल कुल्ला कदम प्रदर्शन करने की सिफारिश की है ।
सेल5,6पैटर्न के लिए मौजूदा तकनीक की तुलना में, ऑप्टिकल pDawn के आधार पर फिल्म पैटर्न-Ag43 प्रवेश के एक काफी कम बाधा का उपयोग किया है, में है कि यह microfabrication की आवश्यकता नहीं है, साफ कमरे की सुविधा, परिसर रसायन विज्ञान, या सतह के उपचार, अभी भी उच्च संकल्प (25 माइक्रोन) आमतौर पर microfabrication तकनीक के साथ जुड़े के साथ पैटर्न के लिए सक्षम है । विधि जीन अभिव्यक्ति17को नियंत्रित करने के लिए बैक्टीरियल photolithography पर पिछले काम फैली हुई है । वर्तमान में, pDawn-Ag43 प्लाज्मिड ई. कोलाईतक ही सीमित है, के रूप में यह एक पीयूसी-प्रतिकृति के मूल आधार का उपयोग करता है, लेकिन pDawn और Ag43 दोनों अंय (ग्राम नकारात्मक) बैक्टीरियल प्रजातियों में संगत कर रहे हैं । आनुवंशिक तकनीक संभावित विभिंन बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए प्रकाश विनियमित फिल्म गठन को शुरू करने के लिए उपलब्ध है और भविष्य के अनुसंधान के लिए एक संभव दिशा का प्रतिनिधित्व करता है । तकनीक की एक और संभावित सीमा यह है कि यह कमजोर देशी फिल्म गठन (जैसे, MG1655 ई. कोलाई) के साथ उपभेदों में बढ़ती फिल्म निर्माण द्वारा काम करता है । हालांकि, मजबूत देशी फिल्म निर्माण के साथ उपभेदों रोशनी की स्थिति की परवाह किए बिना, precluding patterned pDawn-Ag43 के रूप में यहां वर्णित के रूप में प्रयोग किया जाता है । अभी तक optogenetic तकनीक अभी भी फिल्म निर्माण को विनियमित करने में लागू साबित हो सकता है । हम ध्यान दें कि अन्य संदर्भों में, इस तरह के माध्यम से ऑप्टिकल सी-di-जीएमपी मॉडुलन18के माध्यम के रूप में, फिल्म पैटर्न के वैकल्पिक तरीकों उपलब्ध हो सकता है.
कुल मिलाकर, pDawn-Ag43 आधारित पैटर्न अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए उपयुक्त होगा कि1 समारोह पर फिल्म संरचना के प्रभाव की जांच और, इसलिए, स्वरित्र नियंत्रण से फिल्म पैटर्न पर लाभ-एक विशेष रूप से प्रासंगिक हो सकता है उदाहरण के हाइलाइट करने के लिए2फिल्म में माइक्रोबियल पारिस्थितिकी का अध्ययन है । भविष्य के निर्देशों नमूनों को बनाने में शामिल है8,9 और/या संरचित जीवाणु समुदायों । इस सुलभ प्रोटोकॉल के वैकल्पिक आवेदनों में भी जैव कला19, स्पष्ट सौंदर्य क्षमता को देखते हुए, साथ ही औपचारिक और अनौपचारिक जीवन विज्ञान शिक्षा20,21,22शामिल है । एक शैक्षिक परिप्रेक्ष्य से, प्रोटोकॉल यहां वर्णित कई प्रासंगिक तकनीकों को जोड़ती है (बैक्टीरियल संस्कृति, परिवर्तन, प्रकाशिकी/optogenetics) और भी है मॉड्यूलर विस्तार (जैसे, microfluidics शामिल हैं) ।

गैर-फिल्म रोगाणुओं के सतह से जुड़े समुदाय हैं, और उनकी मजबूत संरचना के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है-समारोह युग्मन । स्थानिक ज्यामिति और फिल्म के पैटर्न समग्र समुदाय समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है (और इसके विपरीत)1। छोटे लंबाई तराजू-माइक्रोन के दसियों के आदेश पर फिल्म संरचना में शामिल-2-बनाओ स्वरित्र और एक चुनौतीपूर्ण समस्या patterning के सुविधाजनक नियंत्रण । यहां हम एक प्रोटोकॉल है कि फिल्म के लिए अनुमति देता है ठीक मनमाने ढंग से geometries, ऑप्टिकल रोशनी के आधार पर पैटर्न में प्रदर्शित करता है ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत pDawn-Ag433, एक optogenetic का निर्माण का उपयोग करता है कि ई. कोलाई बैक्टीरिया में Ag43 की अभिव्यक्ति ड्राइविंग द्वारा ऑप्टिकल रोशनी में फिल्म गठन (एक adhesin जीन सतह आसंजन और फिल्म के लिए जिंमेदार गठन)4 pDawn के नियंत्रण के तहत (एक transcriptional नियामक ऑप्टिकल रोशनी द्वारा नियंत्रित) । विधि का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है और विभिन्न सतह वातावरण, संलग्न (पारदर्शी) संस्कृति मंडलों सहित पर फिल्म पैटर्न कर सकते हैं । इस तरह की छोटी बूंद के रूप में मौजूदा सेल जमाव तरीकों की तुलना में,5 या सतह पैटर्न/उपचार6, pDawn-Ag43 microfabrication या साफ कमरे की सुविधा की आवश्यकता नहीं है और उन से परे सामग्री की आवश्यकता नहीं है एक ठेठ सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध है । यह 25 माइक्रोन के नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ पैटर्न में सक्षम है, स्वाभाविक रूप से मौजूदा2फिल्म में microcolonies के स्थानिक आयाम आ । कुल मिलाकर, इस तकनीक को, जो बैक्टीरिया समुदायों में microecology अध्ययन करने के लिए कई रास्ते खोलता है, जो फिल्म संरचना में हेरफेर करने की क्षमता प्रदान करता है7। इसके अतिरिक्त, नमूनों की फिल्म एक सुविधाजनक मंच है जिस पर उपयोगी सामग्री8,9इंजीनियर के लिए प्रदान कर सकते हैं । इस पत्र में, हम बुनियादी pDawn-Ag43 और पता संभावित संशोधनों और विधि से संबंधित समस्या निवारण का उपयोग कर फिल्म पैटर्न के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल पर चर्चा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>107742</td>
			<td>DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG1655 E. coli</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td>
			<td>CGSC #6300</td>
			<td>MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP expression plasmid</td>
			<td>iGEM biobricks</td>
			<td>J04450-pSB4K5bb</td>
			<td>Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75852</td>
			<td>Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin to get sterile LB+spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75851</td>
			<td>Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>431760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab141968</td>
			<td>Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 media salts 5X solution</td>
			<td>Bio-world</td>
			<td>705729</td>
			<td>Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet&#160;</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>212120250</td>
			<td>Dilute to 0.1% in water prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-hardening mounting media (Shandon immumount)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can also use PBS prepared from powder / tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>351146</td>
			<td>Used as biofilm culture dish for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td>For use with liquid handling with enclosed microchambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tip needle</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-23-050</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-901</td>
			<td>Use to attach culture chamber to incubator ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Sheldon Manufacturing</td>
			<td>SMI6</td>
			<td>Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable projector</td>
			<td>Ivation</td>
			<td>IV-PJ-PRO-4-1</td>
			<td>Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MSB6</td>
			<td>Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR8</td>
			<td>2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post right-angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Connects vertical and horizontal posts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Connects optical breadboard base and vertical post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td>Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 set-screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SS25E63D</td>
			<td>Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>840</td>
			<td>Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter detector</td>
			<td>Newport</td>
			<td>818-UV</td>
			<td>Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable ND filter</td>
			<td>K&#38;F Concept</td>
			<td>SKU0689</td>
			<td>Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presentation-projector software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Powerpoint</td>
			<td>Any software that allows drawing / presentation will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk&#160;</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Many photomask printer services exist for high resolution (&#62;30000DPI) film photomask printing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43

स्थानिक संरचना और पैटर्न बैक्टीरियल फिल्म में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां हम उच्च स्थानिक संकल्प में मनमाने ढंग से स्थानिक पैटर्न में संवर्धन ई. कोलाई के लिए एक सुलभ विधि प्रदर्शित करता है । तकनीक का उपयोग करता है एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग optogenetic का निर्माण-pDawn-Ag43-कि दंपति ई. कोलाई में फिल्म निर्माण नीले प्रकाश से ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए । हम विस्तार pDawn-Ag43 के साथ ई. कोलाई बदलने के लिए प्रक्रिया, आवश्यक ऑप्टिकल सेट अप की तैयारी, और संवर्धन नमूनों pDawn-Ag43 बैक्टीरिया का उपयोग कर फिल्म के लिए प्रोटोकॉल । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, 25 माइक्रोन के नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ फिल्म, microfabrication की आवश्यकता के बिना, संलग्न कक्षों सहित विभिन्न सतहों और वातावरण पर नमूनों किया जा सकता है, साफ कमरे की सुविधा, या सतह से इलाज । तकनीक सुविधाजनक और अनुप्रयोगों है कि फिल्म संरचना के प्रभाव की जांच में उपयोग के लिए उपयुक्त है, फिल्म पैटर्न पर स्वरित्र नियंत्रण प्रदान करते हैं । अधिक मोटे तौर पर, यह भी जैव भौतिक, शिक्षा में संभावित अनुप्रयोगों, और बायो आर्ट है ।

के रूप में चित्रा 4aमें देखा, pDawn-Ag43 बैक्टीरिया के लिए प्रोजेक्टर रोशनी के साथ polystyrene अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया (प्रोजेक्टर एक पोल्का डॉट पैटर्न रोशन सेट) था, क्रिस्टल के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged बैंगनी एक विपरीत एजेंट के रूप में दाग, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाल-फ्लोरोसेंट-प्रोटीन-व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग कर । फ्लोरोसेंट फिल्म के नमूने भी फोकल माइक्रोस्कोपी14 का उपयोग करने के लिए 3-डी (चित्रा 4B) में इस फिल्म की छवियों को प्राप्त करने के लिए imaged जा सकता है । चित्र 4cमें, हम एक फिल्म photomask का उपयोग करके उच्च संकल्प पैटर्न संभव वर्णन करने के लिए फिल्म के नमूने के लिए नमूनों रोशनी प्रदान करते हैं । अंत में, चित्रा 4d और 4Eमें, हम कांच और PDMS सतहों पर पैटर्न के उदाहरण प्रदर्शित करते हैं, साथ ही साथ संलग्न PDMS संस्कृति मंडलों-इन वातावरण के विभिंन प्रकार जहां pDawn-Ag43 patterning लागू किया जा सकता है वर्णन ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> चित्रा 1: pDawn-Ag43 बैक्टीरिया (प्रोटोकॉल खंड 1) की तैयारी । तैयारी pDawn-Ag43 प्रकाश में सक्षम-विनियमित-फिल्म निर्माण के जीवाणुओं को शुद्ध pDawn एक मेजबान क्लोनिंग तनाव से Ag43 प्लाज्मिड शामिल है, यह एक ई. ब्याज की कोलाई तनाव में बदलने, और लंबे समय के लिए बैक्टीरियल फ्रीजर स्टॉक बनाने भंडारण. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> चित्रा 2: एक ऑप्टिकल सेट-अप के लिए फिल्म नमूना रोशनी (प्रोटोकॉल खंड 2) की तैयारी । ऑप्टिकल सेट अप एक बैक्टीरियल मशीन के अंदर स्थित है और एक कंप्यूटर से जुड़े प्रोजेक्टर एक फिल्म का नमूना रोशन कर रहे हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> चित्रा 3: पैटर्न के लिए कल्चरल प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) । (क) रोशनी से पहले, pDawn-Ag43 बैक्टीरिया पैटर्न से पहले ऐसी है कि वे मज़बूती से उचित विकास के चरण में प्रेरित कर रहे है तैयार हैं । (ख) रातोंरात प्रबुद्ध विकास के बाद, एक पैटर्न वाली फिल्म संस्कृति डिश के तल पर मौजूद होगी, तरल मीडिया में planktonic कोशिकाओं के साथ, और कुछ आगे प्रसंस्करण के बाद, इस फिल्म इमेजिंग के लिए तैयार है । (ग) अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक विकल्प के रूप में, एक molded PDMS गुहा के रूप में इस तरह के संलग्न संस्कृति चैंबर में संस्कृतिया जा सकता है । इस मामले में, कुंद टिप सुइयों से जुड़ी सीरिंज नमूना और फ्लश तरल पदार्थ कक्ष से बाहर लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (घ) प्रोजेक्टर आधारित दीप्ति पैटर्न के लिए एक विकल्प के रूप में, पैटर्न भी टेप फिल्म photomasks द्वारा सीधे फिल्म संस्कृति मंडलों के नीचे से उत्पंन किया जा सकता है । इस मामले में, प्रोजेक्टर को पूरा क्षेत्र भर में नीली बत्ती को रोशन करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> चित्रा 4: pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए नमूनों के प्रतिनिधि परिणाम । सभी परिणाम एक MG1655 ई. कोलाई मेजबान तनाव का उपयोग कर प्राप्त किया गया । (क) pDawn-Ag43 जीवाणु प्रोजेक्टर रोशनी के साथ polystyrene अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया (प्रोजेक्टर एक पोल्का डॉट पैटर्न रोशन करने के लिए सेट किया गया था), एक के रूप में क्रिस्टल वायलेट दाग के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged इसके विपरीत एजेंट, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाल-फ्लोरोसेंट-प्रोटीन-एक्सप्रेस बैक्टीरिया का उपयोग कर । (ख) फ्लोरोसेंट फिल्म के नमूने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ छवि को प्राप्त करने के लिए कर रहे है 3-फिल्म के डी छवियां । (ग) उच्च संकल्प वाली फिल्म photomask को फिल्म के नमूने के नमूनों की दीप्ति प्रदान करने के लिए एक फ़िल्म के साथ पैटर्न दिया जा सकता है । (घ) कांच और PDMS सतहों पर फिल्मी पैटर्न हो सकते हैं । (ङ) संलग्न संस्कृति मंडलों में विचित्रता को प्रतिरूपित किया जा सकता है. यह आंकड़ा पिछले3काम से अनुकूलित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>समस्या</td>
			<td>संभावित कारणों/</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tranforming pDawn-मेजबान तनाव में Ag43-नहीं कालोनियों</td>
			<td>कम प्लाज्मिड एकाग्रता-स्पेक्ट्रोमीटर पर प्लाज्मिड एकाग्रता की जाँच करें । pDawn-Ag43 के एक ठेठ miniprep कम से १०० एनजी/μL उपज चाहिए; परिवर्तन के लिए 10-100 एनजी करने के लिए उपयोग</td>
		</tr>
<tr>
<td>/सक्षम कोशिकाओं की जांच करें: सक्षम कोशिकाओं में परिवर्तन दक्षता होनी चाहिए 10 ^ 6 cfu/µ जी एक मानक प्लाज्मिड जैसे pUC19 का उपयोग कर सत्यापित-यदि नहीं, तो सक्षम कोशिकाओं का रीमेक</td>
		</tr>
<tr>
<td>गलत (level of) एलबी पर एंटीबायोटिक प्लेट-का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ५० μg/एमएल spectinomycin चयन के लिए</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रोजेक्टर प्रदीप्ति बदल जाता है रात भर असंगत/</td>
			<td>इस तरह के रूप में समस्याग्रस्त सॉफ्टवेयर अक्षम करें: स्वचालित रात भर सॉफ्टवेयर/</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रोजेक्टर भडक सकता है-सेट मशीन के तापमान को कम करने के लिए जबकि प्रोजेक्टर चालू है (उदा. 30 ° c ३७ ° c के बजाय)-हीट सोर्स के रूप में नोट प्रोजेक्टर से ज्यादा गरम करना मशीन सेट बिंदु से परे कर सकते है</td>
		</tr>
<tr>
<td>मशीन से नमी के अनावश्यक स्रोतों निकालें, के रूप में इन प्रोजेक्टर इलेक्ट्रॉनिक्स को प्रभावित कर सकते है</td>
		</tr>
<tr>
<td>नहीं/रातोंरात रोशनी के बाद गठित फिल्म के कम स्तर, कोई planktonic कोशिकाओं के विकास या तो (यानी तरल स्पष्ट है)</td>
			<td>गलत (level of) एंटीबायोटिक-का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ५० μg/एमएल spectinomycin</td>
		</tr>
<tr>
<td>जांच सब कुछ M63 नुस्खा ठीक से जोड़ा जाता है</td>
		</tr>
<tr>
<td>नहीं/रातोंरात रोशनी के बाद गठित फिल्म के कम स्तर, केवल planktonic कोशिकाओं (यानी तरल बादल छाए हुए है)</td>
			<td>प्रकाश स्तर की जांच करें, प्रोजेक्टर ५० μW/cm ^ 2 पर ४६० एनएम तरंग दैर्ध्य में नीले प्रकाश रोशन किया जाना चाहिए</td>
		</tr>
<tr>
<td>देने की कोशिश करो बैक्टीरिया कम के लिए बढ़ने/1:1000 पौंड उपकमजोरियां कदम M63 को जोड़ने से पहले के बाद लंबे समय</td>
		</tr>
<tr>
<td>पौंड प्लेट पर restreak बैक्टीरिया, ताजा कॉलोनी से शुरू रातोंरात स्थिर चरण संस्कृति उत्पन्न करने के लिए</td>
		</tr>
<tr>
<td>सुनिश्चित करें कि प्रोजेक्टर लगातार रातोंरात काम कर रहा है-ऊपर बिंदु देखें</td>
		</tr>
<tr>
<td>फजी फिल्म पैटर्न, पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर</td>
			<td>ऑप्टिकल रोशनी प्रणाली से आवारा प्रकाश को कम करने, मशीन के इंटीरियर पर चिंतनशील सतहों को कवर</td>
		</tr>
<tr>
<td>photomask आधारित का उपयोग करने पर विचार (के रूप में प्रोजेक्टर के खिलाफ आधारित) संरचित रोशनी</td>
		</tr>
<tr>
<td>जांच प्रोजेक्टर ठीक से फिल्म संस्कृति चैंबर के नीचे की सतह पर ध्यान केंद्रित है</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: सामांय समस्या निवारण समस्याएं ।

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High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

हम एक उच्च संकल्प के साथ मनमाने ढंग से स्थानिक पैटर्न में ई कोलाई बैक्टीरियल फिल्म जमा करने के लिए एक विधि प्रदर्शित एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सतह-आसंजन के निर्माण की ऑप्टिकल उत्तेजना का उपयोग कर ।

pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए उच्च-रिज़ॉल्यूशन नमूनों वाली फिल्मी साठा

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

हमने सतह पर प्रकाश चमकाने के लिए बायोफिल्म लिथोग्राफी नामक एक विधि विकसित की है, और बैक्टीरिया जमा होता है जहां प्रकाश होता है। यह विधि हमें बायोफिल्म अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रश्न का उत्तर देने की अनुमति देगी, उदाहरण के लिए, स्थानिक संरचनाएं सामुदायिक कार्यों को कैसे प्रभावित करती हैं। इस विधि के कई फायदे हैं।उदाहरण के लिए, यह 25 माइक्रोमीटर के बहुत उच्च संकल्प पर काम करता है, इसमें सतह पूर्व-पैटर्निंग की आवश्यकता नहीं होती है, और बंद तरल उपकरणों के अंदर भी काम करता है। हालांकि यह विधि प्राकृतिक बायोफिल्म्स के संरचना-कार्य संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे अन्य विषयों जैसे बायोफिल्म इंजीनियरिंग, बायोमैटेरियल्स और बहुकोशिकीय सिंथेटिक जीवविज्ञान पर भी लागू किया जा सकता है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि बायोफिल्म पैटर्निंग से पहले ऑप्टिकल कल्चर सेटअप और बैक्टीरियल सैंपल तैयार करने के लिए प्रमुख प्रारंभिक कदम हैं।सबसे पहले, पीडौन-Ag43 प्लाज्मिड को ई.कोलाई तनाव में बदलें, और स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक एक पौंड एगर प्लेट पर प्लेट करें। एक संस्कृति ट्यूब में स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पौंड शोरबा में एक कॉलोनी टीका, और यह २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में घातीय चरण के लिए विकसित । टीका लगाने के बाद, एक क्रायो-ट्यूब में संस्कृति के एक मिलीलीटर के साथ 50% बाँझ ग्लिसेरोल के एक मिलीलीटर को मिलाकर पीडॉन-एजी43 रूपांतरित तनाव का 25% ग्लाइसरोल स्टॉक तैयार करें।स्टॉक को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। इसके बाद, एक बैक्टीरियल इनक्यूबेटर के तल पर एक पोर्टेबल प्रोजेक्टर रखकर ऑप्टिकल सेटअप तैयार करना शुरू करें, जिसमें छत पर सीधे ऊपर की ओर इशारा करते हुए एपर्चर होगा, जहां बायोफिल्म कल्चर चैंबर संलग्न किया जाएगा। इनक्यूबेटर के अंदर प्रोजेक्टर के लिए डिस्प्ले केबल के माध्यम से एक लैपटॉप कनेक्ट करें।इनक्यूबेटर की छत के लिए एक खाली डमी संस्कृति पकवान संलग्न करने के लिए टेप का उपयोग करें। फोकसिंग नॉब को बदलकर प्रोजेक्टर पर फोकस को एडजस्ट करें ताकि फोकसिंग प्लेन इनक्यूबेटर की सीलिंग से जुड़ी बायोफिल्म कल्चर डिश की निचली सतह के साथ मेल खाता हो । प्रोजेक्टर संस्कृति पकवान के तल पर एक तेज, गैर धुंधला छवि रोशन करना चाहिए ।प्रक्षेपण को अनुकूलित किए जाने के बाद डमी कल्चर डिश निकालें। लैपटॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, प्रोजेक्टर को एक पूर्ण नीली स्लाइड पेश करके अधिकतम नीली रोशनी के साथ देखने के पूरे क्षेत्र को रोशन करने के लिए निर्देशित करें। इनक्यूबेटर छत पर फोटोडिटेक्टर सिर रखकर और 460 नैनोमीटर की हल्की तरंगदैर्ध्य के लिए अंशांकित इसी बिजली मीटर पर तीव्रता को पढ़कर ऑप्टिकल पावर मीटर का उपयोग करके प्रोजेक्टर की रोशनी तीव्रता को मापें।इसके बाद, प्रोजेक्टर अपर्चर पर रखे एडजस्टेबल न्यूट्रल डेंसिटी फिल्टर का उपयोग करके रोशनी तीव्रता को समायोजित करें। बिजली मीटर द्वारा मापा रोशनी तीव्रता को समायोजित करने के लिए फिल्टर घुमाएं जब तक कि नीली रोशनी अनुमानित क्षेत्र के केंद्र में रोशनी तीव्रता 50 माइक्रोवाट प्रति सेंटीमीटर चुकता पढ़ती है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि रोशनी की तीव्रता इनक्यूबेटर छत पर तैनात कैलिब्रेटेड फोटोडिटेक्टर का उपयोग करके उचित स्तर पर सेट की गई है।यह तटस्थ घनत्व फिल्टर घूर्णन द्वारा रोशनी तीव्रता की सटीक ट्यूनिंग की अनुमति देता है। अब लैपटॉप पर प्रस्तुति प्रोजेक्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मनमाने ढंग से पैटर्न आकर्षित, और इनक्यूबेटर की छत पर इन पैटर्न प्रदर्शित, प्रोजेक्टर का उपयोग कर। रोशनी से पहले, एक पौंड-प्लस-युक्ति आगर प्लेट पर ग्लिसरोल स्टॉक से एक pDawn-Ag43 तनाव लकीर ।कॉलोनियों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। पौंड-प्लस-स्पेक शोरबा में एक आगर प्लेट से pDawn-Ag43 बैक्टीरिया की एक कॉलोनी टीका, और २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में स्थिर चरण के लिए रात भर संस्कृति हो जाना । अगले दिन, स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ एलबी शोरबा में एक से 1, 000 के अनुपात में संस्कृति को अवटिल्यूट करें।सबडिलेटेड संस्कृति को देर से घातीय, प्रारंभिक स्थिर चरण तक छह घंटे में छह घंटे और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में बढ़ने की अनुमति दें। रातोंरात संस्कृति को वापस-पतला करना और रोशनी से पहले देर से घातीय चरण में जाना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि बैक्टीरिया मज़बूती से स्वस्थ और प्रेरण पर सक्रिय हैं।इनक्यूबेशन बाद, पहले से तैयार M63 मीडिया के साथ एक से १०० के अनुपात में देर से घातीय चरण संस्कृति को ५०-माइक्रोग्राम-प्रति-मिलीलीटर स्पेक्टिनोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है । फिर, एक बायोफिल्म संस्कृति पकवान में कमजोर पड़ने का परिचय दें। चूंकि नमूने अब रोशनी के लिए तैयार हैं, इसलिए इनक्यूबेटर की छत पर संस्कृति पकवान को टेप करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पकवान के नीचे की सतह प्रोजेक्टर द्वारा नीचे से रोशनी के लिए पारदर्शी है।बायोफिल्म नमूनों की रातोंरात वृद्धि के बाद, इनक्यूबेटर से कल्चर डिश को हटा दें। डिश में बायोफिल्म बैक्टीरिया इसकी निचली सतह से जुड़े होंगे जहां इसे रोशन किया गया है, साथ ही ऊपर तरल मीडिया में फैले प्लैंक्टोनिक बैक्टीरिया भी होंगे । कल्चर डिश से लिक्विड मीडिया को हटाकर प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को त्यागें।इसके बाद, पीबीएस के साथ दो बार नमूना कुल्ला कर पीबीएस में धीरे-धीरे पाइपिंग करके शेष प्लैंक्टोनिक कोशिकाओं को हटाने के लिए, आकांक्षा के बाद। यदि कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटी रूप से टैग किया जाता है, तो सीधे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नमूनों की छवि। जैसा कि यहां देखा गया है, प्रोजेक्टर रोशनी के साथ पॉलीस्टीरिन वेल प्लेटों में नमूनों वाले बायोफिल्म्स उत्पन्न करने के लिए पीडॉन-एजी 43 बैक्टीरिया का उपयोग किया गया था।बायोफिल्म्स को क्रिस्टल वायलेट धुंधला या वैकल्पिक रूप से फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का उपयोग करने पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। फ्लोरोसेंट बायोफिल्म नमूनों को 3 डी में बायोफिल्म की छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके भी इमेज किया जा सकता है। बायोफिल्म नमूने को पैटर्न वाली रोशनी प्रदान करने के लिए फिल्म फोटोमास्क का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन पैटर्निंग संभव है।ग्लास और पीडीएमएस सतहों पर पैटर्निंग के उदाहरण, साथ ही संलग्न पीडीएमएस संस्कृति कक्षों को यहां दिखाया गया है और विभिन्न प्रकार के वातावरणों को चित्रित किया गया है जहां पीडॉन-एजी 43 पैटर्निंग लागू की जा सकती है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पहले पीडीएएन-एजी 43 को आपके ब्याज के तनाव में बदलना महत्वपूर्ण है, फिर अपने प्रोजेक्टर को ठीक से ध्यान केंद्रित करना और जांचना, और अंत में रोशनी के लिए अपने बैक्टीरिया को तैयार करने के लिए आवश्यक संस्कृति और बैक-कमजोर पड़ने के चरणों का पालन करें। इस विधि के बाद, अन्य तकनीकों को तैनात किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, विभिन्न संस्कृति स्थितियों के तहत बायोफिल्म दीर्घकालिक निगरानी।इस तरह, हम समझ सकते हैं कि बायोफिल्म संरचना उसके कार्य को कैसे प्रभावित करती है। यह तकनीक व्यापक रूप से लागू होगी, उदाहरण के लिए, सिंथेटिक जीव विज्ञान और सामग्री अनुसंधान के लिए, विभिन्न अनुप्रयोगों के प्रति बायोफिल्म्स को इंजीनियर करने के लिए।

Research

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