Name: high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00
Duration: 7 min 47 s
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著者は、彼らの役に立つ提案と、共焦点顕微鏡へのアクセス Spormann ラボ + ガラス、, 金、(名) Cira、a. Choksi、s. ラジャンと * キーをありがちましょう。さらに、著者は奨学金、国立衛生研究所 (R21 AI 139941) およびアメリカの癌協会 (RSG-14-177-01) スタンフォード バイオ X ボウズとレベル pgs 社からサポートを認めます。

1. pDawn Ag43 菌株の調製
<ol><li>興味 (図 1) の大腸菌の菌株に pDawn Ag43 を変換します。<ol>
<li>流体培養基 LB (ポンド + 仕様) の 50 μ g/mL スペクチノマイシン (37 ° C 〜 250 rpm での振動インキュベーター) で一晩培養管の添加でひずみを接種 pDawn Ag43 プラスミド (プラスミド リポジトリから入手可能) をホストしているクローン株を成長します。その後、精製 pDawn Ag43 プラスミド10を収穫するのに miniprep キットを使用します。</li>
		<li>パターンに関心の大腸菌の菌株を選択します。これまで、pDawn Ag43 MG16553と BW25113 で動作するように検証されました。</li>
		<li>主務を生成する確立されたプロトコルを使用して (例えば、化学的に有能な11または electrocompetent12) 選ばれた株大腸菌の菌株 (例えばMG1655)。</li>
		<li>PDawn Ag43 プラスミドを有能な細菌11,12LB + スペック寒天 1 h 回復とプレートの順に変換します。37 ° C で一晩培養するコロニーを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ストア pDawn Ag43 変換系統です。<ol>
<li>LB から pDawn Ag43 の単一コロニーを接種 + LB に寒天培地を仕様 + 培養管のスープを仕様し、指数段階 (OD600 ~0.4 - 0.8) に (~ 250 rpm、37 ° C) で振動のインキュベーターで成長します。</li>
		<li>冷凍庫ストック 25% グリセロールを取得するクライオ チューブで 50% 滅菌グリセリン 1 mL で文化の 1 mL を混合することによって長期-80 ° c pDawn Ag43 変形ひずみを格納する在庫を準備します。-80 ° C のフリーザーでこれを保管します。</li>
		<li>12 pDawn Ag43 からひずみの変換し、変換プロセス11を繰り返します追加プラスミド (例えば、蛍光レポーターのプラスミッド) を変換する、有能なセル11,を作成する必要がある場合,必要に応じて追加のプラスミッドのため12 。 注: 場合エレクトロポレーション8を使用して、それは複数のプラスミド (pDawn Ag43 を含む) 同時に cotransform することが可能ただし、同時変換は推奨されません化学変換メソッドを使用して pDawn Ag43 の大きいサイズ (> 10 kB) の変換効率を削減手段として。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 照明細菌のプロジェクターの光のセットアップの準備
<ol><li>ケーブル、フィッティング、細菌の定温器内部の機能ことができる携帯用のプロジェクターを渡すため非透明な壁と穴細菌インキュベーターを取得し、プレゼンテーション投影 (のテーブルを参照ソフトウェア搭載ノート パソコン材料)。プロジェクターとインキュベーターを選ぶときは、プロジェクターの最小限の焦点距離がインキュベーターの室内高さ未満を確認します。</li>
	<li>上昇、バイオ フィルム培養室がある天井に接続されている (図 2) 直接絞り指摘で、下部にインキュベーター内プロジェクターを配置します。</li>
	<li>修正と光のブレッド ボード基本セットアップを構築することによって場所にプロジェクターが垂直の柱に接続されている順番に接続されている水平ポストにいるネジをプロジェクター (図 2)。プロジェクター/利用可能なパーツによって、この設定を変更できることに注意してください。最終的には、重要な要件は、上向き絞りでプロジェクターをしっかりと固定、インキュベーターの下部です。</li>
	<li>インキュベーター内プロジェクター、ノート パソコンを介してディスプレイ ケーブル (例えばHDMI) に接続します。</li>
	<li>場合表面-特に天井-インキュベーターの内部が反射 (例えば、金属研磨面)、反射を最小限に抑えるための暗いマット表面でそれらをカバーします。</li>
	<li>インキュベーターの天井に空 'ダミー' ディッシュをアタッチするのにには、テープを使用します。なお、プロジェクターに培養皿; をアタッチする複数の許容可能な方法があるので照明が発生した培養室の透明な底面がなく覆われているを確認します。</li>
	<li>焦点の平面がインキュベーター (図 2) の天井に接続されているバイオ フィルム培養皿を (例えば、ウェル プレート) の下面と一致しているので、中心のノブを回して、プロジェクターの焦点を調整します。プロジェクターは、培養皿の底に鋭い、非ぼやけたイメージを照らす必要があります。削除 'ダミー' 培養皿の投影に最適化されています。</li>
	<li>最大の青い照明と全視野を照らすプロジェクターを直接ノート パソコン ソフトウェアを使用して (例えばRGB = [0, 0, 255]) 完全青のスライドを提示することによって。</li>
	<li>インキュベーター天井で光検出器ヘッドを配置し対応するパワーメータ校正波長 460 nm の強度を読んで光パワーメータを使用してプロジェクターの照度を測定します。接続、使用される特定の電源メーターの受光素子を校正の指示に従います。<ol>
<li>周囲の光を減らす (例えば部屋のライトをオフに、光源から離れた場所にインキュベーター) 照明の強度の測定を行う前に可能な限り。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロジェクター絞り設置調節可能な中性密度フィルターを使用して照度を調整します。青色光の投影領域の中心の照度が 50 μ W/cm2を読み取るまで、電力計で測定照度を調整するフィルターを回転させます。 注: ソフトウェアの端に下青の RGB 値を使用してください。、照明の明るさを調整することが可能ですが、照らされた対の間システムの光のコントラストを最大化することの利点は青の RGB 値を最大化するにはフィルターを使用してください。暗い領域。</li>
	<li>ノート パソコンでプレゼンテーション/プロジェクター ソフトウェアを使用して、任意のパターンを描画し、インキュベーター、プロジェクターを使用して天井にこれらのパターンを表示します。 注: 最大の青い照明とバイオ フィルム形成領域を描画する (例えばRGB = [0, 0, 255])、ない照明非バイオ フィルム形成領域 (例えばRGB = [0, 0, 0])。</li>
</ol>3. 養殖パターン バイオ フィルム
<ol><li>照明、前に、彼らは確実に照明 (図 3 a) の後半の急激な成長段階で誘導されるグリセロール冷凍庫ストックから始まって pDawn Ag43 細菌を準備します。<ol>
<li>LB + スペック寒天にグリセロール ストックから pDawn Ag43 ひずみを連勝します。成長のコロニーを許可する一晩 (37 ° C)。 注: 照明文化ステップまでここからセルは暗闇の中で可能な限り滞在を確保-アンビエント照明 (例えばsubdilution の) で短時間は許容されます。</li>
		<li>PDawn Ag43 菌で LB 寒天培地プレートからコロニーを接種 + スープを仕様し、一晩固定相へ (~ 16 h の 37 ° C 〜 250 rpm での振動インキュベーター) 文化を育てます。</li>
		<li>LB で縮尺の比率で文化を subdilute + スープの仕様 (例えば、新鮮な LB + スペックの 1 mL に一晩かけて培養の 1 μ L を追加)。</li>
		<li>後半指数/初期固定相 (OD 〜 1.0、揺れのインキュベーターで 〜 6 h 〜 250 rpm、37 ° C) まで成長する subdiluted 文化を許可します。</li>
		<li>成長する文化を待っている間と 1 x M63 塩、1 mM MgSO4、グルコース 0.2%、0.1% カザミノ酸、水で 50 μ g/mL スペクチノマイシン M63 メディアの準備 (構成部分が滅菌を確認)。</li>
		<li>M63 培地 50 μ g/mL スペクチノマイシンと 1: 100 の比率で遅い指数段階の文化を subdilute します。バイオ培養皿に希釈を導入し、(例えば、ピペットのウェル プレートに希釈サンプル)。 注: 使用されている培養皿に依存するこの 1: 100 subdilution に必要なボリューム (例えば6 もポリスチレンのウェル プレート [非--培養処理]、1 つのサンプルを使用して場合 M63 + 仕様、2 ml として文化の 20 μ L を追加すること必要になります、6 ウェル プレートの標準的なよくボリューム、〜 2 mL) です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルは、照明する準備が整いましたと皿の底の表面が透明である照明の下からプロジェクターで確保するインキュベーターの天井に培養皿をテープします。 注: それはインキュベーターの天井が迷光を最小限に抑えるため、反射ではないことを確認することが重要です。浮遊照明も減らせる培養皿として黒壁板を使用して、これは厳密には必要ではありませんが、このような板を使用して、底面が透明を確認します。</li>
	<li>インキュベーターの一夜 (37 ° C でない揺れで 16 h) の文化にバイオ フィルムを許可します。注一部のプロジェクターが高温で信頼性が低くなっています。場合場合は、低温 (例えば、30 ° C)、文化はインキュベーション時間は大腸菌の菌株によって増加する必要があります心に留めておきます。</li>
</ol>4. イメージング バイオ フィルムのパターン
<ol><li>バイオ フィルムのサンプルの一晩の成長後インキュベーターから培養皿を削除します。上記の液体培地における分散性の浮遊細菌と同様に、それに照らされたが、その下の表面に付着したバイオ フィルム形成細菌料理だろう</li>
	<li>浮遊性細胞を培養皿を (例えば、優しくピペットで吸引によって) から液体媒体を取除くことによって破棄します。</li>
	<li>リンス サンプル 2 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション、PBS で軽くピペッティングして残りの浮遊性細胞 (図 3 b) を削除すると x の後に吸引します。</li>
	<li>セルはタグ蛍光、蛍光顕微鏡13 (例えば、広視野13、3次元共焦点14等)を使用してサンプルを直接撮像します。 注: 蛍光バイオ フィルムも保存できる自己強化マウント媒体を使用しています。バイオ フィルムのサンプルにメディアをマウントの一滴を適用を下に、任意の気泡をキャプチャしないように世話ガラス基板でそれをカバー、一晩前にイメージングを強化することができます。</li>
	<li>使用細菌細胞が蛍光でタグ付けられていない場合は、イメージ作成前クリスタル バイオレット染色法15 (図 3 b) バイオ フィルム コントラストを高めるためを適用します。</li>
</ol>5. プロトコル変更/選択肢
<ol><li>さまざまな面に pDawn Ag43 細菌を育てます。<ol>
<li>細菌サンプル/照明、添加前にウェル プレートにガラスやポリ ジメチル シロキサン (PDMS) クーポン (例えば、coverslips または PDMS の薄いストリップ) を入れて、ガラスのパターン pDawn ag43 バイオ フィルムに前とに、同じプロトコルに従うとPDMS。</li>
	</ol>
</li>
	<li>透明、囲まれた培養室内 pDawn Ag43 細菌を育てます。<ol>
<li>PDMS の文化商工会議所金型を生成します。<ol>
<li>基本的な文化室ハード、長方形のプリズムを平らな面 (プリズムは金型は一度培養室として機能する PDMS の空洞になります) にアタッチすることにより金型を生成します。ソフト ・ リソグラフィー16を使用してより複雑な文化商工会議所金型を作製できることに注意してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>PDMS を金型に注ぐと、それを治すために PDMS キャビティをキャスト (詳細なソフト ・ リソグラフィー プロトコル ゼウスの科学教育データベース16を参照してください)。</li>
		<li>硬化後任意の過剰の PDMS をトリム、キャビティ/文化室に入口/出口チャネルをパンチし、表面間の空洞を残して平らな表面に PDMS をしっかりと押すことによって (例えばガラス/ポリスチレン) 平らな表面にキャビティを接着し、バイオ培養室として PDMS 天井。 メモ: プラズマ治療16に基づいてより恒久的な接着も使えるがチップがない再利用できるし。</li>
		<li>文化商工会議所/リンス PBS バッファー (図 3) に細菌のサンプルを導入する (ピペット) ではなく鈍い先端針と注射器を使用する前に、文化プロトコルに従ってください。<ol>
<li>一時的に結合共振器を用いた、空洞が基になるガラス/ポリスチレン表面からアンボンドならないようにする、商工会議所の出入り口に液体をプルするだけ否定的な圧力を使用します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDawn Ag43 バクテリア フィルム フォトマスクを使用して構造化照明用。<ol>
<li>映画フォトマスク プリンター/印刷サービスと互換性のある CAD ソフトウェアを使用してバイオ フィルム パターンを設計します。フォトマスク フィルム デザインは、バイオ フィルムは印刷するつもりの地域ではっきりとブラック/不透明を他の場所でする必要があります。完了したら、フォトマスク ファイルをプリンター/印刷サービスに送信し、物理的なフォトマスクの戻りを待ちます。</li>
		<li>最大の青い照明と全視野を照らすプロジェクターを指示する (例えばRGB = [0, 0, 255]) ノート パソコンのソフトウェアを使用して。</li>
		<li>大きいフィルム フォトマスクや夜間照明 (図 3 D) の細菌のサンプルを導入する前に皿バイオ フィルム文化の底に直接テープからの関心の領域を切り取ります。バイオ フィルムを前に文化、イメージ作成前培養後、フォトマスクを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

バイオ フィルム構造制御を可能にする研究ツールの観点から、我々 は pDawn Ag43 光遺伝学的構造を使用して細菌のバイオ フィルムをパターニングのための簡単に使用できるプロトコルを提案しました。この手法は、様々 な表面の環境、25 μ m 以下の空間分解能での囲まれた室を含む大腸菌バイオ フィルムを光学的作成できます。
4 つの主要なセクションにこのプロトコルを分けることが全体的にみて、: (4) 後の照明 (3) 前照射細菌の成長のステップと文化セットアップのハードウェア (2) 光の準備 (1) pDawn Ag43 菌の準備洗口液およびイメージ投射。
セクション 1 の重要な部分は、関心の大腸菌にプラスミド pDawn Ag43 の成功した変換です。これは高品質精製プラスミドの分離と変換のための質の高い有能なセルの生成によって促進される (表 1, トラブルシューティング)。
セクション 2 の重要な部分は、プロジェクターの設定の最適化は 460 nm 波長で 50 μ W/cm2に照度が調整され、バイオ フィルム サンプルの高さでプロジェクターを適切に集中されています。このプロトコルでは、プロジェクター ライトを照らす下から、上向きバイオ フィルム サンプルに向かって倒立照明セットアップ述べる注意してください。この設定の利点は、光だけバイオ フィルム形成表面に到達する前に培養皿の底を通って旅行する必要があることです。照明光は、成長の過程で取得曇り浮遊性細胞であるバイオ フィルム表面上の液体媒体を旅するだろうことを意味の上から。これらの懸念に加えてもインキュベーターの内部の反射面を覆うことによってたとえば、可能な限りの光のセットアップにおける迷光を最小限に抑えるために重要です-このシャープなパターン化されたバイオ フィルムを得ることができます。関連のノートでは、シャープのバイオ フィルムのパターンも照明パターン (図 3 D図 4) を制御するフォトマスクを使用して取得できます。一般的な問題トラブルシューティングを必要とするにはコンピューターのソフトウェアだけでなく、高温 (例えば、37 ° C)、低温 (例えば、30 ° C) でのバイオ フィルムの成長の孵化によって最小限に抑えることができる、プロジェクターの信頼性の問題が含まれています。オペレーティング システムの更新、または一晩成長 (表 1) 中のフィルタ リング青色光が発生します。また、プロジェクターとインキュベーター モデル使用によってそれも可能ですがプロジェクターから発生する熱は、インキュベーターの設定温度は、修正する必要がありますよりも高い室内温度となります注意してくださいすることが重要です。
セクション 3 の重要な部分が彼らが照明によって引き起こされる前に、信頼性と再現性のある細菌のサンプルを取得します。このため、寒天版のそれらをストリー キングし、液体培養の手順を使用して細菌が反復可能なの後半の急激な成長フェーズで [照明誘導になっていることを確認する pDawn Ag43 細菌のクローン性コロニーを取得お勧め方法。
最後に、セクション 4 の重要な部分は徹底的に、でもやさしくも、プロトコルをパターニング バイオ フィルム後に残る浮遊性細胞を洗い流すことです。したがって、PBS で複数の穏やかな洗浄手順を実行することをお勧めします。
細胞パターニング5,の既存の手法と比較して6パターンに基づいて pDawn Ag43 光バイオ フィルムは、適度に低い障壁を使用して、エントリの微細加工、クリーン ルーム設備、コンプレックスは必要ありません。化学、または表面前処理、まだはまだ通常微細加工技術に関連付けられた高分解能 (25 μ m) をパターン化することができます。メソッドは、細菌のフォトリソグラフィ17遺伝子発現を制御するための前の仕事を拡張します。現在、pUC ベース原産、レプリケーションを使用して、pDawn と Ag43 は、両方他の (陰性) の細菌種の互換性、pDawn Ag43 プラスミドは大腸菌に制限されます。遺伝学的手法は、潜在的光規制のバイオ フィルム形成細菌種に導入することがあります、今後の研究の方向を表します。技術のもう一つの潜在的な制限は、それが弱いネイティブ バイオ フィルム形成 (例えば、MG1655エシェリヒア属大腸菌) と株のバイオ フィルム形成を増やすことによって動作することです。ただし、強力なネイティブのバイオ フィルム形成菌は、ここ; pDawn Ag43 のように使用してパターン化されたバイオ フィルム形成を排除、照明条件に関係なくバイオ フィルム フォームを持っています。まだ光遺伝学的技術はまだバイオ フィルム形成の調節に適用されるかもしれない。我々 は、他のコンテキストでバイオ フィルム形成の方法可能性がありますを使用することを介して光 c ・ ディ ・ GMP 変調18など注意してください。
全体的にみて、pDawn Ag43 ベース パターンに関数1のバイオ フィルムの構造の影響を調べるし、そのため、バイオ フィルムの形成を可変制御の恩恵をアプリケーションで使用するための適切ななります-特に関連強調する例はバイオ2の微生物生態学的研究です。今後の方向性、パターン化された生体材料8,9および/または構造化された細菌群集です。このアクセス プロトコルの代替アプリケーションには、バイオ アート19、形式的な非公式の生命科学教育20,21,22と同様、明確な審美的な可能性を与えられるも含まれます。教育の観点からここで説明されているプロトコル (細菌培養、変換、光学/オプトジェネティクス) 多くの関連技術を結合する、またによって拡張可能な (例えば、マイクロ流体が含まれます)。

バイオ フィルムは微生物の表面に接続されたコミュニティ、彼らの強力な構造機能結合のよく知られています。空間幾何学とバイオ フィルムの形成 (その逆) 全体的なコミュニティの機能の重要な役割1を再生します。小さな長さスケール バイオ フィルム構造に関与する-数十ミクロン2-バイオ フィルムの挑戦的な問題をパターンの可変で便利なコントロールを作る。ここで光の照明に基づくパターンで任意形状正確にするバイオ フィルムは、プロトコルを示す.
ここで提示されたプロトコルを使用して、pDawn Ag433Ag43 の発現を駆動することによって光の照明にエシェリヒア属大腸菌細菌のバイオ フィルム形成をカップル光遺伝学的構築 (、付着性遺伝子表面付着とバイオ フィルム形成) pDawn4 (光照射による制御転写因子) の制御の下で。メソッドを使用すると便利ですし、ことができます様々 なパターンのバイオ フィルム表面囲まれた (透明) 文化区域を含む環境。液滴方式蒸着5または表面プレパターニング/トリートメント6など既存のセル蒸着方法と比較して pDawn Ag43 微細加工やクリーン ルームの設備を必要としない、以外の材料を必要としません。一般的な微生物学実験室が使用できます。それは既存の自然の microcolonies の空間次元に近づいて、25 μ m 以下の空間分解能でパターン化することができるバイオ フィルム2。全体的にみて、この手法は、細菌群集の7で microecology を研究する多くの道を開き、バイオ フィルム構造を操作する機能を提供します。また、パターン化されたバイオ フィルムは有用バイオマテリアル8,9をエンジニア リングする時に便利なプラットフォームを提供すること。本稿では、pDawn Ag43 を使用してバイオ フィルムを形成するために必要な基本的なプロトコルを話し合うし、潜在的な変更やメソッドに関連のトラブルシューティングに対応します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>107742</td>
			<td>DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG1655 E. coli</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td>
			<td>CGSC #6300</td>
			<td>MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP expression plasmid</td>
			<td>iGEM biobricks</td>
			<td>J04450-pSB4K5bb</td>
			<td>Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75852</td>
			<td>Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin to get sterile LB+spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75851</td>
			<td>Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>431760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab141968</td>
			<td>Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 media salts 5X solution</td>
			<td>Bio-world</td>
			<td>705729</td>
			<td>Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet&#160;</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>212120250</td>
			<td>Dilute to 0.1% in water prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-hardening mounting media (Shandon immumount)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can also use PBS prepared from powder / tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>351146</td>
			<td>Used as biofilm culture dish for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td>For use with liquid handling with enclosed microchambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tip needle</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-23-050</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-901</td>
			<td>Use to attach culture chamber to incubator ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Sheldon Manufacturing</td>
			<td>SMI6</td>
			<td>Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable projector</td>
			<td>Ivation</td>
			<td>IV-PJ-PRO-4-1</td>
			<td>Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MSB6</td>
			<td>Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR8</td>
			<td>2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post right-angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Connects vertical and horizontal posts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Connects optical breadboard base and vertical post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td>Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 set-screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SS25E63D</td>
			<td>Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>840</td>
			<td>Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter detector</td>
			<td>Newport</td>
			<td>818-UV</td>
			<td>Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable ND filter</td>
			<td>K&#38;F Concept</td>
			<td>SKU0689</td>
			<td>Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presentation-projector software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Powerpoint</td>
			<td>Any software that allows drawing / presentation will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk&#160;</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Many photomask printer services exist for high resolution (&#62;30000DPI) film photomask printing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43

空間構造とパターン形成細菌バイオ フィルムの重要な役割を果たします。ここでは、高空間分解能で任意の空間パターンにバイオ フィルム大腸菌を培養するためのアクセス可能なメソッドを示します。遺伝的に符号化された光遺伝学的構築を用いる-pDawn Ag43-青い光による光刺激にエシェリヒア属大腸菌のバイオ フィルム形成をカップルを。必要な光のセットアップ、およびプロトコル pDawn Ag43 細菌を用いたパターンのバイオ フィルムを養殖の準備 pDawn-Ag43 いるエシェリヒア属大腸菌を変形させるためのプロセスを詳しく説明します。このプロトコルを使用して、25 μ m 以下の空間分解能でバイオ フィルムは様々 な表面や微細加工、クリーン ルーム設備、または表面の前処理を必要とせず囲まれた室を含む環境に作成できます。技術はバイオ フィルム形成を可変制御を提供するバイオ フィルムの構造の影響を調べるアプリケーションでの使用に適した便利。広く、生体材料、教育、およびバイオ技術への応用可能性もあります。

図 4 aに見られるように pDawn Ag43 細菌がバイオ フィルム プロジェクター照明 (水玉模様を照らすプロジェクターが設置)、ポリスチレンのウェル プレートで模様を生成に使用された結晶を明視野顕微鏡を通してイメージを作成造影剤、および赤色蛍光タンパク質発現細菌を使用して蛍光顕微鏡として染色。蛍光バイオ フィルムのサンプルは、3-d 効果 (図 4 b) バイオ フィルムのイメージを取得する共焦点顕微鏡14を使用してもイメージできます。図 4、バイオ フィルムのサンプル パターン照明を提供するためにフィルムのフォトマスクを使用して可能な高解像度のパターンを示す.最後に、図 4と4 eで囲まれた PDMS 文化区域と同様、ガラスと PDMS 表面上へのパターニング事例を紹介-これらは pDawn Ag43 パターンを適用できる環境のさまざまな種類を説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> 図 1: pDawn Ag43 菌 (プロトコル セクション 1) 準備します。ひずみをクローニング、関心の大腸菌の菌株に変換と細菌の冷凍庫の在庫を作成するホストから pDawn Ag43 のプラスミッドの浄化を含む pDawn Ag43 光制御型のバイオ フィルム形成細菌を準備する長期ストレージ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> 図 2: バイオ フィルム サンプル照明 (プロトコル セクション 2) の光のセットアップの準備。光のセットアップは、細菌の定温器に収めし、バイオ フィルム サンプルを照明コンピューター接続のプロジェクターで構成されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> 図 3: 文化のバイオ フィルム (プロトコル セクション 3) のパターニングのためのプロトコル。(A) 前に照明、pDawn Ag43 細菌を彼らは確実に適切な成長段階で誘導されるようなことをパターニングする前に用意しています。(B) 夜間照明の成長後、パターン化されたバイオ フィルムは、液体培地における浮遊性細胞と一緒に培養皿の底に出現してさらに処理後、バイオ イメージングのため準備ができて。(C) プレートをよく代わりに、バイオ フィルムまでの成形 PDMS 空洞などの囲まれた文化区域培養します。この場合、サンプルを紹介し、商工会議所から液体をフラッシュする鈍い先端針に付すスポイトを使用できます。(D) プロジェクター ベース照明パターンの代わりに、パターンはまたバイオ フィルム文化室の下部に直接フィルム フォトマスクをテーピングによって生成されます。この場合、プロジェクターを完全なフィールド間で青い光を照らすにセットアップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> 図 4: pDawn Ag43 を使用してパターン化バイオ フィルムの代表の結果。ホスト、MG1655エシェリヒア属大腸菌の菌株を用いたすべての結果が得られました。(A) pDawn Ag43 細菌はバイオ フィルム プロジェクター照明 (水玉模様を照らすプロジェクターが設置)、ポリスチレンのウェル プレートで模様を生成に使用されたクリスタル バイオレット染色し、明視野顕微鏡を通してイメージを作成します。造影剤と赤色蛍光タンパク質発現細菌を使用して蛍光顕微鏡。(B) 蛍光バイオ フィルム サンプルは、共焦点顕微鏡、バイオ フィルムの 3次元画像を得るために作成されます。(C) 高解像度バイオ フィルムはバイオ フィルムのサンプル パターン照明を提供するためにフィルムのフォトマスクを作成できます。(D) バイオ フィルムは、ガラス、PDMS 表面に基づいて作成できます。(E) バイオ フィルムは、囲まれた文化区域で作成できます。この図は、前の仕事3から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>問題</td>
			<td>潜在的な原因/ソリューション</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホストひずみのないコロニーに変換 pDawn Ag43</td>
			<td>プラスミド濃度を低 - 分光器のプラスミド濃度を確認してください。PDawn Ag43 の典型的な miniprep の少なくとも 100 ng/μ L; を得られるはず変換のための 10 100 ng 使ってください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>有能なセルのチェック/リメイク: 有能なセル必要があります変換効率を少なくとも 10 ^6 cfu/μ g 標準プラスミド pUC19 - いない場合は、リメイクの有能なセルなどを使用して検証</td>
		</tr>
<tr>
<td>間違って (レベルの) 抗生物質 LB 寒天培地プレート - 選択の 50 μ g/mL スペクチノマイシンを使用するを確認</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロジェクター照明オン オフ/一貫性のない一夜</td>
			<td>など、問題のあるソフトウェアを無効にする: 自動ソフトウェア/OS 更新を一晩、夜間青色光フィルター</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロジェクターが過熱する可能性があります - セット プロジェクター中低温インキュベーターがオン (37 ° C ではなくの 30 ° C など) - メモ プロジェクター熱源がセット ポイントを超えてインキュベーターを過熱することができます、</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロジェクター電子に影響を与える可能性がありますこれらのインキュベーターから湿度の不要なソースを削除します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>なし/低レベルのバイオ フィルムの形成か夜間照明、浮遊性細胞成長後 (すなわち液体は明らか)</td>
			<td>間違って (レベルの) 抗生物質 - 50 μ g/mL スペクチノマイシンを使用することを確認</td>
		</tr>
<tr>
<td>すべてが正しく M63 レシピに追加されますを確認してください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>夜間照明、浮遊性細胞のみ後になし/低レベルのバイオ フィルムの形成 (すなわち液体は曇り)</td>
			<td>チェック光レベル、プロジェクターは明白ライトブルー 50 μ W/cm ^2 波長 460 nm で</td>
		</tr>
<tr>
<td>M63 を追加する前に LB subdilution 手順 1: 1000 の後の短い/長い時間成長細菌をさせてください。</td>
		</tr>
<tr>
<td>LB プレートに細菌を restreak、一晩固定相文化を生成する新鮮な植民地から開始</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロジェクターは一貫して一晩働いている - を参照してくださいことを確認上記のポイント</td>
		</tr>
<tr>
<td>ファジィ バイオ フィルム パターン、背景ノイズの高レベル</td>
			<td>光照明システムからの迷光を減らす、インキュベーターの内部に反射表面を覆う</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォトマスク ベース (プロジェクター ベース) ではなく構造化された照明の使用を検討します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロジェクターはバイオ フィルム培養室の底面に正しく焦点を当てて確認してください。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 一般的な問題のトラブルシューティングします。

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43 at JoVE.com

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

遺伝的コード化の面接着構造の光刺激による高解像度の任意の空間分布のエシェリヒア属大腸菌細菌バイオ フィルムを堆積させるための方法を紹介します。

高解像度使用してバイオ フィルム成膜のパターンの pDawn Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

表面に光を当てるバイオフィルムリソグラフィーという手法を開発し、その場所に細菌が蓄積します。この方法は、空間構造がコミュニティ機能にどのような影響を与えるかなど、バイオフィルム研究における重要な質問に答えることを可能にします。この方法には多くの利点があります。例えば、それは25マイクロメートルの非常に高い決断で働き、表面の前パターニングを必要とせず、また閉鎖された流体装置の内部で働く。この方法は、天然バイオフィルムの構造機能関係に関する洞察を提供することができますが、バイオフィルム工学、バイオマテリアル、多細胞合成生物学などの他の分野にも応用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、バイオフィルムパターニングの前に光学培養のセットアップと細菌サンプルを準備するための重要な予備的なステップがあるので重要です。まず、pDawn-Ag43プラスミドを目的の大腸菌株に変換し、スペチノマイシンを補充したLB寒天プレートにプレートします。培養管内のスペクトルマイシンを含むLBスープに単一コロニーを接種し、250rpmおよび摂氏37度の揺れインキュベーターで指数相に成長させる。接種後、50%無菌グリセロールの1ミリリットルを1ミリリットルの培養物と共にクライオチューブに混合してpDawn-Ag43形質転換株の25%グリセロールストックを調製する。在庫をマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。次に、開口が天井を真上に向け、バイオフィルム培養チャンバーが取り付けられる細菌インキュベーターの底部にポータブルプロジェクターを配置して、光学セットアップの準備を始めます。ディスプレイケーブルでラップトップをインキュベーター内のプロジェクタに接続します。テープを使用して、空のダミー培養皿をインキュベーターの天井に取り付けます。焦点を合わせる平面がインキュベーターの天井に取り付けられたバイオフィルム培養皿の底面と一致するように焦点を合わせると、プロジェクタの焦点を調整します。プロジェクターは、文化皿の底に鋭く、ぼやけていない画像を照らす必要があります。投影が最適化されたら、ダミーの培養皿を取り除きます。ラップトップソフトウェアを使用して、プロジェクターにフルブルーのスライドを提示することで、最大の青色の照明で完全視野を照らすように指示します。光検出器ヘッドをインキュベーター天井に配置し、460ナノメートルの光波長にキャリブレーションされた対応するパワーメーターの強度を読み取ることによって、光パワーメーターを使用してプロジェクタの照明強度を測定します。次に、プロジェクター絞りに配置された調整可能な中立密度フィルタを使用して、照明強度を調整します。フィルターを回転させて、青色光投影領域の中央の照明強度が 50 マイクロワット/メートル平方になるまで、パワーメーターで測定した照明強度を調整します。インキュベーター天井に位置するキャリブレーションされた光検出器を使用して、照明強度が適切なレベルに設定されていることを確認することが重要です。これは中立密度フィルターを回すことによって照明の強度の正確な調整を可能にする。今、ラップトップ上のプレゼンテーションプロジェクターソフトウェアを使用して任意のパターンを描き、プロジェクターを使用して、インキュベーターの天井にこれらのパターンを表示します。照明の前に、グリセロールストックからLBプラス仕様の寒天板にpDawn-Ag43株をストリークします。コロニーは摂氏37度で一晩成長することができます。LBプラススペックブロスの寒天プレートからpDawn-Ag43細菌のコロニーを接種し、250rpmと摂氏37度で振盪インキュベーターで一晩定在相に培養を成長させます。翌日、スペクトルを用いたLBブロスで1~1,000の割合で培養を薄く希釈する。250 rpm で 6 時間、摂氏 37 度で、後期指数、早期定常相まで、希釈後の培養液を揺れ培養します。夜間培養をバック希釈し、照明前に後期指数位相に成長することが重要です。これにより、細菌は確実に健康で、誘導時に活性を確保します。インキュベーションに続いて、前に調製したM63培地に50マイクログラム/ミリリットルスペチノマイシンを加えた1〜100の比率で後期指数相培養を希釈する。次に、バイオフィルム培養皿に希釈を導入する。サンプルが照明の準備が整ったので、培養皿をインキュベーターの天井にテープで貼り付け、皿の底面がプロジェクタによって下から照光されるようにします。バイオフィルムサンプルの一晩の成長後、培養器から培養皿を取り除く。この皿は、照明された下面にバイオフィルム細菌が取り付けられ、上記の液体培地に分散したプランクトニック細菌が付着する。培養皿から液体培地を取り除いてプランクトニック細胞を捨てます。次に、PBSでサンプルを2回リンスし、PBS中で軽くピペット処理して残りのプランクトン細胞を除去し、続いて吸引を行う。細胞が蛍光的にタグ付けされている場合は、蛍光顕微鏡を使用してサンプルを直接画像化します。ここで見られるように、pDawn-Ag43細菌は、プロジェクタ照明を備えたポリスチレンウェルプレートにパターン化されたバイオフィルムを生成するために使用された。バイオフィルムは、蛍光細菌を使用する場合は、結晶紫色染色を使用して、または蛍光顕微鏡を介して別の方法で可視化することができます。蛍光バイオフィルムサンプルは、共焦点顕微鏡を用いて、バイオフィルムの画像を3Dで得ることもできます。高解像パターン化は、フィルムフォトマスクを用いて、バイオフィルムサンプルにパターン化された照明を提供することで可能である。ガラスおよびPDMS表面上のパターニングの例は、封入されたPDMS培養チャンバーと同様に、ここに示され、pDawn-Ag43パターニングを適用できる異なるタイプの環境を示す。この手順を試みる間、最初にpDawn-Ag43を目的の株に変換し、プロジェクターに適切に焦点を合わせてキャリブレーションし、最後に必要な培養とバック希釈手順に従って細菌を照明に備えることを重要です。この方法に従って、他の技術、例えば、異なる培養条件下でのバイオフィルムの長期モニタリングを展開することができる。そうすれば、バイオフィルム構造がその機能にどのような影響を与えるかを理解することができます。この技術は、合成生物学や材料研究など、バイオフィルムを様々な用途に向けて設計するために広く応用できる。

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