Name: high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43 at JoVE.com

Os autores agradecer D. vidro, H. Kim, s. Cira, r. Choksi, S. Ribeiro e B. chaves por suas sugestões úteis e o laboratório de Spormann para o acesso ao seu microscópio confocal. Além disso, os autores reconhecem o apoio de Stanford Bio-X Bowes e NSERC PGS bolsas, o Instituto Nacional de saúde (R21-AI-139941) e a American Cancer Society (RSG-14-177-01).

1. preparação do pDawn-Ag43 estirpes bacterianas
<ol><li>PDawn-Ag43 transforme uma cepa de Escherichia coli de interesse (Figura 1).<ol>
<li>Cresce uma estirpe de clonagem hospedagem pDawn-Ag43 plasmídeo (obtido a partir de um repositório de plasmídeo) por inoculação da estirpe em caldo LB suplementado com 50 espectinomicina μg/mL (LB + spec) em um tubo de cultura (durante a noite em uma incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C). Em seguida, use um kit miniprep para colher o de plasmídeo purificado pDawn-Ag4310.</li>
		<li>Escolha uma cepa de Escherichia coli de interesse a ser modelado. Até então, pDawn-Ag43 foi verificada para trabalhar em MG16553 e BW25113.</li>
		<li>Usar um protocolo estabelecido para gerar competentes(por exemplo, quimicamente competentes11 ou electrocompetent12) as existências dos escolhidos estirpe de Escherichia coli (por exemplo, MG1655).</li>
		<li>PDawn-Ag43 plasmídeo transforme as bactérias competentes11,12, seguido de recuperação de 1 h e placa no LB + placas de ágar espec. Permitir colônias a crescer durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Loja do pDawn-Ag43 transformado cepas.<ol>
<li>Inocular uma única colônia de pDawn-Ag43 de um LB + placa de ágar de especificações em LB + spec caldo em um tubo de cultura e cultivá-la em uma incubadora de agitação (a ~ 250 rpm, 37 ° C) para fase exponencial (OD600 ~0.4 - 0.8).</li>
		<li>Prepare ações para armazenar a tensão pDawn-Ag43 transformada a-80 ° C a longo prazo através da mistura de 1 mL de cultura com 1 mL de glicerol a 50% estéril em um tubo de congelação para obter um 25% de glicerol estoque do congelador. Guarde isto em um freezer-80 ° C.</li>
		<li>Se plasmídeos adicionais (por exemplo, plasmídeos repórter fluorescentes) precisam ser transformado, criar células competentes11,12 da pDawn-Ag43 transformado estirpe e repita o processo de transformação11 , 12 para plasmídeos adicionais conforme necessário. Nota: Se utilizar a eletroporação8, é possível cotransform plasmídeos múltiplas (incluindo pDawn-Ag43) simultaneamente; no entanto, uma transformação simultânea não é recomendável usando métodos de transformação química, como o tamanho grande (> 10 kB), de pDawn-Ag43 significa eficiência de transformação é reduzida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação do projetor óptico afinação para bactérias iluminantes
<ol><li>Obter uma incubadora bacteriana com paredes transparentes e um furo para a passagem de cabos, um projetor portátil capaz de montagem e o funcionamento dentro da incubadora bacteriana, e um laptop equipado com software de apresentação-projeção (ver tabela de de Materiais). Ao escolher o projetor e a incubadora, certifique-se de que a distância mínima de foco do projetor é menor que a altura interior da incubadora.</li>
	<li>Coloque o projetor dentro da incubadora na parte inferior, com a abertura apontando diretamente para cima, no teto, onde a câmara de cultura do biofilme é anexado (Figura 2).</li>
	<li>Fix o projetor no local construindo uma armadilha com uma base de experimentação ótica conectado a um poste vertical, por sua vez conectado a um poste horizontal que parafusos para o projetor (Figura 2). Observe que essa configuração pode ser modificada dependendo as peças projetor/disponível. Em última análise, o requisito essencial é que o projetor é solidamente fixado na parte inferior da incubadora, com a abertura apontando para cima.</li>
	<li>Conecte o notebook através do cabo do monitor (por exemplo, HDMI) o projetor dentro da incubadora.</li>
	<li>Se as superfícies — especialmente o teto — do interior da incubadora são reflexivo (por exemplo, superfície de metal polido), cubra-os com superfícies fosca escuras para minimizar os reflexos.</li>
	<li>Use fita para anexar um prato vazio 'manequim' cultura no tecto da incubadora. Observe que, como com o projetor, existem várias maneiras aceitáveis para anexar um prato de cultura; Certifique-se de que a superfície de fundo transparente da câmara de cultura, onde ocorre a iluminação, não é coberta.</li>
	<li>Ajuste o foco no projetor girando o botão de focalização para que o avião de focagem coincide com a superfície inferior do prato biofilme cultura (por exemplo, uma placa bem) anexada ao teto da incubadora (Figura 2). O projetor deve acender-se uma imagem não-embaçada afiada para o fundo do prato a cultura. Retire o prato de cultura 'manequim' uma vez que a projeção foi otimizada.</li>
	<li>Utilizando o software portátil, direto do projetor para iluminar o campo de visão completo com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]), apresentando um slide completo azul.</li>
	<li>Medir a intensidade de iluminação do projetor usando um medidor de potência óptica colocando a fotodetector de cabeça para o teto da incubadora e lendo a intensidade sobre o medidor de energia correspondente calibrado para luz de comprimento de onda 460 nm. Siga as instruções na conexão e calibrando o fotodetector para o medidor de energia específico usado.<ol>
<li>Reduzir a luz ambiente (por exemplo, desligar as luzes do quarto, ou coloque a incubadora, longe de fontes de luz) o máximo possível antes de fazer a iluminação medições de intensidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a intensidade de iluminação usando um filtro de densidade neutra ajustável colocado na abertura do projetor. Gire o filtro para ajustar a intensidade de iluminação medida pelo medidor de energia, até que a intensidade de iluminação no centro da região projetada da luz azul lê 50 μW/cm2. Nota: Enquanto é possível ajustar a intensidade de iluminação usando valores mais baixos de RGB azuis do lado do software, usando um filtro enquanto maximizar o valor RGB azul tem a vantagem de maximizar o contraste ótico do sistema entre iluminado vs . regiões escuras.</li>
	<li>Desenhar padrões arbitrários usando o software de apresentação/projetor no laptop e exibir esses padrões no teto da incubadora, utilizando o projetor. Nota: As regiões formadoras de biofilme devem ser desenhadas com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]), regiões não-formação de biofilme com nenhuma iluminação (por exemplo, RGB = [0, 0, 0]).</li>
</ol>3. cultivo de biofilmes estampados
<ol><li>Antes da iluminação, prepare as bactérias pDawn-Ag43, a partir do estoque de congelador de glicerol, para que eles são induzidos confiantemente em fase de crescimento exponencial tardia para iluminação (Figura 3A).<ol>
<li>Marcam uma estirpe de pDawn-Ag43 do estoque de glicerol em LB + placas de ágar especs. Permitir colônias a crescer durante a noite (37 ° C). Nota: Daqui até a etapa de cultura de iluminação, garantir que as células fiquem no escuro, tanto quanto possível — breves períodos de iluminação ambiente (por exemplo, para subdilution) são aceitáveis.</li>
		<li>Inocular uma colônia de bactérias pDawn-Ag43 de uma placa de ágar em LB + caldo de especificações e crescer a cultura durante a noite para uma fase estacionária (em uma incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C, para ~ 16 h).</li>
		<li>Subdilute a cultura em uma relação de 1:1,000 com LB + caldo de especificações (por exemplo, adicionar 1 mL de LB fresco + especificação 1 μL da cultura durante a noite).</li>
		<li>Permitir que a cultura subdiluted a crescer até o final da fase exponencial/início estacionária (OD ~ 1.0, ~ 6 h numa incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C).</li>
		<li>Enquanto espera para a cultura a crescer, preparar a M63 mídia com sais x M63 1, 1mm MgSO4, 0,2% de glicose, ácidos de casamino de 0,1% e espectinomicina 50 μg/mL em água (certifique-se de partes constituintes são estéreis).</li>
		<li>Subdilute a cultura de fase tardia-exponencial na proporção de 1: 100 com mídia M63 suplementada com 50 espectinomicina μg/mL. Em seguida, introduzir a diluição em um prato de cultura de biofilme (p. ex., pipetar amostra diluída em um prato bem). Nota: Os volumes necessários para esta subdilution de 1: 100 dependem do prato de cultura sendo usado (por exemplo, se utilizar uma placa bem 6-poços em poliestireno [não-tecido-cultura tratada], uma única amostra exigiria adicionar 20 μL da cultura a 2 mL de M63 + especificação, como o volume bem padrão de uma placa de 6 é de ~ 2 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Como as amostras agora estão prontas para a iluminação, fita o prato de cultura para o teto da incubadora, garantindo que a superfície no fundo do prato é transparente para a iluminação de baixo pelo projector. Nota: É importante garantir que o teto da incubadora não é reflexivo, para minimizar a iluminação de rua. Iluminação de rua também pode ser reduzida usando placas de parede preto como pratos de cultura, embora isso não seja estritamente necessário — se usando tais placas, certifique-se de superfície de fundo é transparente.</li>
	<li>Permitir que os biofilmes à cultura na incubadora durante a noite (16 h com nenhum tremor, a 37 ° C). Observe que alguns projetores tornam-se menos confiáveis em temperaturas mais altas. Se for esse o caso, a cultura a temperaturas mais baixas (por exemplo, 30 ° C), mantendo em mente que o tempo de incubação pode ser necessário aumentar, dependendo da estirpe de Escherichia coli .</li>
</ol>4. imagem padronizada de biofilmes
<ol><li>Após o crescimento noturno das amostras de biofilme, retire o prato de cultura da incubadora. O prato terá bactérias do biofilme anexadas a sua superfície inferior onde tem sido iluminada, bem como bactérias planctônicas dispersadas na mídia líquida acima.</li>
	<li>Descarte as células planctônicas, removendo o meio líquido do prato da cultura (por exemplo, aspirando suavemente com uma pipeta).</li>
	<li>Enxágue a amostra 2 x com uma solução de tampão fosfato salino (PBS) para remover as células restantes planctônicas (Figura 3B) pipetando suavemente em PBS, seguido de aspiração.</li>
	<li>Se as células são marcadas fluorescentemente, diretamente da imagem as amostras usando fluorescência, microscopia13 (por exemplo, campo largo13, 3-d confocal14, etc.). Nota: Biofilmes fluorescentes podem também ser preservados usando um meio de montagem a Self-hardening. Aplique uma gota de mídia para uma amostra de biofilme de montagem, cubra-o com uma lamela de vidro, tomando cuidado para não capturar quaisquer bolhas por baixo e deixe-o endurecer durante a noite antes de imagem.</li>
	<li>Se as células bacterianas utilizadas não são marcadas fluorescentemente, aplica o cristal violeta mancha técnica15 (Figura 3B) para realçar o contraste de biofilme antes da imagem latente.</li>
</ol>5. protocolo modificações/alternativas
<ol><li>Crescem as bactérias pDawn-Ag43 em diferentes superfícies.<ol>
<li>Colocar o vidro ou cupons (PDMS) de poli-dimetil-siloxano (por exemplo, lamelas ou tiras finas de PDMS) em placas bem antes da adição de uma amostra bacteriana/iluminação e seguem o mesmo protocolo como antes para o padrão pDawn-ag43 biofilmes em vidro e PDMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescem as bactérias pDawn-Ag43 dentro de uma câmara de cultura transparente, fechado.<ol>
<li>Gere um molde de câmara de cultura para PDMS.<ol>
<li>Para uma câmara de cultura básica, gere mofo, anexando um prisma retangular, difícil para uma superfície plana (o prisma vai se tornar uma cavidade no PDMS que serve como a câmara de cultura, uma vez que o molde é convertido). Observe que mais intrincados moldes de câmara de cultura podem ser fabricados usando uma litografia macia16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conversão de uma cavidade PDMS derramando PDMS no molde e permitindo-lhe curar (para um protocolo detalhado litografia macia, consulte banco de dados de educação ciência16 do JoVE).</li>
		<li>Após a cura, apare qualquer excesso PDMS, socar canais de entrada/saída na câmara de cavidade/cultura e vínculo da cavidade de uma superfície plana (por exemplo, vidro/poliestireno) pressionando firmemente o PDMS para a superfície plana, deixando a cavidade entre a superfície e o teto de PDMS como a câmara de cultura do biofilme. Nota: Ligação permanente com base no tratamento de plasma16 também pode ser usada, mas os chips não será reutilizáveis.</li>
		<li>Segui o protocolo de cultura como antes, usando uma seringa com agulhas de ponta romba (em vez de uma pipeta) para introduzir a amostra bacteriana a câmara de cultura/enxaguar com tampão PBS (Figura 3).<ol>
<li>Se usando uma cavidade temporariamente ligada, use pressão negativa apenas para puxar o líquido em/fora da câmara, para garantir que a cavidade não se torne unbonded da superfície de vidro/poliestireno subjacente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescem as bactérias pDawn-Ag43 usando uma filme Fotomáscara para iluminação estruturada.<ol>
<li>Desenha um padrão de biofilme usando software CAD compatível com o serviço de impressora/print Fotomáscara um filme. O projeto de filme de Fotomáscara deve ser claros em regiões onde o biofilme destina-se a ser impresso e preto/opaco em outro lugar. Quando completo, enviar o arquivo Fotomáscara para o serviço de impressora/impressão e aguardam o retorno da Fotomáscara físico.</li>
		<li>Instruir o projetor para iluminar um campo de visão completo com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]) usando o software portátil.</li>
		<li>Corte uma região de interesse do maior filme de Fotomáscara e fita diretamente para o fundo de cultura de biofilme prato antes de introduzir a amostra bacteriana para iluminação durante a noite (Figura 3D). Cultura de biofilmes como antes e remover a Fotomáscara após cultivo, antes da imagem latente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Tendo em conta a necessidade de ferramentas de pesquisa que permitem o controle de estrutura de biofilme, apresentamos um protocolo fácil de usar para padronização de biofilmes bacterianos usando a construção de optogenetic de pDawn-Ag43. Com esta técnica, biofilmes de e. coli podem ser opticamente estampados em vários ambientes de superfície, incluindo câmaras fechadas, com uma resolução espacial abaixo 25 μm.
Em geral, este protocolo pode ser dividido em quatro seções principais: (1) a preparação das bactérias pDawn-Ag43, (2) a preparação de óptico e cultura set-up hardware, (3) as etapas de crescimento bacteriano pre-iluminação e (4) a pós-iluminação lavagens e imagem.
A parte crítica da secção 1 é a transformação bem sucedida do plasmídeo pDawn-Ag43 para a cepa de Escherichia coli de interesse. Isto é facilitado, isolando o plasmídeo purificado de alta qualidade e gerando células competentes de alta qualidade para a transformação (tabela 1, solução de problemas).
A parte crítica da secção 2 é a otimização da configuração do projetor, para que a intensidade de iluminação é ajustada para 50 μW/cm2 a 460 nm de comprimento de onda, e o projetor é focado corretamente na altura de amostra biofilme. Note que este protocolo, descrevemos uma afinação de iluminação invertida onde o projetor brilha a luz de baixo, para cima em direção a amostra de biofilme. A vantagem deste set-up é que a luz só precisa viajar no fundo do prato a cultura antes de alcançar a superfície de formação de biofilme. Iluminação acima significa que a luz teria que viajar através da mídia líquida acima da superfície do biofilme, que, no decurso do crescimento, fica nublada com células planctônicas. Para além destas preocupações, também é importante minimizar a luz perdida na configuração óptica tanto quanto possível, por exemplo, por encobrir superfícies reflexivas no interior da incubadora — o que ajuda a obter mais nítidas biofilmes estampados. Em uma nota relacionada, padrões de biofilme mais nítidos também podem ser obtidos usando uma Fotomáscara para controlar a padronização de iluminação (Figura 3D, Figura 4). Problemas comuns que exigem solução de problemas incluem problemas de confiabilidade do projetor em temperaturas mais altas (por exemplo, 37 ° C), que podem ser minimizados pela incubando o crescimento do biofilme em temperaturas mais baixas (por exemplo, 30 ° C), bem como software de computador que faz com que as atualizações de sistema operacional ou luz azul filtragem durante o crescimento durante a noite (tabela 1). Também é importante observar que, dependendo do modelo do projetor e incubadora usado, também é possível que o calor gerado do projetor irá resultar em uma temperatura interior mais elevada do que a temperatura da incubadora, que pode precisar de ser corrigido.
A parte crítica da secção 3 está obtendo amostras bacterianas confiáveis e reproduzíveis antes que eles são induzidos pela iluminação. Por este motivo, é aconselhável obter clonais colônias de bactérias pDawn-Ag43 listando-os para fora em uma placa de ágar e usando as etapas de cultura líquida para garantir que as bactérias são iluminados/induzido em fase de crescimento exponencial tardia em um repetível maneira.
Finalmente, a parte crítica da seção 4 é completamente, mas também com cuidado, lavar as células planctônicas remanescentes após o biofilme padronização do protocolo; assim, recomenda-se executar várias etapas de lavagem suave com PBS.
Em comparação com as técnicas existentes para celular padronização5,6, biofilme óptico padronização com base em pDawn-Ag43 tem uma razoavelmente baixa barreira de entrada para usar, em que não exige microfabrication, instalações de salas limpas, complexo química, ou pré-tratamento da superfície, ainda é capaz fazer desenhos com a alta resolução (25 μm), normalmente associada a técnicas de microfabrication. O método estende-se a trabalhos anteriores sobre bacteriano fotolitos para controlar a expressão de gene17. Atualmente, pDawn-Ag43 plasmídeo é limitado a e. coli, como ele usa uma origem de replicação do pUC-baseado, mas pDawn e Ag43 são compatíveis em outras espécies de bactérias (Gram-negativas). Técnicas genéticas estão disponíveis para potencialmente apresentando formação de biofilmes de luz-regulado para diferentes espécies bacterianas e representa uma possível orientação para futuras pesquisas. Outra limitação potencial da técnica é que ele funciona, aumentando a formação de biofilme em cepas com formação de biofilmes nativo fraco (por exemplo, MG1655 e. coli). No entanto, cepas com formação de biofilmes nativa forte têm forma de biofilmes, independentemente das condições de iluminação, impedindo a formação de biofilme modelado usando pDawn-Ag43 conforme descrito aqui; ainda optogenetic técnicas ainda podem provar aplicáveis na regulação da formação de biofilme. Notamos que em outros contextos, métodos alternativos de padronização de biofilme podem estar disponíveis, tais como a via óptica c-di-GMP modulação18.
Em geral, a padronização com base pDawn-Ag43 será apropriada para uso em aplicativos que investigar o efeito da estrutura do biofilme na função1 e, portanto, poderia beneficiar sintonizável controle sobre padronização de biofilme — um particularmente relevante exemplo de destaque é o estudo da ecologia microbiana em biofilmes2. Sentidos futuros incluem fazer biomateriais modelado8,9 e/ou comunidades bacterianas estruturadas. Aplicações alternativas do presente protocolo acessível também incluem bio-art19, dado o potencial estético claro, bem como2221,20,do ensino formal e informal da ciência da vida. Do ponto de vista educacional, o protocolo descrito aqui combina muitas técnicas relevantes (cultura bacteriana, transformação, óptica/optogenetics) e também modular expansível (por exemplo, incluem microfluídica).

Biofilmes são comunidades conectado à superfície de micróbios e são conhecidos para seu acoplamento forte estrutura-função. Geometria espacial e padronização de biofilmes desempenham um papel importante na função de comunidade global (e vice-versa)1. O comprimento de pequeno escalas envolvido na estrutura do biofilme — da ordem de dezenas de mícrons2— tornar ajustável e conveniente controle de biofilme padronização um problema desafiador. Aqui vamos demonstrar um protocolo que permite a biofilmes ser precisamente modeladas em geometrias arbitrárias, com base na óptica iluminação.
O protocolo apresentado aqui usa pDawn-Ag433, uma construção de optogenetic que casais formação de biofilme em bactéria e. coli a óptica iluminação dirigindo a expressão de Ag43 (um adesina gene responsável pela adesão de superfície e biofilme Formação) sob o controle do pDawn4 (um regulador transcricional controlado pela óptica iluminação). O método é conveniente de usar e podem padrão biofilmes em vários ambientes, incluindo câmaras de cultura (transparente) fechados de superfície. Em comparação com métodos de deposição celular existentes, tais como depoimento baseado em gota5 ou superfície prepatterning de tratamento6, pDawn-Ag43 não requer instalações microfabrication ou sala limpa e não exige materiais além daqueles disponível para um laboratório de microbiologia típico. É capaz de fazer desenhos com uma resolução espacial abaixo 25 μm, aproximando-se as dimensões espaciais da microcolonies naturalmente existentes biofilmes2. Em geral, esta técnica proporciona a capacidade de manipular a estrutura do biofilme, que em seguida abre muitas avenidas para estudar microecology em comunidades bacterianas7. Além disso, modelados biofilmes podem fornecer uma plataforma conveniente sobre a qual engenheiro biomateriais útil8,9. Neste artigo, discutimos o protocolo básico necessário para padronização de biofilmes usando pDawn-Ag43 e abordar potenciais modificações e solução de problemas relacionados ao método.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>107742</td>
			<td>DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG1655 E. coli</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td>
			<td>CGSC #6300</td>
			<td>MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP expression plasmid</td>
			<td>iGEM biobricks</td>
			<td>J04450-pSB4K5bb</td>
			<td>Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75852</td>
			<td>Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin to get sterile LB+spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75851</td>
			<td>Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>431760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab141968</td>
			<td>Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 media salts 5X solution</td>
			<td>Bio-world</td>
			<td>705729</td>
			<td>Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet&#160;</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>212120250</td>
			<td>Dilute to 0.1% in water prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-hardening mounting media (Shandon immumount)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can also use PBS prepared from powder / tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>351146</td>
			<td>Used as biofilm culture dish for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td>For use with liquid handling with enclosed microchambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tip needle</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-23-050</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-901</td>
			<td>Use to attach culture chamber to incubator ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Sheldon Manufacturing</td>
			<td>SMI6</td>
			<td>Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable projector</td>
			<td>Ivation</td>
			<td>IV-PJ-PRO-4-1</td>
			<td>Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MSB6</td>
			<td>Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR8</td>
			<td>2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post right-angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Connects vertical and horizontal posts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Connects optical breadboard base and vertical post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td>Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 set-screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SS25E63D</td>
			<td>Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>840</td>
			<td>Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter detector</td>
			<td>Newport</td>
			<td>818-UV</td>
			<td>Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable ND filter</td>
			<td>K&#38;F Concept</td>
			<td>SKU0689</td>
			<td>Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presentation-projector software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Powerpoint</td>
			<td>Any software that allows drawing / presentation will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk&#160;</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Many photomask printer services exist for high resolution (&#62;30000DPI) film photomask printing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43

A padronização e a estrutura espacial desempenham um papel importante em biofilmes bacterianos. Aqui vamos demonstrar um método acessível para cultivo de biofilmes de Escherichia coli em arbitrários padrões espaciais em alta resolução espacial. A técnica utiliza uma construção geneticamente codificado optogenetic — pDawn-Ag43 — que casais formação de biofilme em e. coli à estimulação óptica por luz azul. Detalhamos o processo para transformar e. coli com pDawn-Ag43, preparando a montagem óptica necessária e o protocolo para cultivo de biofilmes modelados usando bactérias pDawn-Ag43. Usando este protocolo, biofilmes com uma resolução espacial abaixo 25 μm podem ser modelados em várias superfícies e ambientes, incluindo câmaras fechadas, sem a necessidade de microfabrication, instalações de salas limpas ou pré-tratamento da superfície. A técnica é conveniente e apropriado para uso em aplicativos que investigar o efeito da estrutura do biofilme, fornecendo controle ajustável sobre padronização de biofilme. Mais amplamente, ele também tem aplicações potenciais em biomateriais, educação e bio-art.

Como pode ser visto na Figura 4A, pDawn-Ag43 bactérias foram usadas para gerar biofilmes estampados em poliestireno placas bem com iluminação do projetor (o projetor foi definido para iluminar um padrão de bolinhas), fotografada por meio de microscopia de brightfield com cristal mancha de violeta como um agente de contraste e microscopia de fluorescência usando vermelho-fluorescente-proteína-expressando as bactérias. Amostras de biofilme fluorescentes também podem ser fotografadas usando microscopia confocal14 para obter imagens do biofilme em 3-d (Figura 4B). Na Figura 4, ilustramos a padronização de alta resolução possível usando uma filme Fotomáscara para fornecer a iluminação padronizada para a amostra de biofilme. Finalmente, na Figura 4 e 4E, demonstramos exemplos de padronização no vidro e superfícies PDMS, bem como câmaras de cultura PDMS fechadas — estas ilustram os diferentes tipos de ambientes onde a padronização pDawn-Ag43 pode ser aplicada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> Figura 1: preparação de bactérias pDawn-Ag43 (protocolo seção 1). PDawn-Ag43 bactérias capazes de formação de biofilmes de luz-regulada a preparar envolve purificação do plasmídeo pDawn-Ag43 de um host de clonagem estirpe, transformando-o em uma cepa de Escherichia coli de interesse e criar estoque bacteriana do congelador para a longo prazo armazenamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> Figura 2: preparação de um set-up ótico para a iluminação de amostra de biofilme (protocolo secção 2). O set-up ótico está alojado dentro de uma incubadora bacteriana e consiste de um projetor de computador conectado iluminando uma amostra de biofilme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> Figura 3: cultura de protocolo para a padronização de biofilmes (protocolo seção 3). (A) antes da iluminação, pDawn-Ag43 bactérias são preparadas antes da padronização de tal forma que eles são confiantemente induzidos na fase de crescimento adequado. (B) depois de uma noite iluminada de crescimento, um biofilme estampado estarão presente no fundo do prato a cultura, juntamente com células planctônicas na mídia líquida, e após algum processamento adicional, o biofilme está pronto para a imagem latente. (C) como uma alternativa para placas, biofilmes podem ser cultivadas em câmaras de cultura fechado como uma cavidade PDMS moldada. Neste caso, seringas anexadas para agulhas de ponta romba podem ser usadas para introduzir a amostra e liberar líquidos fora da câmara. (D) como uma alternativa para os padrões de iluminação baseada em projetor, padrões também podem ser gerados por gravar filme máscaras diretamente para o fundo das câmaras de cultura de biofilme. Neste caso, o projetor deve ser definido para iluminar a luz azul em todo o campo completo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> Figura 4: resultados representativos de biofilmes modelados usando pDawn-Ag43. Todos os resultados foram obtidos usando uma estirpe de acolhimento MG1655 Escherichia coli . (A) pDawn-Ag43 bactérias foram usadas para gerar biofilmes estampados em poliestireno placas bem com iluminação do projetor (o projetor foi definido para iluminar um padrão de bolinhas), fotografada por meio de microscopia de brightfield com mancha de violeta cristal como um Agente de contraste e microscopia de fluorescência usando vermelho-fluorescente-proteína-expressando as bactérias. (B) amostras de biofilme fluorescentes são fotografadas com microscopia confocal para obter imagens em 3D do biofilme. (C) de alta resolução biofilmes podem ser estampados com uma filme Fotomáscara para fornecer a iluminação padronizada para a amostra de biofilme. (D) biofilmes podem ser modelados em vidro e superfícies PDMS. (E) biofilmes podem ser estampados em câmaras de cultura fechado. Esta figura foi adaptada da anterior trabalho3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Possíveis causas/soluções</td>
		</tr>
<tr>
<td>Transformando pDawn-Ag43 para cepa de acolhimento - sem colônias</td>
			<td>Baixa concentração de plasmídeo - Verificar a concentração do plasmídeo no espectrômetro. Um típico miniprep de pDawn-Ag43 deve render pelo menos 100 ng/μL; usam até 10-100 ng para transformação</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cheque/remake células competentes: células competentes devem ter a eficiência de transformação pelo menos 10 ^ 6 cfu / µ g verificada usando um plasmídeo padrão como pUC19 - se não, as células competentes remake</td>
		</tr>
<tr>
<td>O antibiótico errado (nível de) na placa de ágar LB - certifique-se de usar 50 espectinomicina μg/mL para a seleção</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iluminação projetor vira fora de / inconsistentes durante a noite</td>
			<td>Desabilite o software problemático tais como: atualização de software/OS noturno automático, filtro de luz azul durante a noite</td>
		</tr>
<tr>
<td>Projetor pode ser superaquecimento - conjunto incubadora à temperatura mais baixa, enquanto o projetor está ligada (por exemplo, 30 ° C em vez de 37 ° C) - projetor nota como fonte de calor pode superaquecer incubadora além do ponto de ajuste</td>
		</tr>
<tr>
<td>Remova fontes desnecessárias de humidade da incubadora, como estas podem afetar eletrônica de projetor</td>
		</tr>
<tr>
<td>N/baixo níveis de biofilme formaram após a iluminação durante a noite, não há crescimento de células planctônicas também (ou seja, o líquido é claro)</td>
			<td>O antibiótico errado (nível de) - Certifique-se de usar 50 espectinomicina μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verifique tudo é adicionado à receita M63 corretamente</td>
		</tr>
<tr>
<td>N/baixo níveis de biofilme formaram após a iluminação durante a noite, apenas células planctônicas (ou seja, líquido está nublado)</td>
			<td>Verificar luz nível, projetor deve ser iluminando luz azul em 50 μW/cm ^ 2 no comprimento de onda de 460 nm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tente deixar as bactérias a crescer por mais curto/longo tempo depois de 1: 1000 LB passo de subdilution antes de adicionar a M63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Restreak bactérias na placa LB, começar do colônia fresca para gerar cultura fase estacionária durante a noite</td>
		</tr>
<tr>
<td>Certifique-se de projetor é trabalhar consistentemente durante a noite - ver ponto acima</td>
		</tr>
<tr>
<td>Padrões de biofilme difusa, altos níveis de ruído de fundo</td>
			<td>Reduzir a luz do sistema óptico de iluminação, cobrir superfícies reflexivas no interior da incubadora</td>
		</tr>
<tr>
<td>Considere o uso de iluminação estruturada baseada em Fotomáscara (em oposição a base do projetor)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verificar projetor corretamente é focado na superfície inferior da câmara de cultura do biofilme</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Comum de solução de problemas.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43 at JoVE.com

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Vamos demonstrar um método para depositar o biofilme bacteriano de Escherichia coli em padrões espaciais arbitrários com uma alta resolução usando estimulação óptica de uma construção de superfície-adesão geneticamente codificada.

PDawn-Ag43 modelado usando de deposição de biofilme em alta resolução

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Desenvolvemos um método chamado litografia biofilm para iluminar uma superfície, e as bactérias se acumulam onde a luz está. Esse método nos permitirá responder a perguntas-chave na pesquisa de biofilmes, por exemplo, como as estruturas espaciais afetam as funções da comunidade. Há muitas vantagens nesse método.Por exemplo, ele funciona com uma resolução muito alta de 25 micrômetros, não requer pré-padronização superficial, e também funciona dentro de dispositivos fluidos fechados. Embora este método possa fornecer insights sobre a relação estrutura-função de biofilmes naturais, ele também pode ser aplicado a outras disciplinas, como engenharia de biofilmes, biomateriais e biologia sintética multicelular. A demonstração visual deste método é fundamental, pois existem etapas preliminares fundamentais para preparar a configuração da cultura óptica e a amostra bacteriana antes da padronização do biofilme.Primeiro, transforme o plasmídeo pDawn-Ag43 na cepa de interesse E.coli, e coloque uma placa de ágar LB complementada com espectincina. Inocular uma única colônia em caldo LB com espectincina em um tubo de cultura, e cultivá-la em fase exponencial em uma incubadora de agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. Após a inoculação, prepare um estoque de 25% de glicerol da cepa transformada pDawn-Ag43 misturando um mililitro de glicerol 50% estéril com um mililitro de cultura em um crio-tubo.Armazene o estoque em um freezer Celsius de menos 80 graus. Em seguida, comece a preparar a configuração óptica colocando um projetor portátil na parte inferior de uma incubadora bacteriana com a abertura apontando diretamente para cima no teto, onde a câmara de cultura de biofilm será anexada. Conecte um laptop através do cabo de exibição ao projetor dentro da incubadora.Use fita adesiva para anexar um prato de cultura manequim vazio ao teto da incubadora. Ajuste o foco no projetor girando o botão de foco para que o plano focalizante coincida com a superfície inferior do prato de cultura de biofilme preso ao teto da incubadora. O projetor deve iluminar uma imagem nítida e não embaçada na parte inferior do prato de cultura.Remova o prato de cultura manequim uma vez que a projeção tenha sido otimizada. Usando o software do laptop, direcione o projetor para iluminar todo o campo de visão com máxima iluminação azul, apresentando um slide azul completo. Meça a intensidade de iluminação do projetor usando um medidor óptico de potência colocando a cabeça fotodetector no teto da incubadora e lendo a intensidade no medidor de energia correspondente calibrado para comprimento de onda leve de 460 nanômetros.Em seguida, ajuste a intensidade de iluminação usando um filtro de densidade neutra ajustável colocado na abertura do projetor. Gire o filtro para ajustar a intensidade de iluminação medida pelo medidor de energia até que a intensidade de iluminação no centro da região projetada de luz azul leia 50 microwatts por centímetro ao quadrado. É importante garantir que a intensidade de iluminação seja definida em um nível adequado usando o fotodetector calibrado posicionado no teto da incubadora.Isso permite um ajuste preciso da intensidade de iluminação girando o filtro de densidade neutra. Agora desenhe padrões arbitrários usando o software do projetor de apresentação no laptop, e exiba esses padrões no teto da incubadora, usando o projetor. Antes da iluminação, coloque uma cepa pDawn-Ag43 do estoque de glicerol em uma placa de ágar LB-plus-spec.Permita que as colônias cresçam durante a noite a 37 graus Celsius. Inocular uma colônia de bactérias pDawn-Ag43 a partir de uma placa de ágar em caldo LB-plus-spec, e crescer a cultura durante a noite para a fase estacionária em uma incubadora de agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. No dia seguinte, subdilute a cultura em uma proporção de um a 1.000 em caldo LB com espectincina.Permita que a cultura subdiluda cresça em uma incubadora de agitação a seis horas a 250 rpm e 37 graus Celsius até o final da fase estacionária, no início. É importante diluir a cultura da noite para o dia e crescer até a fase exponencial tardia antes da iluminação. Isso garante que as bactérias sejam confiáveis e ativas após a indução.Após a incubação, subdilute a cultura de fase exponencial tardia em uma proporção de 1 a 100 com mídia M63 previamente preparada complementada com 50 microgramas por mililitros de espectincina. Em seguida, introduzir a diluição em um prato de cultura biofilm. Como as amostras estão agora prontas para iluminação, tape o prato de cultura no teto da incubadora, garantindo que a superfície na parte inferior do prato seja transparente para iluminação abaixo pelo projetor.Após o crescimento durante a noite das amostras de biofilme, remova o prato de cultura da incubadora. O prato terá bactérias biofilmes presas à sua superfície inferior onde foi iluminada, bem como bactérias planctônicas dispersas na mídia líquida acima. Descarte as células planctônicas removendo a mídia líquida do prato de cultura.Em seguida, enxágüe a amostra duas vezes com PBS para remover as células planctônicas restantes, tubos suavemente em PBS, seguido de aspiração. Se as células estiverem marcadas fluorescentemente, a imagem direta das amostras usando microscopia de fluorescência. Como visto aqui, as bactérias pDawn-Ag43 foram usadas para gerar biofilmes padronizados em placas de poços de poliestireno com iluminação do projetor.Os biofilmes podem ser visualizados usando manchas violetas cristalinas ou, alternativamente, através de microscopia de fluorescência se usar bactérias fluorescentes. Amostras de biofilme fluorescente também podem ser imagens usando microscopia confocal para obter imagens do biofilme em 3D. A padronização de alta resolução é possível usando uma máscara fotográfica de filme para fornecer iluminação padronizada à amostra de biofilme.Exemplos de padronização em superfícies de vidro e PDMS, bem como câmaras de cultura PDMS fechadas, são mostrados aqui e ilustram os diferentes tipos de ambientes onde a padronização pDawn-Ag43 pode ser aplicada. Ao tentar este procedimento, é importante primeiro transformar pDawn-Ag43 em sua variedade de interesse, em seguida, concentrar e calibrar adequadamente seu projetor, e finalmente seguir a cultura necessária e passos de diluição para preparar suas bactérias para iluminação. Seguindo esse método, outras técnicas podem ser implantadas, por exemplo, monitorando o biofilme a longo prazo em diferentes condições culturais.Dessa forma, podemos entender como uma estrutura de biofilm afeta sua função. Essa técnica será amplamente aplicável, por exemplo, para a biologia sintética e pesquisa de materiais, para projetar biofilmes para diversas aplicações.

Research

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